Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Närings förordning genom kontinuerlig matning för storskalig utbyggnad av däggdjursceller i sfäroider

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/52224
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

Introduction

För att generera ett stort antal viabla och funktionella humana celler för transplantation, är reglering av odlingsbetingelsema absolut nödvändigt. Utarmning av näringsämnen, tillsammans med uppbyggnaden av metaboliskt avfall är viktiga bidragsgivare med åldrande och metaboliska förändringar som minskar kvaliteten på cellprodukten 1-3. Denna procedur visar en metod för att odla däggdjursceller i sfäroider med användning av en omrörd bioreaktor i kombination med en justerad hastighet perfusion matningssystem för att reglera glukos i ett fysiologiskt intervall 4 under hela varaktigheten av kulturen. För ändamålet av dessa studier, var det fysiologiska området definieras som mellan 100 och 200 mg / dl. Samma metoder kan användas för att reglera andra näringsämnen och metaboliska avfall såsom laktat.

Statiska kulturer i små volymer (1 - 30 ml) används typiskt i laboratoriemiljö för att upprätthålla och differentiera cellinjer för experimespecialist- ändamål. Cell passage utförs med komplett medium de ändringar som behövs med jämna mellanrum. Mest "konventionella" odlingsmedium har en hög glukoskoncentration (450 mg / dl för DMEM användes i dessa studier) för att möjliggöra mindre frekventa mediumbyten utan risk för närings begränsningar. Men denna sats matning metoden kräver fortfarande frekvent manipulation, introducerar variabilitet i cellmiljön, och ökar risken för kontaminering 5-9. Omrörd suspension bioreaktorer (SSB) ger bättre blandning och minskad hantering 3,10 - 20, men som statiska kulturer kräver manuella medel förändringar som bidrar till potentiellt skadliga fluktuationer i närings och avfallsproduktnivåer. Perfusion utfodring av SSB kulturer minskar dessa problem genom kontinuerlig infusion och avlägsnande av medium, men stora förändringar i halter av näringsämnen på grund av celltillväxt förblir ett problem. Användningen av en justerad utfodrings rate från beräkningar av närings användning baserat på beräknade behov cell kan ge den stabila cellmiljön som krävs för att optimera cellviabilitet och funktion 21-24.

Det finns en stor mängd litteratur som beskriver metoder för skal SSB kulturer av däggdjursceller specifikt för kultur och utbyggnad av pluripotenta celler 25-32, med andra fokuserade på holme (beta) celler 17,33,34, eller produktion av biologiska produkter 24, 35-38. Många av dessa undersökta celltyper kan odlas i sfäroida kulturer, och särskilda förfaranden för den celltyp som används bör optimeras innan genomföra en kontinuerlig matningssystem. I denna demonstration var en perfusion matningsmetod som används för att expandera en beta cellinje odlas som sfäroider i en omrörd bioreaktor 39-43. Den metod som beskrivs häri tillhandahåller enunderlätta genomförandet av utfodring ränteförändringar baserade på off-line glukosmätningar för att uppnå riktade odlingsbetingelser. Justering av matningshastigheten med denna metod för att upprätthålla en fysiologisk glukosnivån visas till ökningar cellutbyten. Däggdjursceller är beroende på en nyckelkod näringsämne, glukos, för energiproduktion, så användningen av denna cellinje representerar en modell för många odlade däggdjursceller 44. Dessutom har denna linje exemplifierar ytterligare komplexitet betaceller, som är känsliga för kroniskt höga nivåer av glukos 45. För denna studie var p-TC6 celler tilläts bilda sfäroider i odling för att approximera den genomsnittliga storleken på Langerhanska öar in vivo. Perfusionen bioreaktorsystem 17 - 19,21,46 med en matningshastighet justeras för att glukoskonsumtion, resulterade i upprätthållande av fysiologiska betingelser och högre utbyten cell utan förändringar i viabilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell Line och underhåll

  1. Skaffa p-TC6 celler (eller annan önskad vidhäftande däggdjurscellinje). Som förberedelse för studien, kultur, passage, och cryopreserve cellerna enligt leverantörens instruktioner.

2. Montera kontinuerlig matning System

OBS! Kontinuerlig matning systemdesign i metoden nedan baserades på liknande system som beskrivs i litteraturen 17 - 19,21,47 - 49. Montering av det system som används här beskrivs i detalj i en tidigare publikation 3.

  1. Samla de komponenter som behövs för utfodringssystem som består av fem huvudkomponenter: ett medium reservoar, peristaltiska pump, omrörd bioreaktor, avfallsbehållare, och specialdesignade slangar / provtagning.
    1. Upprätta mediet reservoaren med hjälp av en 1 L glasflaska, avfallsbehållaren med hjälp av en 2 L glasflaska, och stirred bioreaktor med hjälp av en 250 ml volym glasreaktor (från hyllan version).
    2. Använd en digital peristaltisk pump eller liknande pump med en 8-kanals pumphuvudet för att styra mediumutbyte.
    3. Tillverkning reservoaren och modifierade bioreaktor lock från hårt och autoklaver plast med rostfria stål genomslaget portar för att ge ventilation genom sterila filter, och göra det möjligt för medel överföring mellan reservoarer och bioreaktorer. Alternativt köpa specialiserade lock med flödesportar från olika leverantörer.
      OBS: Locket bioreaktor kan innehålla ytterligare Genomgående portar för valfri instrumentering och övervakningssonder (t.ex. syre monitor).
    4. Bifoga ett utflöde rör (GT) tillverkat av porösa glasluftningsrören med en genomsnittlig porstorlek intervallet 40 ^ m till 60 ^ m, och en por densitet på 40% till den modifierade SSB locket. Du kan också välja en annan utflöde rör baserad på de specifika kraven i kulturen.
      OBS: Välj denOT porstorlek för att avlägsna endast medium och cellrester, lämnar cellaggregat i kultur (som beskrivs i avsnitt 6 och publicering 3 för mer information).
  2. Montera autoklaver perfusion slangar från polyvinylidenfluorid (PVDF) slangkopplingar och hållbara peristaltiska pumpslangen. Längden av sektion är beroende av avståndet mellan de olika komponenterna.
    OBS: Var särskilt försiktig när du väljer slang sort för att garantera hållbarhet och tillförlitlighet för långtidsförsök.
  3. Montera ledningsuppsättningen från tre delar: en matarledning, en avfallslinje, och en provtagningsledning.
    1. Montera matarledningen med två slangar diametrar (L / S 14 och L / S 13). Använda L / S 14 för den primära slangen som kommer att överbrygga avståndet från bioreaktorn till mediet reservoaren, och sätta in en kort längd av L / S 13 i mitten av slangen längden för pumpdelen med användning av lämpliga PVDF adaptrar.
    2. Använd Standard PVDF slang hullingförsedda tubing adaptrar för att sammanfoga två stycken av L / S 14 slangen på vardera sidan av den kortare pumpsektionen (L / S 13) slang.
      OBS: Alternativt skulle hela rörlängden vara mindre diameter L / S 13 slang, och hela slanglängden skulle kunna ersättas när pumpen snittet integritet är i fråga.
  4. Montera den andra slangsektionen för sophämtning använder större diameter (L / S 16) slang och infoga ett kort avsnitt av L / S 14 slang i mitten för pumpsektionen. Detta görs på samma sätt som matarledningen monteringen med hjälp PVDF slang-hullingförsedda adaptrar, eller alternativt med användning av en kontinuerlig längd av den önskade pump rörstorlek, och ersätta efter behov.
    OBS: Om samma pump och pumphuvud används för matningskretsen och avfallskretsen, måste pumpen delen av flyttavfallsslangledningarna vara en större diameter än pumpsektionen av matningsledningen. Detta säkerställer att avlägsnandet pumphastigheten är snabbare än matningshastigheten, och kommer att undvika den potentadar e för stora förändringar i odlingsvolymen, och minska risken för spill.
  5. Montera den sista komponenten av ledningsuppsättningen: en provuppsamlingssammansättning.
    1. Detta förfarande beskriver en anpassad monterat provtagning hamnsystem; Alternativt kan en steril provtagningsporten köpas från olika leverantörer.
    2. Konstruera uppsättning från tre korta (~ 6 cm) L / S 14 slanglängder kopplas samman med en T-typ PVDF kontakt, och två små slangklämmor på två av slanglängder.
    3. Bifoga en steril gas filter för gas ventilering till en av de klämda längder, och den andra används för anslutning till en spruta steril provtagning (sterila gasfilter kan behöva tillsättas i en biosäkerhet skåp efter sterilisering så många sterila filter är inte autoklaver).
    4. Ansluta den tredje änden till ett rostfritt stålprov kontaktdon fäst på locket till bioreaktorn.
    5. Autoklav provtagningsenheten medan ansluten till bioreaktorn före börjanexperimentet (se steg 3 nedan).
    6. Använd denna församling för att samla sterila prover från bioreaktorn efter behov utan att störa kontinuerlig matning processen.

