Introduction
Al fine di generare un gran numero di cellule umane vitali e funzionali per il trapianto, la regolamentazione delle condizioni di coltura è imperativo. L'esaurimento delle sostanze nutritive, con accumulo di scorie metaboliche sono i principali contributori alla senescenza e metaboliche modifiche che riducono la qualità del prodotto cellulare 1 - 3. Questa procedura illustra un metodo per cellule di mammifero coltura in sferoidi usando un bioreattore agitata combinato con un sistema di alimentazione tasso di perfusione regolata per regolare il glucosio in un intervallo fisiologico 4 per tutta la durata della cultura. Ai fini di questi studi, l'intervallo fisiologico è stato definito come tra 100 e 200 mg / dl. Gli stessi metodi possono essere usati per regolare altri nutrienti e rifiuti metabolici come lattato.
culture statiche in piccoli volumi (1 - 30 ml) sono tipicamente utilizzati in ambiente di laboratorio per mantenere e differenziare le linee cellulari per experimefini ntale. Cellulare passaging viene eseguita con cambi completi medie come necessario ad intervalli regolari. Più terreno di coltura "convenzionale" ha una concentrazione di glucosio alto (450 mg / dl per DMEM utilizzato in questi studi) per consentire meno frequenti cambiamenti medi senza il rischio di limitazioni nutrizionali. Tuttavia, questo metodo batch alimentazione richiede ancora manipolazione frequente, introduce variabilità nell'ambiente cellulare, e aumenta il rischio di contaminazione 5 - 9. Bioreattori sospensione agitata (SSB) fornire una migliore miscelazione e diminuito movimentazione 3,10 - 20, ma, come le culture statiche, richiedono cambiamenti medi manuali che contribuiscono alle fluttuazioni potenzialmente dannosi nei livelli di prodotti nutrienti e rifiuti. Perfusione alimentazione di culture SSB riduce questi problemi infusione continua e la rimozione del mezzo, ma grandi cambiamenti nei livelli di nutrienti a causa della crescita delle cellule rimangono un problema. L'uso di un ra alimentazione adjustedte dai calcoli di uso di sostanze nutritive in base ai requisiti delle cellule stimato in grado di fornire l'ambiente cellulare stabile necessaria per ottimizzare la vitalità delle cellule e funzionare 21 - 24.
Vi è un grande corpo di letteratura che descrive i metodi per scalabili culture SSB di cellule di mammifero in particolare per la cultura e l'espansione delle cellule pluripotenti 25 - 32, con gli altri focalizzata su isolotto (beta), le cellule 17,33,34, o la produzione di prodotti biologici 24, 35 - 38. Molti di questi tipi di cellule indagati può essere coltivata nelle culture sferoidali, e procedure specifiche per il tipo di cella utilizzato dovrebbe essere ottimizzato prima di implementare un sistema di alimentazione continua. In questa dimostrazione, un metodo di alimentazione di perfusione è stato usato per espandere una linea cellulare beta cresciuto come sferoidi in un bioreattore agitato 39 -. 43 Il metodo qui descritto fornisce unsemplice implementazione di alimentazione adeguamenti tariffari sulla base di misure di glucosio off-line per ottenere condizioni di coltura mirati. Regolazione della velocità di avanzamento con questo metodo per mantenere un livello di glucosio fisiologica è indicata ai rendimenti delle cellule aumenta. Le cellule di mammiferi dipendono da un nutriente chiave, glucosio, per la produzione di energia, quindi l'uso di questa linea cellulare rappresenta un modello per molte cellule di mammifero in coltura 44. Inoltre, questa linea esemplifica l'ulteriore complessità delle cellule beta, che sono sensibili ad elevati livelli di glucosio croniche 45. Per questo studio, le cellule beta-TC6 sono stati autorizzati a formare sferoidi nella cultura per approssimare le dimensioni medie delle isole di Langerhans in vivo. Il sistema di bioreattore perfusione 17 - 19,21,46 con una velocità di avanzamento regolata al glucosio consumo, ha determinato il mantenimento di condizioni fisiologiche e rendimenti più elevati cellulari senza cambiamenti di viabilità.
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Protocol
1. Cell Line e manutenzione
- Ottenere cellule beta-TC6 (o altra linea cellulare di mammifero aderenti desiderato). In preparazione per lo studio, la cultura, il passaggio, e crioconservare le cellule secondo le istruzioni del fornitore.
2. Montare il sistema di alimentazione continua
NOTA: La progettazione del sistema di alimentazione continua del seguente metodo è basata su sistemi analoghi descritti in letteratura 17 - 19,21,47 - 49. Assemblaggio del sistema usato qui è descritto in dettaglio in una precedente pubblicazione 3.
- Raccogliere i componenti necessari per il sistema di alimentazione, che è costituito da cinque componenti principali: un serbatoio di media, pompa peristaltica, bioreattori mescolato, serbatoio dei rifiuti, e progettato su misura set di tubi / campionamento.
- Stabilire il serbatoio di media utilizzando una bottiglia da 1 L di vetro, il serbatoio rifiuti utilizzando una bottiglia di vetro 2 L, e il stirred bioreattore utilizzando un reattore di vetro del volume di 250 ml (off versione shelf).
- Utilizzare una pompa peristaltica digitale o pompa di simile con una testa pompa 8 canali per controllare mezzo di scambio.
- Fabbricazione del serbatoio e coperchi bioreattori modificati da plastica dura e autoclavabile con tubo di acciaio inox pass-through porte per fornire ventilazione attraverso filtri sterili, e consentire il mezzo di trasferimento tra i serbatoi e bioreattori. In alternativa, l'acquisto di coperchi specializzate con luci di flusso da vari fornitori.