3. Autoklav Alla Material

  1. Förbered alla bioreaktor komponenter för autoklav sterilisering.
  2. Samla enskilda komponenter för sterilisering. Medium och avfallsreservoarerna (monterad från steg 2.1.1), 250 ml spinnkolv (sammansatt av 2.1.1), som är nödvändiga för modifierade lock (sammansatta av 2.1.3), utflöde röret (som beskrivs i 2.1.4), tre slangset ( monteras i avsnitten 2.2 through2.5), utflöde röret (som behövs för kontinuerlig matning).
    1. Montera spinnerflaska med alla komponenter och vara säker på att utflödet röret sitter fast inne i spinnkolv (som beskrivs i avsnitt 2.1.4), och fäst anpassade monterade provtagningsport (avsnitt 2.5), eller annan provtagning port till toppen av locket .
    2. Slå in hela spinnerflaskaggregatet med automatiskclave omslagsmaterialet, och autoklav indikerar tejp. Se till att omslaget lufttät. OBS: aluminiumfolie eller liknande material kan användas för att täcka de enskilda ändarna av varje accessport i bioreaktorn locket för att bevara steriliteten hos kontaktdonet / slutar när unwrapping och när icke-ansluten till slangset inuti inkubatorn.
    3. Montera de modifierade lock av mediet och avfallsreservoarerna och sedan fästa till respektive glasflaskor. Täck dem med aluminiumfolie och autoklav indikerar tejp.
    4. Individuellt linda slangset (avsnitt 2,2-2,5) med autoklav wrap och tejp för att hjälpa till slutmontering. Aluminiumfolie eller liknande material kan användas för att packa in de individuella ändarna hos varje slangsetet för att bevara steriliteten hos kontaktdonet / slutar när uppackning.
    5. Autoklav alla förpackade artiklar med en vanlig torr autoklav cykel (t.ex. "Gravity" inställning med ~ 15 psi vid 121 ° C under 30 minuter eller mer).
      OBS: Anslut inte sterilfilter före autoklavering, såvida de inte bekräftats vara autoklav säker.

4. Spheroid Formation

OBS: Denna teknik är liknande de som beskrivs i litteraturen 17 - 19,21,50 - 52 för andra däggdjurscellkulturer. Alla procedurer följande sterilisering bör göras i en huv med laminärt flöde och med användning av sterila handskar för att upprätthålla sterila betingelser för cellodling.

  1. För alla förhållanden, kultur och expandera β-TC6 celler i standard vidhäftande kulturer (som beskrivs av leverantören) tills tillräckliga cellmängder erhålls att ympa önskat antal bioreaktorer.
    1. Montera kontinuerlig matning bioreaktor med utflöde röret som visas i figur 1 och beskrivs i avsnitt 2, och anslut provtagningsporten till lock provtagning. OBS: Utflödet röret och provtagning sportenheten bör sättas till bioreacteller för kontinuerlig matning före sfäroid bildning, och bör dras upp ur odlingsmediet tills kontinuerlig matning startas.
    2. Sterilisera modifierade SSB enheten genom autoklav (beskrivs i avsnitt 3).
    3. Fäst sterila ventiler (0,22 um eller mindre sterila filter) till lämpliga platser på locken på spinnerkolven och medel och avfallskärl.
      OBS: Detta är viktigt för att förhindra ånglås, och för att möjliggöra gasväxling mellan inkubator (5% CO2) miljö och bioreaktorn. Gasutbytet är nödvändigt att upprätthålla rätt pH vid användning av bikarbonatbuffrade medium.
  2. Samla upp cellerna genom försiktig trypsinisering med användning av 0,25% (vikt / volym) Trypsin- 0,53 mM EDTA-lösning, vid rumstemperatur med hjälp av mekanisk omröring för 2-3 min, och utsäde i bioreaktorer med en täthet av ungefär 1,3 x 10 6 celler / ml i 200 ml odlingsmedium.
    1. Flytta utsedda flaskor ur inkubatorn ochi ett skåp biosäkerhet.
      OBS: All cellodling och manipulationer bör göras i ett skåp biosäkerhet med rätt steril teknik.
    2. Ta bort odlingsmedium från kolvar genom att aspirera.
    3. Tvätta cellerna genom pipettering 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (utan Ca ++ eller Mg ++), in i kolv, och sköljning tvärs cellerna på ytan, och sedan aspirera PBS.
    4. Tillsätt 3 ml Trypsin-EDTA-lösning till varje kolv som kommer att samlas in (typiskt omkring 10x 175 cm 2 T-kolvar).
    5. Tillåta skördade cellerna att inkubera vid rumstemperatur under 2-3 min i biosäkerhet skåp.
    6. Agitera försiktigt för hand för att lossa cellerna från kolvytan, och samla cellerna genom att tillsätta 6 ml odlingsmedium (med serum) till kolven, och överföra cellerna till ett 50 ml rör. När en 50 ml tub är full, använda en annan 50 ml rör tills alla av de nödvändiga cellerna har samlats in (ungefär en 50 ml tub kommer att behövas för varje 5 T-175-kolvarsamlade in).
    7. Försiktigt centrifug (ca 50 x tyngdkraften) de uppsamlade cellsuspensionerna för att pelletera cellerna.
    8. Aspirera den återstående mediet som lämnar pelleten intakt.
    9. Samla alla cellerna i ett enda rör genom att åter suspendera pellets i odlingsmedium (innehållande serum) med användning av en pipett, och överföra alla pellets in i samma rör.
    10. Räkna celltätheten med användning av en standard-hemocytometer med trypanblått-färgning såsom beskrivits i litteraturen 53.
    11. Lägg önskat antal totala celler till sterila SSB för varje tillstånd (1,3 x 10 6 celler / ml var riktade start celltätheter för demonstration).
    12. Lägg till medium (med den önskade glukoskoncentration, i detta fall använde vi medelglukosnivåer inom det fysiologiska området) till SSB med en pipett för att nå den önskade totala odlingsvolymen (200 ml odlingsvolym användes för dessa studier).
      OBS: För dessa kontinuerliga matad SSB studerar cu ltures såddes med användning av en modifierad "låg-glukos" version av odlingsmediet (100 mg / dl). Detta tillät kulturerna för att starta vid den önskade mål-glukoskoncentration stället för att starta med en "hög-glukos" medium och väntar på glukoskonsumtion för att bringa glukosnivåerna ner i det fysiologiska området för att börja matningen. Allt annat medium för matning i dessa studier använde standard "hög glukos" medium (500 mg / dl).
    13. Flytta SSB med celler till en omrörningsplatta i en cellkultur inkubator.
  3. Kulturceller i bioreaktorerna utan utfodring under 3 dagar vid 37 ° C, med 5% CO2, 100% relativ fuktighet och en omrörningshastighet av 70 varv per minut för att tillåta sfäroider bilda.
    OBS: Ingen signifikant spridning bör observeras under tre dagar sfäroid bildningsperiod.
  4. Efter sfäroid formation, dela sfäroider bland bioreaktorer med önskade odlingsbetingelser.
le "> 5. kontinuerlig matning kultur och justerad Matningshastighet