NOTA: Il coperchio bioreattore può contenere ulteriori porte pass-through per la strumentazione e le sonde opzionali di monitoraggio (ad esempio un monitor di ossigeno). - Collegare un tubo di efflusso (OT) fabbricati con tubi di vetro di aerazione porosi con una gamma media dimensione dei pori di 40 micron a 60 micron e una densità dei pori di 40% al coperchio SSB modificato. In alternativa, scegliere un altro tubo di efflusso in base alle esigenze specifiche della cultura.
NOTA: Scegliere ilDimensione dei pori OT per rimuovere solo medio e detriti cellulari, lasciando aggregati di cellule in coltura (come descritto nella sezione 6 e la pubblicazione 3 per maggiori dettagli).
- Montare set di tubi perfusione autoclave da fluoruro di polivinile (PVDF) connettori tubi e durevole tubo della pompa peristaltica. La lunghezza della sezione dipende dalla distanza tra i vari componenti.
NOTA: Prestare particolare attenzione nella scelta di varietà tubi per garantire la durata e l'affidabilità per esperimenti a lungo termine. - Montare il set di tubi da tre parti: una linea di alimentazione, una linea di scarico, e una linea di campionamento.
- Montare la linea di alimentazione utilizzando due diametri dei tubi (L / S 14 e L / S 13). Utilizzare il L / S 14 per il tubo principale che si estenderà la distanza dal bioreattore al serbatoio media, e inserire una breve lunghezza L / S 13 nel mezzo della lunghezza del tubo per la sezione pompa utilizzando gli adattatori PVDF appropriate.
- Utilizzare standard PVDF tubo-spinato tubiadattatori ng per unire due pezzi di L / S 14 tubi su entrambi i lati della sezione della pompa più corta (L / S 13) tubazione.
NOTA: In alternativa, l'intera lunghezza del tubo potrebbe essere più piccolo diametro L / S 13 tubi, e l'intera lunghezza del tubo potrebbe essere sostituito quando l'integrità pompa sezione è in questione.
- Montare la seconda sezione tubi per la rimozione dei rifiuti con diametro maggiore tubazione (L / S 16) ed inserire un breve tratto di L / S 14 tubi nel mezzo della sezione di pompaggio. Ciò avviene nello stesso modo come la linea di alimentazione assembly utilizzando adattatori manichetta-spinato PVDF, o in alternativa con un tratto continuo di dimensioni tubazione della pompa desiderata, e sostituendo come necessario.
NOTA: Se la stessa pompa e la testa della pompa sono utilizzati per il circuito di alimentazione e il circuito di rifiuti, la sezione della pompa delle linee tubi di rimozione dei rifiuti deve essere un diametro maggiore rispetto alla sezione della pompa della linea di alimentazione. Ciò garantisce che la velocità della pompa rimozione è più veloce della velocità di avanzamento, ed eviterà il potenteIAL per grandi variazioni di volume coltura, e ridurre il rischio di trabocco. - Montare il componente finale del set di tubi: un gruppo di raccolta del campione.
- Questa procedura descrive una consuetudine assemblato sistema portuale di campionamento; In alternativa, una porta di campionamento sterile può essere acquistato da vari fornitori.
- Costruire il set da tre brevi (~ 6 cm) L / S 14 tubazione lunghezze collegati insieme con un connettore PVDF tipo T, e due piccole fascette sui due tratti di tubo.
- Collegare un filtro gas sterile per lo sfiato del gas ad una delle lunghezze serrati, e l'altro è usato per il collegamento ad una siringa campionamento sterile (filtri gas sterili possono devono essere aggiunti in un armadio biosicurezza dopo la sterilizzazione come molti filtri sterili non sono autoclavabile).
- Collegare la terza estremità ad un connettore campione di acciaio inossidabile attaccata sul coperchio del bioreattore.
- Autoclave il gruppo di campionamento, mentre collegato al bioreattore prima di iniziarel'esperimento (fare riferimento al punto 3).
- Utilizzare questa assemblea per raccogliere campioni sterili dal bioreattore, se necessario, senza disturbare il processo di alimentazione continua.
3. Autoclave Tutti i Materiali
- Preparare tutti i componenti bioreattori per la sterilizzazione in autoclave.
- Raccogliere singoli componenti per la sterilizzazione. Medie e rifiuti serbatoi (assemblato dal punto 2.1.1), pallone filatore 250 ml (assemblato da 2.1.1), necessari coperchi modificati (assemblati da 2.1.3), tubo di efflusso (descritto nel 2.1.4), tre set di tubi ( assemblati in sezioni 2.2 through2.5), tubo di efflusso (come necessario per l'alimentazione continua).
- Assemblare pallone filatore con tutti i componenti e assicurarsi che il tubo di efflusso è saldamente fissato all'interno del pallone filatore (descritto nella sezione 2.1.4), e fissare la porta personalizzata assemblato campionamento (punto 2.5), o altra porta di campionamento per la parte superiore del coperchio .
- Avvolgere l'intero gruppo pallone filatore con l'automateriale clave involucro, e in autoclave indicando nastro. Assicurarsi che l'involucro a tenuta d'aria. NOTA: Foglio di alluminio o materiale simile possono essere utilizzati per coprire le singole estremità di ciascuna porta di accesso nel coperchio bioreattore di preservare la sterilità del connettore / termina quando non imballato e quando non collegato ai set di tubi all'interno dell'incubatrice.
- Montare i coperchi dei serbatoi modificati medie e dei rifiuti e quindi collegare ai rispettivi bottiglie di vetro. Coprirli con un foglio di alluminio e autoclave indicando nastro.