  1. Autoklav eller gas sterilisera alla komponenter, och montera i ett biologiskt säkerhetsskåp med sterila tekniker (steg 2-4).
  2. Efter sfäroid formation bort SSB från inkubatorn och montera komponenter för kontinuerlig matning systemet i ett biologiskt säkerhetsskåp.
    1. Fyll först färskt medium reservoar med det önskade odlingsmediumet, och sedan ansluta till en sida av matarledningen. Också se till att färskt medium reservoaren är ordentligt ventilerad med ett sterilt filter.
    2. Ansluter en sida av matarledningen till matningsinloppsporten på bioreaktorn på ett sterilt sätt. Ett sterilt filter bör installeras mellan matarledningen och bioreaktor inloppsport för att filtrera mediet innan det kommer in i bioreaktorn.
    3. Anslut avloppsledningen till bioreaktorn utflöde röret och reservoar på medellång avfall, och se till att avfallsbehållaren är ordentligt ventilerad med en sterile filter.
  3. Flytta enheten ur biologisk säkerhet skåp (detta kommer sannolikt att kräva två personer för att bära alla fartyg och slangar), och sätta alla komponenter ut för långtidsodling.
    1. Sätta SSB på omrörarplatta insidan av inkubatorn genom att använda samma odlingsparametrar för sfäroid bildning (37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet och 70 varv per minut). OBS: Det kan vara nödvändigt att tillfälligt koppla bort slangsegmenten från bioreaktorn om linjerna behöver köra genom hål i sidan på inkubatorn snarare än ut genom packningen i dörren. Detta kan göras i en aseptisk sätt genom att linda ändarna av slangset med aluminiumfolie före autoklavering (steg 3), och väntar på att fästa bioreaktorn sida av matnings- och avfalls rörsektioner tills bioreaktorn är inuti inkubatorn. De rör linjer kan sättas på plats, och aluminiumfolien kan avlägsnas inuti inkubatorn och snabbt anslutas till bioreaktom.
    2. Kör återstående ändarna av slangset (de som inte är anslutna till bioreaktorn locket) ut genom inkubatorn accessporten (pass-through), eller genom ett hack i inkubatorn dörren packning.
    3. Utanför inkubatorn (i en närliggande biosäkerhet skåp om möjligt), snabbt ansluta matarledningen till färskt medium reservoaren och avfalls linje till reservoaren mediet avfall, och se till att avfallsbehållaren är ordentligt ventilerad med ett sterilt filter. OBS: För att göra detta på ett aseptiskt sätt, ta bort aluminiumfolien från slangen och fartygs och anslut till respektive fartyg så fort som möjligt (särskilt om detta sammanhang måste göras utanför biosäkerhet skåpet).
    4. Sätt färskt medium reservoar (fylld med önskad matningsmedium) i närheten minikylskåp. Kontrollera för att se till att de till- och avloppsledningarna har möjlighet att gå ur inkubatorn och mata kylskåpet utan att förhindra de dörrar på varje från att stängas. Det är även kritiskt att matnings lines inte kläms stängs av dörrarna antingen kylskåpet eller inkubatorn.
      OBS: Det medium som användes för dessa studier var den standard hög glukos (500 mg / dl) odlingsmedium som rekommenderas av leverantören för denna celltyp. Någon hög glukosmedium kan användas baserat på de särskilda behoven hos den celltyp som odlas. Glukoskoncentrationen i näringsmediet skall vara någorlunda högre (2x eller mer) än den önskade koncentrationen i kulturen som matningssystemet bygger på att öka matningshastigheten för hög glukosmedium för att upprätthålla lämpliga glukosnivåer i odlingarna bibehållen rimliga matningshastigheter .
    5. Därefter kan avfallet mediet behållaren sättas på bänken topp utanför inkubatorn i ett bra läge.
    6. Placera sedan "pump avsnittet" av foder och avfallsledningarna till pumphuvudet säkerställa rätt orientering så att matarledningarna kommer att pumpa mediet från färskt medium reservoaren i SSB, och avfallsledningarnakommer att pumpa mediet från SSB och avfallsmediet reservoaren.
  4. Slå på pumpen till den önskade matningshastigheten.
    1. Beräkna matningshastigheten genom att använda den justerade matningshastigheten ekvation beskrivs i litteraturen 3 och i den medföljande representativa resultat avsnittet nedan.
    2. Använda den senaste informationen kroppar (proceduren beskriven i steg 5) tillsammans med tillväxten förutsägelse, och medelmätningarna glukos för att uppskatta inmatningshastigheten som behövs för att upprätthålla den önskade glukoskoncentrationen i kulturen.
      OBS! Cell tillväxt och glukosförbrukningshastigheter måste erhållas innan du gör dessa förfaranden.
    3. Ställ in pumphastigheten baserad på den beräknade matningen.
  5. Upprepa beräkningen av matningshastigheten och justera pumphastigheten för varje provtagningspunkt (var tredje dag för den beskrivna metoden).

6. kroppar, lönsamhet och glukoskoncentration Mätningar

<ol>
  • Samla prover från varje bioreaktor var tredje dag, eller enligt önskemål.
  • Ta odlingsprover från kontinuerligt SSB kulturer använder specialiserad provtagningsport som beskrivits ovan.
    1. Lämnar kontinuerligt SSB inuti bioreaktorn, bifoga en steril spruta (en volym spruta 5 ml användes för dessa studier) till un-filtrerad anslutning av provtagningsporten.
    2. Flytta provtagningsröret ned i odlingsmediet.
    3. Frikoppla rörsektionen kommer att sprutan, och dra tillbaka den önskade totala provvolymen.
    4. Flytta provtagningsröret upp så att den inte längre är nedsänkt i kulturen, och fortsätta att dra tillbaka sprutan tills luft avlägsnas.
    5. Klämma röret som matar sprutan och ta bort sprutan innehållande provet, och ställ åt sidan.
    6. Pre-ladda en andra färsk steril spruta med luft, och fäster den sterila filtersida provtagningsporten.
    7. Frikoppla röret kommer att sprutan-filtersidan avprovtagningsporten, och sedan rensa provtagningsporten genom att försiktigt utvisa luften i sprutan genom sterilfilter. Detta säkerställer att provtagningsöppningen kommer att vara fri från varje kvarvarande medium.
    8. Åter klämma röret går till filtret, koppla bort steril spruta och kassera den.
  • Ta sprutan som innehåller provcellen från odlingen, och utvisa den i ett 10 ml rör. Under prover av kända volymer kan tas direkt från detta rör.
  • För cellräkningar, ta bort en känd volym av celler och överför till en mikro-centrifugrör, och centrifugera försiktigt i 1 - 2 min (ca 50 x tyngdkraften).
  • Överför supernatanten till ett separat rör för glukosmätningar, och återsuspendera pelleten med samma volym av trypsin-EDTA-lösning (0,25% (vikt / vol) trypsin, 0,53 mM EDTA), och räknas i triplikat med användning av en standard-hemocytometer med trypan blå färgning som beskrivs i litteraturen 53.
    1. Lägg till medium (med serum) tillprovet för utspädning vid behov.
    2. Räkna celler, och beräkna cellviabiliteten genom att spela in levande (ofärgade) celler, och döda (färgade) celler självständigt (viabilitet% = levande celler / totala celler).
  • Mät medelglukosnivåer i tre exemplar med hjälp av en blodsockermätare och engångstestremsor.
    1. Ta glukosmätningar såsom beskrivits av glukosmätaren instruktioner ersätter odlingsmediet för blod.
    2. Doppa testremsan i det medium som skall testas (samlas in från prover räkna ovan), och upprepa för önskat antal replikat (tre replikat rekommenderas).
    3. Testa både färskt medium och avfallsmedium för glukoskoncentrationer.
      OBS: För vissa meter mätningar lägre än 20 mg / dl (detekterbar tröskeln till meter), kan observeras som ett fel i mätaren utgång.

    • 7. sfäroid avsättningshastigheten Mätningar

    1. För att säkerställa att cell kluster är inte avlägsnas genom det kontinuerliga matningssystem, mäta sedimenteringshastigheten av p-TC6 sfäroider genom att observera deras sedimentering i en stor diameter plastpipett.
    2. Kultur p-TC6 celler i SSB bioreaktorer för att bilda sfäroider som beskrivits ovan.
    3. Efter 3 dagars odling, ta 30 ml prover av den sfäroid suspensionen och placera i ett 50 ml rör.
    4. Pipettera försiktigt upp och ner med en stor diameter 25 ml pipett för att fördela jämnt i suspension, sedan stoppa pipettering med suspensionen vid en känd nivå i pipett (t.ex. 20 ml märke), och sedan registrera den tid för alla sfäroiderna till sedimentera 5 cm.
    5. Upprepa denna procedur tillräckligt många gånger för att uppnå statistisk konfidens (vanligtvis n> 3).
      OBS: För biologiska studier, ap värde mindre än 0,05 anses vara statistiskt signifikant när man jämför mätningar. Standardavvikelsen för medelvärdet användes för att rapportera fel och tvådelade un-parade Student-t-testanvändes för att jämföra villkor för de presenterade data.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Medium glukosnivåer och fluktuationer Begränsa Cell Expansion i Standard SSB kulturer

    Glukosnivåerna varierar i statiska kulturer och SSB kulturer över hela odlingsperioden 3. Dessa svängningar öka med ökande cellantal under 21-dagars odlingsperiod och var nästan identiska i både statiska och SSB kulturer. Dessa observationer presenteras i vår tidigare publikation 3. Glukosnivåerna kan vara super-fysiologiska under hela odlingsperioden för båda metoderna. Eftersom denna kroniska exponering kan hämma celltillväxt 54, var ett kontinuerligt matningssystem utvecklats för att eliminera glukossvängningar och förbättra närings kontroll under sfäroid kultur.