- avvolgere individualmente i set di tubi (sezione 2,2-2,5) con involucro di autoclave e nastro per aiutare a montaggio finale. Foglio di alluminio o materiale simile può essere usato per avvolgere le singole estremità di ciascun set di tubi per preservare la sterilità del connettore / termina quando scartare.
- Autoclavare tutti gli elementi avvolti con un ciclo di autoclave a secco standard (ad esempio, "Gravity" impostazione con ~ 15 psi a 121 ° C per 30 minuti o più).
NOTA: Non collegare sterilefiltri prima di sterilizzazione in autoclave a meno che non siano confermati per essere sicuri autoclave.
4. Formazione Spheroid
NOTA: Questa tecnica è simile a quelle descritte in letteratura 17 - 19,21,50 - 52 per le altre colture di cellule di mammifero. Tutte le procedure seguenti sterilizzazione dovrebbe essere fatto in una cappa a flusso laminare e utilizzando guanti sterili per mantenere condizioni sterili per colture cellulari.
- Per tutte le condizioni, la cultura ed espandere cellule β-TC6 nelle culture aderenti standard (descritti dal produttore) fino a quando le quantità di cellule sufficienti si ottengono per seminare il numero desiderato di bioreattori.
- Assemblare il bioreattore alimentazione continua con tubo di efflusso, come mostrato nella figura 1 e descritto nel capitolo 2, e collegare la porta di campionamento coperchio campionamento. NOTA: Il tubo di deflusso e l'assemblaggio porta di campionamento devono essere aggiunti alla bioreacto per l'alimentazione in continuo prima della formazione sferoide, e deve essere tirato fuori dal terreno di coltura fino all'avvio alimentazione continua.
- Sterilizzare l'assemblaggio SSB modificato in autoclave (descritto nella sezione 3).
- Fissare sfiati sterili (0,22 micron o più piccoli filtri sterili) nelle posizioni appropriate sui coperchi del pallone filatore, e le imbarcazioni di medie e rifiuti.
NOTA: Questo è importante per prevenire serratura di vapore, e per permettere lo scambio di gas tra l'incubatore (2 CO 5%) ambiente e il bioreattore. Lo scambio di gas è necessario per mantenere il pH corretto quando si utilizzano supporti bicarbonato tamponata.
- Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione delicato usando 0,25% (w / v) Trypsin- 0.53 mM EDTA, a temperatura ambiente aiutato mediante agitazione meccanica per 2 - 3 min, e sementi in bioreattori ad una densità di circa 1,3 x 10 6 cellule / ml in 200 ml di terreno di coltura.
- Spostare fiaschi designati fuori dell'incubatore ein un armadio di biosicurezza.
Nota: Tutte le colture cellulari e manipolazioni dovrebbe essere fatto in un armadio Bio-sicurezza utilizzando una corretta tecnica sterile. - Togliere terreno di coltura da fiaschi aspirando.
- Lavare le cellule pipettando 5 ml di tampone fosfato (senza Ca ++ e Mg ++), nel pallone, e risciacquo attraverso le cellule sulla superficie, e quindi aspirare il PBS.
- Aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina-EDTA per ogni pallone che sarà incassato (in genere circa 10x 175 centimetri 2 T-palloni).
- Consentono alle cellule raccolte di incubare a temperatura ambiente per 2 - 3 minuti in armadietto biosicurezza.
- Agitare delicatamente a mano per allentare le cellule dalla superficie pallone e raccogliere cellule aggiungendo 6 ml di terreno di coltura (con siero) al pallone, e trasferire le cellule a un tubo da 50 ml. Quando uno tubo da 50 ml è pieno, utilizzare un altro tubo 50 ml fino a quando tutte le celle necessarie sono state raccolte (circa una provetta da 50 ml sarà necessario per ogni 5 T-175 palloniraccolto).
- Delicatamente centrifuga (circa 50 x gravità) le sospensioni cellulari raccolti per agglomerare le cellule.
- Aspirare il terreno rimanente lasciando intatto il pellet.
- Raccogliere tutte le celle in un singolo tubo da ri-sospensione il pellet in terreno di coltura (contenente siero) con una pipetta, e trasferimento di tutti pellets nel tubo stesso.
- Contare la densità cellulare utilizzando un emocitometro standard trypan colorazione blu come descritto in letteratura 53.
- Aggiungere il numero desiderato di cellule totali di sterile SSB per ogni condizione (1,3 x 10 6 cellule / ml era le densità di cellule di partenza mirate per questa dimostrazione).
- Aggiungere mezzo (con la concentrazione di glucosio desiderata, in questo caso abbiamo utilizzato livelli medi di glucosio all'interno della gamma fisiologica) per SSB con una pipetta per raggiungere il volume coltura totale desiderata (volume di 200 ml coltura viene utilizzato per questi studi).
NOTA: Per queste Fed continua SSB studia il cu ltures state seminate utilizzando una versione modificata "low-glucosio" nel terreno di coltura (100 mg / dl). Questo ha permesso le culture per iniziare alla concentrazione di glucosio porta piuttosto che iniziano con un medium "high-glucosio" e in attesa del consumo di glucosio per portare i livelli di glucosio giù nel range fisiologico per avviare l'alimentazione. Tutto altro mezzo per alimentare in questi studi utilizzato lo standard "high-glucosio" medium (500 mg / dl). - Spostare SSB con le cellule di un piatto mescolare all'interno di un incubatore di coltura cellulare.
- Spostare fiaschi designati fuori dell'incubatore ein un armadio di biosicurezza.
- Cellule di coltura in bioreattori senza alimentazione per 3 giorni a 37 ° C, con il 5% di CO 2, 100% di umidità relativa, e un tasso di agitazione di 70 giri al minuto per consentire sferoidi alla forma.