    Kontinuerlig matningssystem för Spheroid Kultur

    Kontinuerligt tillsätta färskt medium och ta bort gammalt medium för varaktigheten av odlingsperiodenkan åstadkommas med användning av en enkel medelsystemet påfyllning. Det system som beskrivs i metod 2 och visas i Figur 1 används en pump och slang inställd att kontinuerligt fylla på medium och ett separat utflöde rör för att kontinuerligt ta bort mediet och samtidigt förhindra avlägsnandet av sfäroider från kulturen. Mediuminloppet var vid den motsatta sidan av reaktorn för att minimera varje möjlighet till att störa den riktiga funktionen av OT och för att möjliggöra grundlig blandning. Färskt medium (med hög glukoshalt, 450 mg / dl) hölls vid kylskåpstemperatur för att säkerställa en långsiktig stabilitet och kontinuerligt till kulturen genom ett medium inlopp med en fullständig medelersättningsgraden var tredje dag för att fylla på näringsämnen. Detta system begränsade manipulationer och ingrepp som krävs under odlingsperioden genom att ersätta den manuella satsmediet ersättningsprocessen med en kontinuerlig process 3,22,23. Det kalla mediet in i bioreaktorn i små volymer över time (0,046 ml / min) i förhållande till den totala odlingsvolymen (200 ml), vilket ger varje "drop" av tillsatt mediet tid att jämvikta temperatur med det omgivande odlingsmedium som var vid 37 ° C. Detta säkerställde att den tillsatta kallt medium minskade inte den totala odlingstemperaturen upprätthålles inom inkubatorn. Omrörning av odlingsmediet ökade också värmeöverföringseffektiviteten, och förbättrad temperaturfördelning i dessa kulturer. Varmhållning kan vara ett bekymmer om mycket höga matningshastigheter användes med små odlingsvolymer, men dessa osannolika förhållanden testades inte för dessa studier. Odlingsvolymen hölls vid en konstant nivå i det kontinuerliga matningssystemet genom att säkerställa att den genomsnittliga medelhastigheten avlägsnande var lika med matningshastigheten. Det system som används för dessa studier faktiskt avlägsnade medium vid en högre flödeshastighet än inmatningshastigheten eftersom avlägsnandet rörmaterialsektionen användas slangar med större diameter för pumpdelen. Trots den snabbare remoVal hastighet ades odlingsvolymen upprätthålls genom att justera nivån för utflödesröret inuti reaktorn till den önskade kulturen volymnivå. Kontinuerligt tillsätta färskt medium till SSB resulterade i en liten ökning av medelnivå i reaktorn, och när mediet nådde en nivå av OT, avlägsnades medium från reaktorn i en snabbare takt. Avlägsnades mediet genom det porösa glaset OT, lämnar cell sfäroiderna i odling tills mediumnivån sjönk under botten av OT. Detta system undviker komplexiteten i att använda tenuous flöde och volym sensorer för att styra pumphastigheter, och är standard för användning med många SSB baserad kultur apparaten 47,48. GT har utformats för att säkerställa att sfäroider inte togs bort från kulturen genom att avlägsna kretsen, och porstorleken och tätheten i den sintrade glasröret var tillräckligt stor (40% och 40 till 60 um respektive) för att säkerställa att den linjära flödeshastigheten var mindre än avsättningshastigheten av sfäroiderna used för dessa studier kultur. Det linjära flödet beräknades såsom beskrivs i detalj 3. Den genomsnittliga linjära mediet hastigheten genom porerna i GT beräknades vara 0,17 cm / min och detta var mycket långsammare än den långsammaste observerade sfäroid sedimenteringshastigheten. Den genomsnittliga sedimenteringshastigheten uppmättes såsom beskrivits i metod 7 och var 2,53 ± 0,26 cm / min för sfäroiderna som används i dessa studier. Sfäroiderna observerades öka i storlek som kulturen fortskrider, och dessa större sfäroider avgöras snabbare på grund av deras ökade mass dra förhållande, vilket ytterligare minskade möjligheten att avlägsna genom OT. Vissa sfäroider blev instängda i de nedre porerna på ytterkanterna av OT, men detta berodde främst på mekanisk kollision när utflödet röret doppar i den omrörda mediet. Detta hindrade inte korrekt funktion av OT, och inte bidra till en mätbar förlust av sfäroider i de testade kulturer. OT för dessa studier var rengöras efter varje studie (med DI vatten flush), och bytas ut efter användning för två kulturstudier för att undvika risken för minskad funktion. OT kan bytas efter varje undersökning om sfäroider observeras att täppa till porerna under en särskild studie (detta observerades inte i det presenterade arbetet). På grund av den cykliska avlägsnande av mediet med den här metoden, medelhög volym kultur varierat med så mycket som 6%. Svängningarna orsakades av ytspänningen av mediet som tillät OT att ta bort lite mer medium efter den genomsnittliga medelnivå sjönk under botten av OT.

    Eliminera Närings Fluktuationer Förbättrad celltillväxt i SSB kulturer

    Kontinuerligt ersätta mediet i SSB kulturer som använder det ovan beskrivna systemet ökade kulturutbyten under 21 dagar långa odlingsperioden jämfört med de vanliga SSB kulturer. Matningshastigheten hölls konstant under hela odlingsperioden i en takt som ersatte hela kulturen VOLUmig var tre dagar för att vara jämförbar med satsmatade SSB kulturer. Eliminera närings svängningar resulterade i en ökning av cellutbyten (Figur 3) trots den höga glukoskoncentration 3. Sfäroid storlek mättes också i slutet av odlingsperioden av 2D mikroskopisk bedömning (standardljusmikroskop som beskrivs i litteraturen 3), och sfäroiderna i CF-SSB kulturer var signifikant större (p <0,02, student-t-test) som i statisk eller standard SSB kulturer som rapporterats i litteraturen 3. Dessa observationer stödjer datacell-count antyder en högre tillväxttakt i CF-SSB kulturer medan lönsamheten bibehölls på samma höga nivå (96,23 ± 0,85%) oavsett kultur tillstånd. Den kontinuerligt SSB (CF-SSB) odlingssystemet eliminerat närings fluktuationer i sfäroida kulturer och förbättrad celltillväxttakt, men glukosnivåerna förblev super-fysiologiska som kan ha förhindrat ytterligare imp rovement i cellexpansion (Figur 2). För att ytterligare förbättra det CF-SSB odlingssystemet, var en algoritm som används för att justera matningshastigheten under odlingsperioden med målet att förbättra kontrollen av glukosnivåerna i SSB kulturer.

    Beräkning av Justerat Matningshastighet

    Flera faktorer kan beaktas vid beräkningen av matningshastigheten för att bibehålla konsekventa glukosnivåer. De specifika faktorer av intresse kan ändras för en given studie och för en specifik cellinje. Vid tillämpningen av denna demonstration, ansåg vi tillväxttakten och glukoskonsumtion bestämdes från tidigare kulturer, liksom de faktiska glukosnivåer vid tidpunkten för justering 3. justeringar Matning- kan göras när som helst intervall i tid. För denna demonstration uppsamlades prover och inmatningshastigheten justerades var tredje dag baserat på de sekventiella beräkningar som beskrivs enligt följande.

    t "> Beräkning av förväntade ökningen

    Ekvation 1 förutsäger celltillväxt under en viss period av kultur, med den förutspådda celltal (N 2) som representerar den förväntade totala antalet celler i odling vid någon tidpunkt i framtiden. Denna metod använder en linjär tillväxt approximation där den nuvarande celltal (N 1) läggs till den uppskattade tillväxttakten av cellerna i sfäroida kulturer (R g) multiplicerat med odlingsperioden (t2-t 1).

    ekvation 1 (1)

    Beräknat Baseline Matningshastighet

    Baslinjen matningshastigheten (R F) beräknades med hjälp av ekvation 2 genom att uppskatta glukos förbrukas i kulturen under odlingsperioden (täljare) och dividera den med glukoskoncentrationen i matarmediet (C F 1) med det vägda genomsnittet av N 1 och N 2 från ekvation 1. Denna konsumtionshastigheten dividerades sedan med glukoskoncentrationen (C F) i matningsmediet för att beräkna den genomsnittliga medelmatningshastigheten behövs för att ersätta glukosen förbrukas under samma odlingsperioden.

    ekvation 2 (2)

    Justera matningshastighet med Observerade glukosnivåer

    Ytterligare justeringar gjordes till baslinjen matningshastigheten för att tillgodose de uppmätta glukosnivåer (C 1) vid den valda tidpunkten med hjälp av ekvation 3. Detta glukos justerade matningshastigheten (GAFR) kan användas för att upprätthålla nivåer när oväntade förändringar i tillväxt eller död uppstå i kulturen. denna equatio n bildat en kontroll konstant (X), och ett värde av 0,5 användes för dessa uppgifter 3. C 1 representerar glukoskoncentrationen mätt i odlingsmediet på provet dagen, och C D representerar målmediet koncentrationen glukos. Det slutliga värdet justerar den förutsagda matningshastigheten från den andra beräkningen.

    ekvation 3 (3)

    Figur 1
    Figur 1: kontinuerlig matning Systemdiagram med Utflöde Tube. (A) Diagram av den påvisade systemet. (B) frittat glasfilter placeras på utflödesröret för att tillåta medium som skall avlägsnas från odlings utan förlust av celler. Figur återges med tillstånd. 3