NOTA: Non proliferazione significativo deve essere osservato durante il periodo di formazione sferoide di tre giorni. - Dopo la formazione sferoide, dividere sferoidi tra bioreattori con condizioni di coltura desiderati.
- Autoclave o gas sterilizzare tutti i componenti e assemblare in un armadio di sicurezza biologica usando tecniche sterili (punti 2 - 4).
- Dopo la formazione sferoide, rimuovere la SSB dal termostato e assemblare i componenti per il sistema di alimentazione continua in cabina di sicurezza biologica.
- Prima riempire il serbatoio mezzo fresco con il terreno di coltura desiderato, e quindi connettersi a un lato della linea di alimentazione. Inoltre garantire che il serbatoio fresco mezzo è correttamente ventilato con un filtro sterile.
- Collegate un lato della linea di alimentazione alla porta di ingresso di alimentazione sul bioreattore in modo sterile. Un filtro sterile deve essere installato tra la linea di alimentazione e la luce di entrata bioreattore per filtrare il mezzo prima che entri nel bioreattore.
- Collegare la linea di scarto al tubo bioreattore deflusso e il serbatoio rifiuti di media, e assicurarsi che il serbatoio rifiuti siano adeguatamente ventilato con una sterilee filtro.
- Spostare il gruppo fuori dalla cappa di sicurezza biologica (questo richiederà probabilmente due persone per trasportare tutte le navi e tubi), e mettere tutti i componenti per la cultura a lungo termine.
- Mettere SSB sul piatto mescolare all'interno dell'incubatore utilizzando gli stessi parametri di coltura per la formazione sferoidale (37 ° C, 5% CO 2, 100% di umidità e 70 rpm). NOTA: Può essere necessario scollegare temporaneamente i segmenti tubo dal bioreattore se le linee devono eseguire fori passanti nel lato dell'incubatore piuttosto che attraverso la guarnizione della porta. Questo può essere fatto in modo asettico avvolgendo le estremità dei set di tubi con foglio di alluminio prima della sterilizzazione in autoclave (fase 3), e in attesa di collegare il lato bioreattore delle sezioni di alimentazione e tubo di scarico fino al bioreattore è all'interno dell'incubatrice. Le linee di tubi possono essere messe in atto, e il foglio di alluminio possono essere rimossi all'interno dell'incubatore e rapidamente attaccato al bioreattore.
- Eseguire le estremità rimanenti del set di tubi (quelle non collegate al coperchio bioreattore) attraverso la porta di accesso incubatore (pass-through), o attraverso un incavo nella guarnizione della porta dell'incubatore.
- Fuori dell'incubatore (in un armadio biosicurezza vicina), collegare rapidamente la linea di alimentazione al serbatoio fresca media, e la linea di scarto al serbatoio rifiuti medie e assicurarsi che il serbatoio rifiuti è correttamente ventilato con un filtro sterile. NOTA: Per fare questo in maniera asettica, rimuovere il foglio di alluminio dai connettori tubi e dei vasi e collegare ai rispettivi vasi più rapidamente possibile (soprattutto se questa connessione deve essere fatto al di fuori dell'armadio biosicurezza).
- Mettere serbatoio terreno fresco (riempito con il mezzo di alimentazione desiderata) all'interno vicina mini-frigorifero. Verificare che le linee di alimentazione e di scarico sono in grado di uscire dalla incubatore e immettere il frigorifero senza impedire che le porte di ciascun dalla chiusura. E 'anche fondamentale che il feed lInes non vengano schiacciati chiuse da porte di entrambi frigorifero o l'incubatore.
NOTA: Il mezzo utilizzato per questi studi è stato il terreno di coltura standard elevati di glucosio (500 mg / dl) consigliata dal fornitore di questo tipo di cellule. Qualsiasi medio alto glucosio potrebbe essere utilizzato in base alle esigenze specifiche del tipo di cellule in coltura. La concentrazione di glucosio del mezzo di alimentazione deve essere ragionevolmente superiore (2x o più) rispetto alla concentrazione desiderata nella cultura come il sistema di alimentazione si basa sull'aumento della velocità di avanzamento del medio alto glucosio per mantenere adeguati livelli di glucosio nelle culture pur mantenendo velocità di avanzamento ragionevoli . - Successivamente, il serbatoio mezzo di rifiuti può essere messo sul banco all'esterno dell'incubatrice in una posizione comoda.
- Quindi, posizionare la sezione "pompa" dei mangimi e rifiuti righe nella testa della pompa per garantire il corretto orientamento in modo che le linee di alimentazione saranno pompa del mezzo dal serbatoio mezzo fresco in SSB, e le linee di scaricopomperà terreno dalla SSB e al serbatoio mezzo rifiuti.
- Accendere la pompa alla velocità di avanzamento desiderata.
- Calcolare la velocità di alimentazione utilizzando l'equazione avanzamento adjusted descritto in letteratura 3 e nella sezione fornito risultati rappresentativi di seguito.
- Utilizzare le informazioni più recenti conta delle cellule (procedura descritta al punto 5) insieme con la previsione di crescita, e le misurazioni del glucosio medio per stimare la velocità di avanzamento necessaria per mantenere la concentrazione di glucosio desiderato nella cultura.
NOTA: dovranno essere ottenuto prima di fare queste procedure I tassi di crescita delle cellule e dei tassi di consumo di glucosio. - Impostare la velocità della pompa in base alla velocità di avanzamento calcolato.
- Ripetere il calcolo avanzamento e regolare la velocità della pompa per ciascun punto di campionamento (ogni tre giorni per il metodo descritto).
6. conteggi delle cellule, vitalità, e glucosio Concentrazione Misure
<ol>- Lasciando la SSB alimentato in continuo all'interno del bioreattore, collegare una siringa sterile (5 ml volume della siringa è stato usato per questi studi) alla connessione non filtrata del porto campionamento.
- Spostare il tubo di campionamento giù nel mezzo di coltura.
- Sganciare la sezione del tubo che va alla siringa, e prelevare il volume del campione totale desiderata.
- Spostare il campionamento con tubo in modo che esso non è immerso nella cultura, e continuare a ritirare la siringa finché l'aria viene rimossa.
- Fissare il tubo che alimenta la siringa, e staccare la siringa contenente il campione, e mettere da parte.
- Pre-caricare una seconda siringa sterile fresco con l'aria, e allegare al lato filtro sterile del porto di campionamento.
- Sganciare il tubo che va al lato della siringa-filtrola presa di campionamento, e quindi spurgare il porto campionamento espellendo delicatamente l'aria nella siringa attraverso il filtro sterile. Questo assicura che la porta di campionamento sarà chiara di qualsiasi quantità residua.
- Re-fissare il tubo che va al filtro, staccare la siringa sterile e scartarla.
- Aggiungere mezzo (con siero) peril campione per la diluizione, se necessario.
- Contare le cellule, e calcolare la vitalità cellulare registrando cellule vive (non colorati), e (tinto), le cellule morte in modo indipendente (vitalità% = cellule vive / cellule totali).
- Prendere le misure del glucosio, come descritto nelle istruzioni misuratore di glucosio sostituendo il terreno di coltura per il sangue.
- Immergere la striscia nel mezzo da testare (raccolti da campioni di conteggio di cui sopra), e ripetere per il numero desiderato di repliche (si consigliano tre repliche).
- Testare sia il mezzo fresco e medio rifiuti per le concentrazioni di glucosio.
NOTA: per alcuni metri, misurazioni inferiore a 20 mg / dl (soglia rilevabile del contatore), possono essere osservate come errore nell'output metro.
7. sferoide assestamento misure di frequenza
- Per garantire che cell cluster non vengono rimossi dal sistema di alimentazione continua, misurare il tasso di sedimentazione degli sferoidi beta-TC6 osservando il loro sedimentazione in un grande pipetta di plastica diametro.
- cellule Culture beta-TC6 in bioreattori SSB per formare sferoidi come descritto sopra.
- Dopo 3 giorni di cultura, prendere 30 ml campioni della sospensione sferoide e mettere in un tubo da 50 ml.
- Delicatamente pipettare su e giù utilizzando un'ampia pipetta diametro 25 ml di distribuire uniformemente in sospensione, quindi arrestare pipettaggio con la sospensione ad un livello noto nella pipetta (ad esempio, 20 ml marchio), e quindi registrare il tempo per tutti gli sferoidi di stabilirsi 5 cm.
- Ripetere questa procedura abbastanza volte per raggiungere confidenza statistica (di solito n> 3).
NOTA: Per gli studi biologici, valore di p inferiore a 0,05 è considerato statisticamente significativo quando si confrontano le misurazioni. L'errore standard della media è stato utilizzato per gli errori di segnalazione, e le due coda t di Student test di non-accoppiatoè stato utilizzato per confrontare le condizioni per i dati presentati.
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Representative Results
I livelli di glucosio medio e fluttuazioni Limitare cellulare espansione in Culture standard SSB
I livelli di glucosio fluttuano nelle culture statiche e culture SSB per tutto il periodo di coltura 3. Queste fluttuazioni intensificano con l'aumentare il numero delle cellule durante il periodo di coltura di 21 giorni ed erano quasi identici in entrambe le culture statiche e SSB. Queste osservazioni sono presentati nella nostra precedente pubblicazione 3. I livelli di glucosio possono essere super-fisiologico per la durata del periodo di coltura per entrambi i metodi. Poiché questa esposizione cronica può inibire la crescita delle cellule 54, un sistema di alimentazione continua è stato sviluppato per eliminare le fluttuazioni di glucosio e di migliorare il controllo dei nutrienti durante la coltura sferoide.