    /files/ftp_upload/52224/52224fig2.jpg "/>
    Figur 2:. Glukosmätningar för SSB, CF-SSB och justerat CF-SSB Kulturer (A) Medium glukosmätningar från p-TC6 sfäroida kulturer använder statiska, SSB, och CF-SSB odlingsmetoder och utfodring med standard hög glukosmedium. Den kontinuerliga matningen är i stånd att eliminera glukos fluktuationer, men de genomsnittliga glukosnivåer i mediet förändring dramatiskt under odlingsperioden, och långt över det fysiologiska området (anges med det grå fältet). Den justerade matningen kan eliminera fluktuationer samt upprätthålla glukoskoncentrationer nära fysiologiska nivåer under hela odlingsperioden. Felstaplar för glukosmätningar är för liten för att vara synlig på skalan visas (Standard Error ≤ 4% för alla mätningar). Data från siffrorna presenteras i föregående publikation med tillstånd. 3


    Figur 3: cellräkningar från SSB, CF-SSB och justerat CF-SSB kulturer med Tillväxt Justerat Feed priser Celltillväxt redovisas som faldig förändring i cellantal under 21-dagars odlingsperiod jämföra SSB med regelbundna medel förändringar mot konstant matningshastighet. SSB kulturer och justerade matningshastighet SSB kulturer. Felstaplar rapporterar standardfelet av medelvärdet, och p-värden som rapporteras är en un-parade tvåsidiga elev-t statistiskt test. Återges med tillstånd. 3

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Generera däggdjurscellprodukter för framställning av biologiska agens och cellterapi kräver kultur och övervakning av däggdjursceller i stor skala 55-58. Vidare har dessa applikationer kräver definierade och validerade odlingsbetingelser. Helt enkelt öka volymen av celler med användning av forsknings teknik kommer inte uppfyller alla dessa krav. Manuella ändringar medel orsakar svängningar i näringsämnen och ackumulering av avfallsprodukter minskar cellernas kvalitet, lönsamhet och avkastning. Användningen av bioreaktorer är väl etablerad för kommersiell odling av mikroorganismer för bio-farmaceutiska applikationer, och liknande strategier har tillämpats på däggdjurscellkulturer. Det komplexa samspelet av däggdjursceller med sin omgivning kräver särskilda ändringar för att reglera näringsnivåer för att optimera cellexpansion potential.

    För att lösa dessa problem har vi utvecklat en straightforward metod för att upprätthålla glukosnivåer i ett visst målintervallet, som närmar fysiologiska nivåer i en omrörd suspension bioreaktor med en justerbar ränta perfusion matningsmekanismen. För att åstadkomma detta, var sfäroider av en beta-cellinje som genereras i en omrörd suspension bioreaktorn. En perfusion matningssystem användes för att åstadkomma en kontinuerlig matning mekanism för att ersätta standardprocedurer parti utfodring. Cell tillväxt observerades, och används för att förutsäga ungefärliga glukosskötsel. Faktiska glukosnivåer mättes också över tiden i kulturen att justera matningshastigheter som svar på verkliga näringsämnen som konsumeras och metaboliska produkter deponeras i mediet av cellerna. Denna metod hindrat fluktuationer i glukosnivåerna ses med andra statiska och SSB-system 3, där glukosnivåerna fluktuerade dramatiskt med mediumbyten var 3 dagar. Använda strategier batch-utfodring, glukoskoncentrationer föll så mycket som 275 mg / dl under tre dagar, i sent skedesi 21-dagars expansion. Dessa svängningar i blodsockernivån begränsad cell avkastning.

    Beräkning av mediet ersättningsgraden för demonstration av den justerade matningssystem införlivat en etablerad tillväxttakt och glukosförbrukningen för cellinjen, liksom de observerade (mätt) kultur densiteter och glukosnivåer vid varje utfodring tidspunkt. För olika celltyper, eller för mer komplexa vävnadskultursystem, kan dessa antaganden inte håller streck. Att säkerställa en mer noggrann glukoskontroll algoritmen ingår också ett återkopplingsstyrsystem för att ta hänsyn tas till variationer i individuella kulturer. Begränsningar av en perfusion metod baserad på tillväxt ensam, inklusive effekten av heterogenitet i glukosutnyttjande för celler under sfäroiderna och förändringar i glukoskonsumtion baserat på parametrar såsom differentierande stamceller, kan mildras genom ett återkopplingskontrollsystem. Beroende på tillämpningen, celler som uppvisar exponential tillväxt eller mer komplexa tillväxtprofiler skulle kunna genomföras för att förbättra algoritmen prestanda. De antaganden och värden som används för matningen beräkningar kan ändras för att ansluta sig till faktiska odlingsbetingelser.

    De presenterade metoderna är avsedda att producera celler för en terapeutisk applikation där expansion och kultur av sfäroider skulle vara under en begränsad varaktighet, och cellerna själva är produkten .. Det kan vara önskvärt för vissa forskare att kontinuerligt expandera eller kulturceller med hjälp av en liknande metod, men detta skulle utgöra andra utmaningar som inte påträffas för dessa studier. Om odlas under längre perioder, skulle sfäroiderna fortsätta att växa i storlek, och livskraften hos vissa celler i kärnan av sfäroid kan lida på grund av ökande närings och syrediffusion begränsningar. Dessa kulturer kan kräva ytterligare manipulationer för att dissociera stora sfäroider för att förhindra denna begränsning när långsiktiga kulturer önskas.Ingen minskning av lönsamheten observerades för sfäroider som genereras med detta protokoll, vilket tyder på att denna gräns inte nåddes under 21 dagar odlingsperioden för denna studie.

    För cellulära terapier skulle dessa tekniker användas i kombination med ytterligare regleringssystem för att förbättra cellutbyte, funktion och viabilitet. Till exempel kan SSB metoden kombineras med lätta tekniker inklusive mikro bärarytan kulturer för vidhäftande celler för att förbättra celltillväxthastigheter, eller inkapsling av celler eller sfäroider. Vidare kan mer komplexa justeringsalgoritmer implementeras för att ge hårdare kultur kontroll. Utfodring justering skulle kunna kombineras med kontroll av flera andra parametrar, såsom pH, koncentration av löst syre, temperatur, och injektion av reagens för att göra ytterligare förbättringar 59,60. Att förbättra resultaten i andra program, kan denna metod automatiseras 15,24, och matningshastighet kan beräknas mmalm eller mindre ofta, ytterligare raffinering odlingsbetingelser.