Continuo Sistema di alimentazione per la Cultura Spheroid
Continuamente aggiungendo mezzo fresco e rimuovendo vecchia medie per la durata del periodo di colturapuò essere realizzato utilizzando un semplice sistema di rifornimento medie. Il sistema descritto nel metodo 2 e mostrata in figura 1 utilizza una pompa e set di tubi per rifornire continuamente mezzo e un tubo di efflusso separato per eliminare in modo continuo supporto evitando la rimozione di sferoidi dalla cultura. L'ingresso mezzo era sul lato opposto del reattore per minimizzare qualsiasi possibilità di interferire con il corretto funzionamento del OT, e consentire una completa miscelazione. terreno fresco (con glucosio, 450 mg / dl) è stata mantenuta a temperatura di frigorifero per assicurare la stabilità a lungo termine e continuamente aggiunto alla coltura attraverso un ingresso media con un tasso di sostituzione medio completo ogni tre giorni per ricostituire le sostanze nutritive. Questo sistema limita le manipolazioni e gli interventi richiesti durante il periodo di coltura sostituendo il processo di sostituzione medio gruppo manuale con un processo continuo 3,22,23. Il mezzo freddo è entrato nel bioreattore in piccoli volumi oltre time (0,046 ml / min) rispetto al volume totale coltura (200 ml), dando ogni "drop" aggiunto tempo medio per equilibrare la temperatura con il terreno di coltura circostante che era a 37 ° C. Ciò ha garantito che il mezzo freddo aggiunto non ha ridotto la temperatura generale della cultura è mantenuta all'interno dell'incubatrice. Agitazione del mezzo di coltura è aumentato anche l'efficienza di trasferimento di calore, e migliorata uniformità di temperatura in queste culture. mantenimento della temperatura potrebbe essere un problema se ad altissima velocità di avanzamento sono stati utilizzati con piccoli volumi di coltura, ma queste condizioni improbabili non sono stati testati per questi studi. Il volume coltura è stata mantenuta a un livello costante nel sistema di alimentazione continua assicurando che il tasso medio medio rimozione è uguale al tasso di alimentazione. Il sistema utilizzato per questi studi effettivamente rimossi mezzo ad una portata superiore alla velocità di avanzamento perché la sezione tubo rimozione usato grande tubo di diametro per la sezione della pompa. Nonostante il remo più velocetasso val, il volume coltura è stata mantenuta regolando il livello del tubo di efflusso all'interno del reattore al livello di volume desiderato coltura. Continuamente aggiungendo mezzo fresco al SSB determinato un piccolo aumento del livello medio nel reattore, e quando il mezzo ha raggiunto il livello di OT, mezzo è stato rimosso dal reattore ad una velocità maggiore. Il mezzo è stato rimosso attraverso il vetro poroso OT, lasciando gli sferoidi di cellule in coltura fino a che il livello medio è sceso sotto il fondo del OT. Questo sistema evita la complessità di utilizzo di sensori di flusso e volume tenui per controllare la velocità della pompa, ed è lo standard per l'utilizzo con apparecchiature cultura basata molti SSB 47,48. L'OT è stato progettato per garantire che sferoidi non sono stati rimossi dalla coltura attraverso il circuito di rimozione, e la dimensione dei pori e la densità nel tubo di vetro sinterizzato erano abbastanza grande (40% e 40 - 60 micron rispettivamente) per assicurare che la velocità di flusso lineare era inferiore al tasso di sedimentazione degli sferoidi degli Stati UnitiED per questi studi di cultura. Il flusso lineare è stata calcolata come descritto in dettaglio 3. La velocità media lineare media attraverso i pori della OT è stato calcolato in 0,17 centimetri / min e questo è stato di gran lunga più lento del lento tasso di sedimentazione osservato sferoide. La velocità media di sedimentazione è stata misurata come descritto nel metodo 7 ed era 2,53 ± 0,26 centimetri / min per sferoidi utilizzati in questi studi. Sono stati osservati i sferoidi ad aumentare di dimensioni come la cultura progredisce, e questi sferoidi grandi stabilirono più velocemente a causa loro maggiore rapporto massa-resistenza, che è diminuito ulteriormente la possibilità di rimozione attraverso l'OT. Alcuni sferoidi sono rimasti intrappolati nei pori inferiori sui bordi esterni del OT, ma questo era dovuto principalmente alla collisione meccanico quando il tubo di efflusso immerge nel mezzo agitato. Questo non ha impedito il corretto funzionamento del OT, e non ha contribuito ad una perdita misurabile di sferoidi nelle culture testati. L'OT per questi studi è stato pulito dopo ogni studio, (con DI filo d'acqua), e sostituito dopo l'uso per due studi della cultura al fine di evitare il rischio di ridotta funzionalità. L'OT potrebbe essere sostituito dopo ogni studio se vengono rispettate sferoidi ad ostruire i pori durante uno studio specifico (questo non è stato osservato nel lavoro presentato). A causa della rimozione ciclica di supporto tramite questo metodo, il volume di coltura oscillato di ben il 6%. Le fluttuazioni sono stati causati dalla tensione superficiale del mezzo che ha permesso l'OT rimuovere un po 'più mezzo dopo che il livello medio medio è sceso al di sotto del fondo del OT.
Eliminando fluttuazioni nutrienti migliorare la crescita cellulare in Culture SSB
Continuamente sostituendo il mezzo nelle culture SSB utilizzando il sistema sopra descritto aumento delle rese coltura durante il periodo di coltura di 21 giorni rispetto ai normali culture SSB. La velocità di alimentazione è stata mantenuta costante per tutto il periodo di coltura ad una velocità che ha sostituito l'intero volu culturame ogni tre giorni per essere paragonabile alle culture SSB batch alimentato. Eliminando le fluttuazioni nutrizionali comportato un aumento delle rese di cellule (Figura 3), nonostante l'elevata concentrazione di glucosio 3. Dimensioni Spheroid stato anche misurato al termine del periodo di coltura da 2D valutazione microscopica (microscopia ottica standard descritto in letteratura 3), e gli sferoidi nelle culture CF-SSB erano significativamente più grande (p <0.02, student-t test) che in statica o culture standard di SSB, come riportato in letteratura 3. Queste osservazioni supportano i dati celle-count che suggeriscono un tasso di crescita più elevato nelle culture CF-SSB, mentre la viabilità è stata mantenuta allo stesso livello elevato (96,23 ± 0,85%) a prescindere dalla condizione di cultura. La SSB continuamente alimentato (CF-SSB) sistema di coltura eliminato le fluttuazioni dei nutrienti nelle culture sferoidali, e migliorato i tassi di crescita delle cellule, ma i livelli di glucosio è rimasto super-fisiologiche che possono aver impedito ancora di più imp rovement in espansione di cellule (Figura 2). Per migliorare ulteriormente il sistema di coltura CF-SSB, un algoritmo è stato utilizzato per regolare la velocità di avanzamento durante il periodo di coltura con l'obiettivo di migliorare il controllo dei livelli di glucosio in culture SSB.
Calcolo dei rettificato Avanzamento
Diversi fattori possono essere considerati per il calcolo della velocità di avanzamento per mantenere i livelli di glucosio costanti. I fattori specifici di interesse possono essere alterati per un dato studio e per una specifica linea cellulare. Ai fini di questa dimostrazione, abbiamo considerato tasso di crescita e il consumo di glucosio determinato dalle colture precedenti, così come i livelli di glucosio effettivi al momento della regolazione 3. aggiustamenti del tasso di alimentazione possono essere effettuate in qualsiasi intervallo di tempo. Per questa dimostrazione, i campioni sono stati raccolti e la velocità di avanzamento è stato adeguato ogni tre giorni sulla base dei calcoli sequenziali descritti come segue.
t "> Calcolo del tasso di crescita previstaEquazione 1 prevede la crescita cellulare durante un certo periodo di coltura, con il numero di celle predetto (N 2) che rappresenta il numero totale previsto di cellule in coltura a un certo momento nel futuro. Questo metodo utilizza un tasso di crescita approssimazione lineare in cui viene aggiunto il conteggio cella corrente (N 1) al tasso di crescita stimato di cellule in colture sferoidali (R g) moltiplicato per il periodo di coltura (t 2 -t 1).
(1)
Calcolato Avanzamento Baseline
L'avanzamento della linea di base (R F) è stato calcolato usando l'equazione 2 stimando glucosio consumato nella cultura durante il periodo di coltura (numeratore) e dividendolo per la concentrazione di glucosio nel mezzo di alimentazione (C F 1) per la media ponderata di N 1 e N 2 dall'equazione 1. Questo tasso di consumo è stata poi divisa per la concentrazione di glucosio (C F) nel mezzo di alimentazione per calcolare il tasso medio di avanzamento medio necessario per sostituire il glucosio consumato durante lo stesso periodo di coltura.
(2)
Regolazione velocità di avanzamento con livelli di glucosio osservati
Ulteriori aggiustamenti sono stati fatti per la velocità di avanzamento della linea di base per ospitare i livelli di glucosio misurati (C 1) al punto di tempo scelto usando l'equazione 3. Questa velocità di avanzamento del glucosio-adjusted (GAFR) può essere utilizzato per mantenere i livelli di quando cambiamenti inaspettati nella crescita o la morte verificarsi nella cultura. Questo equatio n incorporato un controllo costante (X), e un valore di 0,5 è stato utilizzato per questi dati 3. C 1 rappresenta la concentrazione di glucosio misurata nel terreno di coltura il giorno campione e C D rappresenta la porta media concentrazione di glucosio. Il valore finale regola la velocità di avanzamento previsto dal secondo calcolo.
(3)
Figura 1: Schema continuo di alimentazione del sistema con Deflusso Tube. (A) Schema del sistema dimostrata. (B) filtro di vetro sinterizzato posto sul tubo di efflusso per consentire medio essere rimosso dalla cultura senza perdita di cellule. Figura riprodotto su autorizzazione. 3
/files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
Figura 2:. Misure glucosio per SSB, CF-SSB, e rettificato Culture CF-SSB (A) misurazioni del glucosio medie provenienti da culture sferoide beta-TC6 utilizzando, SSB, e CF-SSB metodi di coltura statici e alimentazione con medio alte concentrazioni di glucosio normale. L'alimentazione continua è in grado di eliminare le fluttuazioni del glucosio, ma i livelli medi di glucosio nel cambiamento medio drammaticamente durante il periodo di coltura, e molto al di sopra della gamma fisiologica (indicato dalla barra grigia). L'alimentazione corretta è in grado di eliminare le fluttuazioni e mantenere le concentrazioni di glucosio vicino livelli fisiologici per la durata del periodo di coltura. Le barre di errore per le misurazioni del glucosio sono troppo piccoli per essere visibili sulla scala mostrato (Errore standard ≤ 4% per tutte le misurazioni). I dati delle figure è presentato in precedente pubblicazione con il permesso. 3
Figura 3: la conta delle cellule da SSB, CF-SSB, e rettificato Culture CF-SSB con una crescita rettificato recenti tassi di crescita cellulare segnalato come cambiamento volte del numero di cellule durante il periodo di coltura di 21 giorni a confronto SSB con regolari cambi medi contro velocità di avanzamento costante. culture SSB e velocità di avanzamento regolata culture SSB. Le barre di errore segnalano l'errore standard della media, e p-valori riportati sono per un test statistico non-accoppiato a due code t di Student. Riprodotto su autorizzazione. 3
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Discussion
Generazione di prodotti cellulari di mammiferi per la produzione di agenti biologici e terapie cellulari richiede la cultura e monitoraggio di cellule di mammifero in grande scala 55 - 58. Inoltre, queste applicazioni richiedono condizioni di coltura definite e validate. Semplicemente aumentando il volume delle cellule che utilizzano tecnologie di ricerca non si incontreranno tutti questi requisiti. variazioni medie manuali provocando fluttuazioni di sostanze nutritive e l'accumulo di prodotti di scarto riducono la qualità delle cellule, la vitalità e la resa. L'uso di bioreattori è ben consolidata per la coltura di microrganismi commerciale per applicazioni biofarmaceutiche e strategie simili sono stati applicati a colture di cellule di mammifero. La complessa interazione di cellule di mammifero con il loro ambiente richiede modifiche specifiche per regolare i livelli di nutrienti per ottimizzare potenziale espansione delle cellule.