    Tillverkningsprocesser 61-63 måste definieras och kontrolleras noggrant för att göra reproducerbara biologiska produkter. Användningen av kontinuerliga mediet ersättning kan användas för att dämpa fluktuationer i kritiska näringsämnen som observerats i storskalig cellproduktionen, och innefattande en justerbar matningssystem kan genomföra ännu mer kontroll på cellmiljön, för att upprätthålla önskade nivåer av näringsämnen. Den beskrivna metoden kan användas med andra däggdjursceller för både cellulära och farmaceutiska produkter.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    β TC-6 Cells ATCC, Manassas, VA CRL-11506 Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type)
    DPBS No Ca, No Mg Invitrogen, Carlsbad, CA 14190-144 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    Dulbecco's Modified Eagles Medium Invitrogen, Carlsbad, CA See below for product numbers 
    DMEM High Glucose (500 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11965-092 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM) Invitrogen, Carlsbad, CA 11885-084 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate)
    L-glutamine Invitrogen, Carlsbad, CA 25030081 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    Sodium Pyruvate Invitrogen, Carlsbad, CA 11360070 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Porcine Serum Gibco - Life Technologies 10082147 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTA Invitrogen, Carlsbad, CA 25200056 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 Tissue Culture Treated Flasks Corning, Corning, NY 430825 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire Cell culture incubator Princeton, MN US Autoflow. Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used.
    Centrifuge Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used)
    Refrigerator Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies)
    1 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-1L Any vendor could be used. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L Glass Bottle Corning, Corning, NY 1395-2L Any vendor could be used
    250 ml stirred bioreactors  Corning, Corning, NY 4500-250 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences)
    &categoryname=
    Stir Plate Fisher Scientific 11-496-104A Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor
    Tissue Culture Dishes 100 mm Diameter Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) 1256598  Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci)
    FALCON 50 ml Conical Tubes Falcon, San Jose, CA 1256598 Any vendor could be used
    Delran Plastic Used for Custom Parts McMaster Carr Various Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac
    Stainless Steel Pipe for custom lids McMaster Carr Various Any vendor could be used. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91
    Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding Custom made Not aware of any vendors producing a similar product
    Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding Custom made Some vendors (e.g., Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below.
    Masterflex Digital Peristaltic Pump Cole Parmer, Vernon Hills, IL EW-77919-25 Any precision peristaltic pump could be used. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various) Cole Parmer, Vernon Hills, IL see link Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-16 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-14 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13 Cole Parmer, Vernon Hills, IL WU-06508-13 Any vendor could be used. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    Millipore Millex GP PES membrane 0.22 µl sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) Fisher Scientific SLGP033RS Any vendor could be used
    25 ml Graduated Pipette Fisher Scientific 13-678-11 Any vendor could be used, and various sizes may be used
    Pipetter Fisher Scientific 13-681-15E Any vendor, or similar product could be used
    Hemocytometer Fisher Scientific 02-671-6 Any vendor, or similar product could be used
    Trypan Blue Gibco - Life Technologies 15250-061 Any vendor, or similar product could be used. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061
    Inverted Light Microscope Leica Any vendor, or similar product could be used
    One Touch Ultra Blood Glucose Meter Fisher Scientific 22-029-293 Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)
    One Touch Ultra-Strips Fisher Scientific 22-029-292  Any vendor, or similar product could be used (e.g., Bayer)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Reuveny, S., Velez, D., Macmillan, J. D., Miller, L. Factors affecting cell growth and monoclonal antibody production in stirred reactors. J. Immunol. Methods. 86 (1), 53-59 (1986).
    2. Tarleton, R. L., Beyer, A. M. Medium-scale production and purification of monoclonal antibodies in protein-free medium. Biotechniques. 11 (5), 590-593 (1991).
    3. Weegman, B. P., et al. Nutrient regulation by continuous feeding removes limitations on cell yield in the large-scale expansion of Mammalian cell spheroids. PLoS One. 8 (10), e76611 (2013).
    4. Klueh, U., et al. Continuous glucose monitoring in normal mice and mice with prediabetes and diabetes. Diabetes Technol. Ther. 8 (3), 402-412 (2006).
    5. Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
    6. Dazey, B., Duchez, P., Letellier, C., Vezon, G., Ivanovic, Z. Cord blood processing by using a standard manual technique and automated closed system "Sepax" (Kit CS-530). Stem Cells Dev. 14 (1), 6-10 (2005).
    7. Gastens, M. H., et al. Good manufacturing practice-compliant expansion of marrow-derived stem and progenitor cells for cell therapy. Cell Transplant. 16 (7), 685-696 (2007).
    8. Naing, M. W., Williams, D. J. Three-dimensional culture and bioreactors for cellular therapies. Cytotherapy. 13 (4), 391-399 (2011).
    9. Stacey, G. N. Cell culture contamination. Cancer Cell Culture. , Methods Mol Biol; 731. Humana Press. Totowa, NJ. 79-91 (2011).
    10. Zur Nieden, I. N., Cormier, J. T., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Embryonic stem cells remain highly pluripotent following long term expansion as aggregates in suspension bioreactors. J. Biotechnol. 129 (3), 421-432 (2007).
    11. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Scalable stirred-suspension bioreactor culture of human pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 16 (2), 405-421 (2010).
    12. Krawetz, R., et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 16 (4), 573-582 (2010).
    13. Shafa, M., et al. Expansion and long-term maintenance of induced pluripotent stem cells in stirred suspension bioreactors. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (6), 462-472 (2012).
    14. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2 (3), 219-230 (2009).
    15. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
    16. Baptista, R. P., Da Fluri,, Zandstra, P. W. High density continuous production of murine pluripotent cells in an acoustic perfused bioreactor at different oxygen concentrations. Biotechnol. Bioeng. 110 (2), 648-655 (2013).
    17. Papas, K. K. Characterization of the metabolic and secretory behavior of suspended free and entrapped ART-20 spheroids in fed-batch and perfusion cultures [dissertation]. , Georgia Institute of Technology. Atlanta, GA. (1992).
    18. Papas, K. K., Constantinidis, I., Sambanis, A. Cultivation of recombinant, insulin-secreting AtT-20 cells as free and entrapped spheroids. Cytotechnology. 13 (1), 1-12 (1993).
    19. Sambanis, A., Papas, K. K., Flanders, P. C., Long, R. C., Kang, H., Constantinidis, I. Towards the development of a bioartificial pancreas: immunoisolation and NMR monitoring of mouse insulinomas. Cytotechnology. 15 (1-3), 351-363 (1994).