Per affrontare questi problemi, abbiamo sviluppato un straightfoMetodo rward per mantenere i livelli di glucosio in un intervallo mirata specifica, approssimando i livelli fisiologici in un bioreattore sospensione agitata con un meccanismo di alimentazione della perfusione a tasso variabile. Per fare questo, sferoidi di una linea di cellule beta sono stati generati in un bioreattore sospensione agitata. Un sistema di alimentazione di perfusione è stato impiegato per fornire un meccanismo di alimentazione continua di sostituire procedure alimentari lotto standard. sono stati osservati tassi di crescita delle cellule, e utilizzati per prevedere prezzi di orientamento utilizzare il glucosio. livelli di glucosio effettivi anche stati misurati nel tempo in coltura per regolare la velocità di avanzamento in risposta ai nutrienti effettivamente consumata e prodotti metabolici depositati nel terreno dalle cellule. Questo metodo ha impedito le fluttuazioni dei livelli di glucosio visti con altri sistemi statici e SSB 3 in cui i livelli di glucosio forti oscillazioni drammaticamente con i cambiamenti di media ogni 3 giorni. Utilizzando le strategie batch di alimentazione, le concentrazioni di glucosio è sceso fino a 275 mg / dl nell'arco di tre giorni, in fase avanzatas nell'espansione 21 giorni. Queste fluttuazioni dei livelli di glucosio limitato rendimento delle cellule.
Calcolo del tasso di sostituzione medio per la dimostrazione del sistema di alimentazione regolata incorporato un tasso di crescita stabilito e tasso di consumo di glucosio per la linea cellulare, così come le osservate (misurati) densità di coltura e livelli di glucosio in ogni time-point alimentazione. Per i diversi tipi di cellule, o per più sistemi di coltura dei tessuti complessi, queste ipotesi non possono valere. Per garantire un controllo più accurato del glucosio, l'algoritmo include anche un sistema di controllo di feedback per tenere conto della variabilità delle singole culture. Limitazioni di un metodo di perfusione in base al tasso di crescita da sola, tra cui l'impatto di eterogeneità nella utilizzazione del glucosio per le cellule in tutto il sferoidi e cambiamenti nel consumo di glucosio sulla base di parametri quali le cellule staminali di differenziazione, possono essere mitigati da un sistema di controllo di feedback. A seconda dell'applicazione, le cellule che presentano Exponetassi di crescita ntial o profili di crescita più complesse potrebbero essere attuate per migliorare le prestazioni dell'algoritmo. Le ipotesi ei valori utilizzati per il calcolo del tasso di alimentazione può essere modificato per aderire alle effettive condizioni di coltura.
I metodi presentati sono destinati a produrre cellule per una applicazione terapeutica in cui l'espansione e la cultura di sferoidi sarebbe per una durata finita, e le cellule stesse sono il prodotto .. può essere desiderabile per alcuni ricercatori per espandere continuamente o cellule di coltura usando un metodo simile, ma presenterebbe altre sfide non riscontrati per questi studi. Se coltivate per lunghi periodi, gli sferoidi continuerebbero a crescere in termini di dimensioni, e la vitalità di alcune cellule nel nucleo dello sferoide possono soffrire a causa della crescente limitazioni di nutrienti e di diffusione di ossigeno. Queste culture possono richiedere ulteriori manipolazioni di dissociarsi grandi sferoidi per evitare questa limitazione quando le colture a lungo termine sono desiderati.Nessuna diminuzione della vitalità è stato osservato per sferoidi generate con questo protocollo, suggerendo che questo limite non è stato raggiunto durante il periodo di coltura di 21 giorni di questo studio.
Per le terapie cellulari, queste tecniche potrebbero essere utilizzati in combinazione con sistemi di regolamentazione supplementari per migliorare la resa delle cellule, la funzione e la vitalità. Ad esempio, il metodo SSB potrebbe essere combinata con tecnologie facilitano compresi culture superficie micro-carrier per cellule aderenti per migliorare i tassi di crescita cellulare, o incapsulamento di cellule o sferoidi. Inoltre, gli algoritmi di regolazione più complessi potrebbero essere implementati per fornire un controllo più stretto della cultura. Regolazione alimentazione potrebbe essere combinato con il controllo di diversi altri parametri, quali pH, concentrazione di ossigeno disciolto, temperatura, e l'iniezione di reagenti per effettuare ulteriori miglioramenti 59,60. Per migliorare i risultati in altre applicazioni, questo metodo potrebbe essere automatizzato 15,24, e velocità di avanzamento può essere calcolato more o meno spesso, ulteriori condizioni di coltura di raffinazione.
Processi di produzione 61-63 deve essere definito e attentamente controllato per rendere i prodotti biologici riproducibili. L'uso di una continua sostituzione mezzo può essere utilizzato per attenuare fluttuazioni nutrienti essenziali osservati in produzione su larga scala di cellule, e che incorpora un sistema di alimentazione regolabile può implementare un maggiore controllo sull'ambiente cellule, per mantenere i livelli di nutrienti desiderati. Il metodo descritto può essere utilizzato con altre cellule di mammifero per entrambi i prodotti cellulari e farmaceutici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β TC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
| DPBS No Ca, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
| DMEM High Glucose (500 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
| DMEM Low Glucose (100 mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
| L-glutamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
| Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco - Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
| T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
| NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used. | |
| Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
| Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
| 1 L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
| 2 L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
| 250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
| Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
| Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
| FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
| Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
| Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
| Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
| Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below. | |
| Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
| PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
| Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
| Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
| 25 ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
| Trypan Blue | Gibco - Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
| Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
| One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer) |
| One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer) |
References
- Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
- Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
- Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
- Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
- Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
- Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
- Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
- Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
- Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
- Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
- Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
- Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
- Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
- Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
- Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
- Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
- Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
- Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
- Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
- Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
- Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
- Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
- Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
- Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
- Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
- Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
- Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
- Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
- Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
- Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
- Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
- Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
- Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
- Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
- Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
- Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
- Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
- Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
- Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
- Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
- Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
- Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
- Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
- Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
- Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
- Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
- Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
- Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
- Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
- Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
- Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
- Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
- De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
- Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
- Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
- Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
- Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
- Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).