    20. Sharma, S., Raju, R., Sui, S., Hu, W. -S. Stem cell culture engineering - process scale up and beyond. Biotechnol. J. 6 (11), 1317-1329 (2011).
    21. Papas, K. K., Long, R. C., Constantinidis, I., Sambanis, A. Role of ATP and Pi in the mechanism of insulin secretion in the mouse insulinoma betaTC3 cell line. Biochem. J. 326 (Pt 3), 807-814 (1997).
    22. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: I. long-term propagation and basal and induced secretion from entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 219-230 (1999).
    23. Papas, K. K., Long, R. C., Sambanis, A., Constantinidis, I. Development of a bioartificial pancreas: II. Effects of oxygen on long-term entrapped betaTC3 cell cultures. Biotechnol. Bioeng. 66 (4), 231-237 (1999).
    24. Hu, W. S. Cell culture process monitoring and control-a key to process optimization. Cytotechnology. 14 (3), 155-156 (1994).
    25. Alfred, R., et al. Efficient suspension bioreactor expansion of murine embryonic stem cells on microcarriers in serum-free medium. Biotechnol. Prog. 27 (3), 811-823 (2011).
    26. Cormier, J. T., zur Nieden, N. I., Rancourt, D. E., Kallos, M. S. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng. 12 (11), 3233-3245 (2006).
    27. Dang, S. M., Zandstra, P. W. Scalable production of embryonic stem cell-derived cells. Methods Mol. Biol. 290 (1), 353-364 (2005).
    28. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. Int. J. Artif. Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
    29. Kallos, M. S., Behie, L. A. Inoculation and growth conditions for high-cell-density expansion of mammalian neural stem cells in suspension bioreactors. Biotechnol. Bioeng. 63 (4), 473-483 (1999).
    30. Kehoe, D. E., Lock, L. T., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Propagation of embryonic stem cells in stirred suspension without serum. Biotechnol. Prog. 24 (6), 1342-1352 (2008).
    31. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell Stem Cell. 3 (4), 369-381 (2008).
    32. Serra, M., et al. Stirred bioreactors for the expansion of adult pancreatic stem cells. Ann. Anat. 191 (1), 104-115 (2009).
    33. Chawla, M., Bodnar, C. A., Sen, A., Kallos, M. S., Behie, L. A. Production of islet-like structures from neonatal porcine pancreatic tissue in suspension bioreactors. Biotechnol. Prog. 22 (2), 561-567 (2006).
    34. Weegman, B. P., et al. Temperature profiles of different cooling methods in porcine pancreas procurement. Xenotransplantation. , (2014).
    35. Cruz, H. J., Moreira, J. L., Carrondo, M. J. Metabolic shifts by nutrient manipulation in continuous cultures of BHK cells. Biotechnol. Bioeng. 66 (2), 104-113 (1999).
    36. Dowd, J. E., Jubb, A., Kwok, K. E., Piret, J. M. Optimization and control of perfusion cultures using a viable cell probe and cell specific perfusion rates. Cytotechnology. 42 (1), 35-45 (2003).
    37. Goudar, C., Biener, R., Zhang, C., Michaels, J., Piret, J., Konstantinov, K. Towards industrial application of quasi real-time metabolic flux analysis for mammalian cell culture. Cell Culture Engineering. 101, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol; 101. Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 99-118 (2006).
    38. Hu, W. S., Piret, J. M. Mammalian cell culture processes. Curr. Opin. Biotechnol. 3 (2), 110-114 (1992).
    39. Knaack, D., et al. Clonal insulinoma cell line that stably maintains correct glucose responsiveness. Diabetes. 43 (12), 1413-1417 (1994).
    40. Poitout, V., Stout, L. E., Armstrong, M. B., Walseth, T. F., Sorenson, R. L., Robertson, R. P. Morphological and functional characterization of beta TC-6 cells--an insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
    41. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22 (1), 7-14 (1996).
    42. Suzuki, R., et al. Cyotomedical therapy for insulinopenic diabetes using microencapsulated pancreatic beta cell lines. Life Sci. 71 (15), 1717-1729 (2002).
    43. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
    44. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
    45. Murdoch, T. B., McGhee-Wilson, D., Shapiro, A. M. J., Lakey, J. R. T. Methods of human islet culture for transplantation. Cell Transplant. 13 (6), 605-617 (2004).
    46. Woodside, S. M., Bowen, B. D., Piret, J. M. Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors. Cytotechnology. 28 (1-3), 163-175 (1998).
    47. Serra, M., et al. Improving expansion of pluripotent human embryonic stem cells in perfused bioreactors through oxygen control. J. Biotechnol. 148 (4), 208-215 (2010).
    48. Gálvez, J., Lecina, M., Solà, C., Cairó, J., Gòdia, F. Optimization of HEK-293S cell cultures for the production of adenoviral vectors in bioreactors using on-line OUR measurements. J. Biotechnol. 157 (1), 214-222 (2012).
    49. Trabelsi, K., Majoul, S., Rourou, S., Kallel, H. Development of a measles vaccine production process in MRC-5 cells grown on Cytodex1 microcarriers and in a stirred bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (3), 1031-1040 (2012).
    50. Liu, H., et al. A high-yield and scaleable adenovirus vector production process based on high density perfusion culture of HEK 293 cells as suspended aggregates. J. Biosci. Bioeng. 107 (5), 524-529 (2009).
    51. Zhi, Z., Liu, B., Jones, P. M., Pickup, J. C. Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing beta-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin. Biomacromolecules. 11 (3), 610-616 (2010).
    52. Lock, L. T., Laychock, S. G., Tzanakakis, E. S. Pseudoislets in stirred-suspension culture exhibit enhanced cell survival, propagation and insulin secretion. J. Biotechnol. 151 (3), 278-286 (2011).
    53. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), e262 (2007).
    54. Campos, C. Chronic hyperglycemia and glucose toxicity: pathology and clinical sequelae. Postgrad. Med. 124 (6), 90-97 (2012).
    55. Eve, D. J., Fillmore, R., Borlongan, C. V., Sanberg, P. R. Stem cells have the potential to rejuvenate regenerative medicine research. Med. Sci. Monit. 16 (10), RA197-RA217 (2010).
    56. Hsiao, L. -C., Carr, C., Chang, K. -C., Lin, S. -Z., Clarke, K. Review Article: Stem Cell-based Therapy for Ischemic Heart Disease. Cell Transplant. , (2012).
    57. Oldershaw, R. A. Cell sources for the regeneration of articular cartilage: the past, the horizon and the future. Int. J. Exp. Pathol. 93 (6), 389-400 (2012).
    58. De Coppi, P. Regenerative medicine for congenital malformations. J. Pediatr. Surg. 48 (2), 273-280 (2013).
    59. Tziampazis, E., Sambanis, A. Modeling of cell culture processes. Cytotechnology. 14 (3), 191-204 (1994).
    60. Sidoli, F. R., Mantalaris, A., Asprey, S. P. Modelling of Mammalian cells and cell culture processes. Cytotechnology. 44 (1-2), 27-46 (2004).
    61. Yim, R. Administrative and research policies required to bring cellular therapies from the research laboratory to the patient’s bedside. Transfusion. 45, Suppl 4. 144S-158S (2005).
    62. Fink, D. W. FDA regulation of stem cell-based products. Science. 324 (5935), 1662-1663 (2009).
    63. Moos, M. Stem-cell-derived products: an FDA update. Trends Pharmacol. Sci. 29 (12), 591-593 (2008).

    Tags

    Bioteknik glukos närings reglering kontinuerlig matning omrörd suspension bioreaktor expansion sfäroid kultur bioreaktor
    Närings förordning genom kontinuerlig matning för storskalig utbyggnad av däggdjursceller i sfäroider
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash,… More

    Weegman, B. P., Essawy, A., Nash, P., Carlson, A. L., Voltzke, K. J., Geng, Z., Jahani, M., Becker, B. B., Papas, K. K., Firpo, M. T. Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids. J. Vis. Exp. (115), e52224, doi:10.3791/52224 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter