Abstract
采集和全血样本的处理在非临床环境提供了一个独特的机会来评价社区居住的人有和没有既往病史。这些样品的快速处理是必不可少的，以避免关键细胞成分的降解。这里包括用于同时外周血单核细胞（PBMC），DNA方法，RNA和从在跨首都圈同意参加者的家中进行的单一血液抽取血清隔离，与处理2小时内收集的启动。我们已经使用了这些技术来处理超过1600的血标本产生一致的，高品质的材料，后来被用在成功的DNA甲基化，基因分型，基因表达和流式细胞仪分析。一些采用的方法是标准;然而，当在所描述的方式相结合，它们使样品的高效的处理从与人口和/或社区的参与者基础的研究谁也不会在临床环境通常进行评估。因此，该协议具有以获得样本（以及随后的数据），该比较有代表性的普通人群的潜力。
Introduction
多项研究特征的基因表达，DNA甲基化和细胞亚群中的血液有和没有精神（或其它）毛病1-4个体间的差异。这些研究中，但是，已经从其中疾病相关的差异可能由于对哪个患者寻求治疗的疾病的一般更严重的自然放大临床环境获得。由于“组学”方法的进步，在过去十年的利息获得来自社区和/或流行病学设置5-7个生物样品，以提供疾病患病率人群为基础的估计爆炸和在一个更广阔的画面这些心理和/或身体疾病的环境因素。
这方面的一个主要挑战是对采集标本的快速处理的要求。单核细胞，关键免疫系统组件是frequentl降解ÿ用于评估个体的健康，立即开始在抽血用2小时收集8-10的后一个显著下降恢复。为了应对这一挑战，我们提出了一个优化的协议，其中全血多个组件同时从生活在大都市圈科目家庭获得的样品中分离。该协议是基于我们的汇编和当前技术，包括存储在事件未来技术允许进一步隔离所有的“额外”的级分的修饰/分析。而替代方法或试剂盒可以代替这里描述的各个方法，这些概述可以采用已被证明是用于在高通量的方式处理样品的可靠和有效的手段。高品质的级分（PBMC中，脱氧核糖核酸，血清，和RNA）的新鲜血液，可以在2小时收集的和所有的测定就绪标本制作可在2 天 （图1可）。
该协议的开发，使以社区为住宅，进行测试底特律邻里健康研究在底特律市的成年居民收集的样本有效地处理（DNHS; DA022720，RC1MH088283，DA022720-05-S1），以人口为基础研究创伤后应激障碍（PTSD）等精神疾病的社会和生物决定因素。创伤后应激障碍的底特律患病率超过全国平均数的两倍11,12。确定创伤后应激障碍的生物因素在这一人群可能有助于制定相应的药物和/或认知行为干预措施，以帮助那些来自错乱，无论是在这个城市的人口，而在其他高危人群 （如，返回退伍军人）。我们的实验室，以前位于韦恩州立大学在底特律，密歇根州，被选定为基于我们的专业知识在处理来自各种来源的新鲜组织标本处理来源，有必要开始2小时内收集处理的样品，并背靠集合地点。手头这次难得的机会，我们的目标是优化处理，从每个样本的DNA，RNA，血清和外周血单个核细胞（PBMC）中的最大收益率（总N = 1639的样品超过5浪标本采集）。这里所概述的程序，可以在非临床环境同时进行，由此产生用于多种下游应用，包括微阵列，后生，实时RT-PCR起始材料（见表1为平均产量），和流式细胞仪分析。
图1.整体工作流程。这里描述的整个过程包括取得血液样本的物流，从确定同意participants血液绘制自身。高品质的，级分（外周血单核细胞;外周血，脱氧核糖核酸，血清，和RNA）的新鲜全血可以在2小时收集的产生以及所有测定就绪标本可在2天内使用。而且，通过这种方法制得的级分都适合长期储存，如果样本不被立即测试。这里列出的整个时间线可以在一天内（〜5小时计）内完成。然而，这样的天将是极为劳动密集特别是对于具有与技术相当的经验的单个技术员。因此，我们建议分在第一天的过程至少有两名技术人员之间并完成第2天的RNA加工请点击此处查看该图的放大版本。
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Protocol
底特律邻里健康研究进行了审查并批准了密歇根州的机构审查委员会的大学。所有参加者只要之前，他们在参与研究的知情同意书。
1.概述
- 正确记录从招聘的各个阶段通过端点数据的分析。执行第1天同时协议，交换级和重叠时间允许。级的顺序被写入，以优化性能效率。 图1提供了整个过程的概述。
注：术语，“参与者”被用于整个来表示从个人同意的画去鉴定的血样。下面括号中的时间表示动手的时间。跟踪片和试样日志的实例可以在补充表S1和S2中找到，分别。样品通过在家庭抽血收集确定为快递同意参加由研究协调，并运送到实验室的个人（ 见补充信息（SI）1作进一步预处理的细节）的。
2.第1天安装
- 制备1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 预热加热块到56ºC。
- 通过等分20微升到离心管当天的交付（每个参与者）相应的数字准备蛋白酶（见SI 2）。
- 确保缓冲器AW1和AW2（在DNA提取试剂盒可提高DNA的纯度提供洗涤液），准备使用，增加100％的乙醇作为在标签上标明，如果必要的。
- 降温冷冻离心机到4℃。
- 替换在瓶子上的1×PBS的与所提供的橡胶隔帽盖和刺穿橡胶隔膜的转送穗，保持在转印的spi顶部的螺丝帽柯以防止蒸发。重复与瓶子的核糖核酸稳定溶液。
- 下列制剂的缓冲剂，离心机和热块，记录对样品跟踪片的vacutainer交货的时间（见表SI）。
3.第1天：处理全血样品的DNA，外周血单个核细胞和白细胞RNA（2小时）
- 概观
- 分配足够的时间，以尽量减少抽血和处理开始时刻之间的延迟。开始聚蔗糖含真空采血管的处理内2小时抽血，以避免增加红血细胞污染和在单核细胞回收的降低。
- 假设集合2真空采血管含有聚蔗糖梯度凝胶，2，K 2乙二胺四乙酸（EDTA）真空采血管，以及每位成人与会者1血清真空采血管。交货时的真空采血管的实验室，有技术人员签字样本的跟踪表标志着验收。求与记录在每个真空采血管基础上，试件日志的开始时间立即处理。
- 血清的分离阶段1（1分钟）
- 文件开始时间上的样本数（ 见表SI 2）。离心机（与制动和加速关）使用吊桶式转子与气雾剂帽7.0毫升血清（红色）的vacutainer（1每位与会者）（生物安全级别2; BSL2认证）20分钟，1300×g离心，4ºC。
- DNA分离阶段1（15分钟）
注：有关此分离过程的详细信息，请参阅制造商的协议13。- 文件开始时间。在一个BSL2细胞培养罩，转化含有聚蔗糖凝胶5倍然后添加200微升的全血从真空采血管中的一个的顶部到每个的蛋白酶的两个20微升等份（400微升总每位与会者）的真空采血管。离开蛋白酶+血的离心管在引擎盖，继续执行CENTRIfugation含有步骤3.4.1真空采血管的聚蔗糖的。
注意：使用真空采血管具有最大集合体积，牢记平衡离心机（也就是说，它可能有必要从每两个真空采血管的去除200微升）在步骤3.4.1纺丝真空采血管时的必要性。此外，为了确保蓝色真空采血管的处理期间适当分离，血液残留在真空容器的水平不应小于2.5英寸的聚蔗糖层上方。
- 文件开始时间。在一个BSL2细胞培养罩，转化含有聚蔗糖凝胶5倍然后添加200微升的全血从真空采血管中的一个的顶部到每个的蛋白酶的两个20微升等份（400微升总每位与会者）的真空采血管。离开蛋白酶+血的离心管在引擎盖，继续执行CENTRIfugation含有步骤3.4.1真空采血管的聚蔗糖的。
- PBMC的分离阶段1（1分钟）
- 记录的开始时间（必须在2小时抽血，以避免增加红血细胞污染和在单核细胞回收减少）包含真空采血管的8-10倍.Invert聚蔗糖。离心机（带刹车和油门关闭），使用吊桶式转子气溶胶帽（BSL2认证）30分钟，1600 XG，22℃下的真空采血管（每个参与者）。
- 返回到引擎盖，并添加200微升缓冲AL每个蛋白酶+血的离心管（步骤3.3.1）的。盖，从发动机罩卸下，涡旋15秒，闪光灯旋转。
- 孵育56ºC在热块中，10分钟。
- 从加热块中取出试管。闪光旋转。返回到BSL2罩。加入200μl100％乙醇。盖，从发动机罩卸下，涡旋15秒，闪光灯旋转。其余的步骤可以在罩的外面完成。
- 适用溶胞产物（内步骤3.5.3的30分钟），以标记的旋转柱（在2 ml收集管中）。关闭盖子通过气溶胶，以避免交叉污染。离心机6000 XG，1分钟。
- 丢弃包含滤液收集管，并放置在旋转柱在新的2ml收集管中。
- 加入500μlBuffer AW1于列，而不润燥的边缘，盖上，离心6000 XG，1分钟。
- 丢弃包含FILTRA收集管德并将旋转柱在新的2ml收集管中。
- 加入500μlBuffer AW2到列不润燥的边缘，盖上，离心20000 XG，3分钟。
- 丢弃包含滤液收集管，并放置在旋转柱在一个新的1.5 ml收集管（未包括在试剂盒），和离心机20000×g离心，1分钟。
- 丢弃包含滤液收集管，并放置在旋转柱在一个新的1.5 ml收集管（未包括在试剂盒）。
- 加入200μl缓冲液AE或水到每个列和在室温下孵育5分钟。离心机6000 XG，1分钟。
- 重复步骤3.5.11洗脱到同一个收集管。
- 游泳池，距离每名参与者的2列洗脱的DNA。总产量〜800元参与者微升。
- 使用分光光度计当时间允许定量样品。
- 根据需要于2ml冷冻管，记录在specime每个浓度等分试样的DNA的n log。转移冻存管到一个cryobox和地点在-80℃长期储存。文档冰柜开始时间。
注意：请在生物安全2级认证的细胞培养罩。有关此隔离详见制造商的说明15。
- 皮尔斯K 2 EDTA真空采血管有转移尖峰的橡胶隔膜。保留外皮和螺丝帽在步骤3.6.11使用。继BSL2标准的做法，应注意避免接触血源性病原体。
- 附加白滑连接器到转印穗的顶部。
- 标记滤波器与相应参与者的ID则过滤器的入口（扩口端）连接到白滑连接器。
- 附加的过滤器的护套25⅝ģ针到出口（锥形端）。准备过滤器组件交付前加快了程序，因此，附加的白滑连接器传输秒杀，加入过滤器，然后在护套针和设置的组件，培养管架，直至使用，值得推荐。
- 以下的K 2 EDTA管系统的组装，安全地出鞘针（使用金属刮刀的末端）。刺针插入一个空10毫升真空采血管（血清接收管）和反转的K 2 EDTA真空采血管/过滤器/接收器管组件。继BSL2标准的做法，应注意避免接触血源性病原体。
- 允许直到过滤器的楔形部分已清除血血液过滤通过。过滤需要约2分钟，在过滤期间可以放置在一个试管架上。
- 取下组装过滤器。离开包含在滤液中的管针和丢弃整个组件在尖锐物容器。
- 附加一个5毫升注射器向转印穗上的瓶的1×PBS的，在在用vert瓶，并撤销3毫升
- 附用PBS注射器到过滤器的入口和冲洗过滤器（3-5滴每秒）。收集流过的生物废料容器。分离来自过滤器的注射器，而不缩回柱塞。
- 过滤后和一个PBS洗涤，使用新的5mL注射器，并且在步骤3.6.8中描述的方法撤回3毫升RNA稳定剂。冲洗过滤如在步骤3.6.9。在RNA稳定剂应保持在过滤器上。分离来自过滤器的注射器，而不缩回柱塞。
- 密封该过滤器的入口和出口与护套和螺帽从转印道钉离开用RNA稳定剂的饱和的过滤器保留。该过滤器可以存储在这一点上。存储过滤在-80ºC到时间允许（〜2小时），完成步骤5.3至5.4.7。
注：储存在-80ºC长达一年采集后的过滤器没有增减已处理SE在RNA的质量。
- 从离心机（步骤3.4.1）拆下菲含真空采血管，并继续在BSL2罩。真空采血管应显示分离如在图2中，如果不是， 见表 2。
- 一旦真空容器被返回到BSL2罩，除去塞子和撤回1.5使用血清吸管顶端，淡黄，血浆层（图2）中的溶液没有得到接近单核（透明/白色）层。 （2真空采血管池 - - 1参与者）的等离子转移到5ml的离心管。记录收集的体积。请参阅存储说明的步骤3.7.6。
注意：最好分开和最伟大的外周血单个核细胞的产量来自于谁禁食至少12个小时，在采血前的参与者。 - 转移剩余的血浆和白色，单核层（所有的凝胶层以上- 图2）U唱血清吸管，到15ml锥形管中，汇集从每两个聚蔗糖含有每参与者真空采血管的单个核层到一个锥形管中。
- 加入1×PBS中，使在锥形管中的总体积至15ml。盖上盖子并翻转5倍。离心机（带刹车和油门关闭）15分钟，300 XG，22℃。
- 返回在引擎盖的菲含真空采血管，并用5¾“巴斯德吸管周围流转，松开聚蔗糖凝胶层的外面，如果可能的话将其删除收集的红血细胞（红细胞）。使用血清吸管收集和红细胞（约为4.5毫升）转移至5ml的离心管。记录收集的体积。
- 两个5 ml的冷冻管（等离子体在步骤3.7.2和红细胞在步骤3.7.5）转移到一个受控速率冷冻集装箱，并把在-80ºC至少24小时后，此时可以将它们转移至cryobox并返回到-80ºC用于长期存储。
- 返回合作nical管罩，当在步骤3.7.4离心是完整的，并且吸出所有但〜500微升的PBS，而不会干扰沉淀。 PBMC收率大于如果〜200微升PBS留沉淀在这个阶段以上。
- 添加新鲜的1×PBS使体积至10ml。轻轻悬浮颗粒。盖上盖子并翻转5倍。离心机（带刹车和油门关闭）10分钟，300 XG，22℃。
注意：请在BSL2罩。
- 从分装在真空采血管血清前血清层，离心后（步骤3.2.1），于2ml冻存管的期望。典型产量是2.5毫升（ 表1）。日志的卷。例如，使用4冷冻管等分200μl的冷冻管入1，1000微升到离心管2，然后除以剩余的冷冻管入3和4。
- 转移到离心管一个cryobox和地点在-80ºC用于长期贮存。文件冰柜启动时间。
- 返回到发动机罩，离心分离（步骤3.7.8），并吸出尽可能多的上清液/ PBS作为可能的后不干扰沉淀。悬浮颗粒吹打于2.5毫升外周血单个核细胞冻存液1（见SI 2）。
- 添加2.5 ml的PBMC的冷冻培养基2（参照SI 2），以在步骤3.9.1细胞/培养基溶液。轻轻涡旋。
- 分装10微升细胞溶液到0.65 ml离心管（进一步稀释可能是必要的）。加入10微升0.4％台盼蓝染色为0.65 ml离心管中，吹打混匀数次。更多详情请参见制造商的手册16。
- 吸取10微升混合物的导入细胞计数室滑动件和地方滑进细胞计数器内混合3分钟。放大和聚焦的单元格。按“细胞计数”来获取外周血单个核细胞计数。
- 等分试样中，如果可行的PBMC数目大于每毫升3百万细胞（MC / ml）的，根据需要进冷冻管并继续到步骤3.9.9。商店的PBMC中高达5的冷冻管在至少3 MC / ml的每种的浓度。
- 如果可行的PBMC数量低于3 MC /毫升，通过乘以可行MC /毫升由5毫升计算细胞总数。除以该数乘以4，3，2或1毫升，以便将有至少一个管具有3 MC /毫升。
- 离心锥形管包含细胞/冷冻介质5分钟，在300×g离心（制动和加速OFF）溶液。离心后，吸的冷冻介质（上清液）适当体积离开上述（4，3，2或1毫升）中计算出的体积。
- 重悬沉淀，在剩余的上清液和等分至少3 MC /毫升到冷冻管（1-4）的适当数目以1毫升/冷冻管。最后冷冻介质是10％二甲基亚砜（DMSO）/ 20％胎牛血清（FBS）/ 70％罗斯韦尔园区纪念研究所（RPMI）1640。
- 解决的文耳鼻喉科每个离心管的细胞计数。转移到离心管的受控速率冷冻集装箱，并把在-80ºC至少24小时之后将冷冻管可以被转移到一个cryobox并放入液氮罐（气相），用于长期存储。文档冰柜启动的时间。
4.第2天安装
- 加热的不含核酸酶的0.1毫摩尔EDTA等分试样（每滤波器220微升）在一个无核酸管至80℃的热块。
- 制备洗涤溶液1和2（见SI 2）。
5.第2天：长期样品储存及白细胞过滤处理（3小时）
- 概述。
- 6个月的白细胞到过滤器的应用中执行此过程。
注意：总的来说，第2天的处理时间约3小时，虽然它被标记为“第2天”的关键要求是，滤波处理部应于一天的时被执行有在实验室中发生的任何1天的处理。
- 6个月的白细胞到过滤器的应用中执行此过程。
- 长期样品储存（15分钟）
- 每天执行此过程中，交付新的真空采血管实验室进行1天的处理之前。传输该被储存的O / N的受控速率冷冻集装箱在第1天的冷冻管入适当标记cryoboxes，并将它们返回到-80ºC或液态氮（气相），用于长期存储。组织根据样品类型（例如，DNA，PBMC，红细胞等 ），以加速样品位置跟踪端点分析的冷冻管。
- 白细胞的RNA的过滤器处理中（45分钟）。
注：有关此过程的详细信息，请参阅生产商的说明17。- 把过滤器RT（解冻约5分钟）。
- 除去所述护套和螺丝帽从过滤器。缩回5毫升注射器的柱塞和其连接到过滤器的入口（扩口端），压下柱塞驱逐RNA稳定剂 从过滤口进入生物废料的容器。
- 装入新的5mL注射器用4ml用于RNA分离的酚和异硫氰酸胍溶液，并将它附加到过滤器的入口，压下柱塞以冲洗通过过滤器的溶液，收集裂解物中的标记的15毫升锥形管（2％的参与者）。
- 从过滤器上断开注射器，缩回柱塞，它重新连接到过滤器，并压下柱塞以排出收集在过滤器的磁盘残差采样到同一的15毫升锥形管中。丢弃过滤器和注射器。
- 加入800微升BCP的锥形管，收管紧密，大力摇晃准备，持续30秒。
- 在室温下孵育5分钟。离心机在2000×g下10分钟。
- 水性（顶部）相转移到新鲜标记的15毫升锥形管（〜2.5毫升）中。
- 加入的无核酸酶水的水相的0.5倍体积ð拌匀。再加入1.25倍的100％乙醇的含水量，并再次混合。
注意：对于2.5毫升的水的体积，增加1.25不含核酸酶的水毫升，混匀，再加入4.7毫升100％的乙醇（2.5毫升×0.5 = 1.25毫升无核酸酶的水，然后2.5毫升+ 1.25毫升等于3.75毫升新水容积THEN 3.75毫升×1.25 = 4.7 ml的100％乙醇）。这个步骤允许包含小RNA级分的总RNA分离。 A到忽略从隔离的小RNA的方法可以在手册17上找到。 - 从5毫升注射器中取出柱塞和在原处插入旋转筒。附加盒/注射器组件到真空歧管。供到真空歧管更安全的连接，将墨盒/注射器组件内的1.5 ml离心管与底切断。
- 从步骤5.3.8至纺丝筒慢慢地用在真空应用样品，小心地添加更多的样品，因为它是通过盒拉出。
注：如果没有真空现在，看到http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf离心法。 - 自旋盒转移到1.5 ml离心管，并添加洗1.离心机750微升自旋盒/管组件5 - 10秒以12,000×克。
- 从管丢弃滤液和自旋盒返回到相同的离心管中。
- 加入洗净2离心机的750微升旋转筒/管5 - 10秒12,000×g的。弃滤液作为步骤5.3.12。返回自旋盒相同的离心管中。
- 与其他750微升2洗净和离心时，重复步骤5.3.13。弃滤液。返回自旋盒相同的离心管中。离心纺丝筒/管以最大速度1分钟以干燥过滤器。
- 旋转筒转移到一个新的，标记为1.5微升离心管中。
- 加入200微升不含核酸酶的0.1毫摩尔EDTA（预热到80＆＃176℃）的旋筒式过滤器（每个参与者）的中心。在室温下孵育1分钟。
- 离心1分钟，在12000×g离心，以洗脱RNA。保留滤液。丢弃旋筒。
- 斯普利特各200微升滤液分为二，100微升等分到新的1.5 ml离心管中，标签和保持在冰上。在这一点上，从每个与会者2过滤器将得到每名参赛者RNA四个100微升等份。
- DNase处理（1小时）
注：有关此处理的详细信息请参阅制造商的协议18。- 通过将10微升的DNA酶我缓冲区和2微升rDNase我每等分+ 1（以弥补移液错误）创建一个主结构。
注意：对于四个样品，100微升等分使用50微升的DNA酶我缓冲区+ 10微升rDNase I. - 分装12微升的预混步骤5.4.1到每个RNA等分的步骤5.3.18中，轻轻混匀。在37°下，在加热块30分钟。
- 旋涡DNA酶失活试剂，并添加11.2微升到每个等份，混合均匀。在室温下孵育2分钟温育过程中涡旋的2-3倍。
- 离心在10,000rpm xg离心1.5分钟。
- 上清液（RNA）转移到一个新的1.5毫升管。从同一个参与者等分试样可以在这里汇集。
- 运行在分光光度计每个样品得到的浓度。使用生物分析仪（见步骤5.5）建议在RNA的质量分析。
- 分装成RNA作为冷冻管所需。如果一个生物分析仪分析将不会立即等分进行1.5微升样品放入离心管用于以后的分析。记录浓度和冷冻开始时间。样品储存在-80℃。
- 通过将10微升的DNA酶我缓冲区和2微升rDNase我每等分+ 1（以弥补移液错误）创建一个主结构。
- 生物分析仪分析（1小时）
- 按照制造商的协议19。当运行完成后，数据自动存储，但再次保存它瓦特第i个更小的，更容易识别的文件名。预期的结果（图3）：阶梯应 具有6峰，样品应当具有3个峰（在44秒和50秒，分别并在25秒1早期标记物峰2的核糖体的峰）。
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Representative Results
至关重要的是，在整个过程生产出高品质的材料进行分析，在众多的下游应用，包括通过微阵列和RT-PCR分析基因表达，检测表观遗传修饰，和细胞亚群的变化。 表1表示的平均产量的材料和质量从每个过程。 图3提供的白细胞RNA分离和滤波处理方法的质量输出的一个例子。关于图3的左上方的图像是从毛细管电泳所得的凝胶图像。每个通道应该产生两个不同的频段以最小的阴影这显示降解。凝胶下面的色谱提供额外看看退化可以基于峰的位置和大小来确定的水平和类型。的RNA完整性（RIN）是另一种质量度量是范围从1（低;退化）到10（高纯，质量好RNA）。
这样的高通量的方法适合于偶尔错误，但也有几个检查站整个处理的各阶段，以确保质量控制。 图2显示适当分离，以下含真空采血管的Ficoll离心。有几个原因一个真空容器可能不显示这种分离包括离心速度，低收集容积，或缺乏一个禁食参与者的误差，如表2所示。
使用此过程中分离标本的子集（N = 100）进行了分析与HumanMethylation27（HM27）DNA分析BeadChip芯片，包括那些结果焦磷酸测序11验证成功。基因分型，有针对性的亚硫酸氢盐焦磷酸测序，和实时RT-PCR法已在怀尔德曼和乌丁实验室20,21,22,23被成功执行。血清中分离出杆等位基因与DNA分离为两个BeadChip芯片和基因分型分析，为IL-6和C反应蛋白活性24被成功地进行分析。从分离的PBMC的T细胞亚群已经成功通过流式细胞术分析25-28。此外，来自改性白细胞过程的RNA已进行基因组范围的基因表达图谱29。
图2.分离层以下菲含真空采血管的离心多种血液成分离心后分离的可视化。单核层进一步提纯而其他层储存在-80℃。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.预期结果的白细胞RNA加工，生物分析结果显示表示18S和28S核糖体RNA与RNA的完整性号码（RINS）上述8分离所描述的白细胞RNA分离和过滤处理方法（参见协议3.6和5.3），两种不同的频段。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 总平均收益率（N≈500） | 平均质量 | |
| 血清 | 2.30毫升 | N / A |
| 从全血的DNA | 39.97微克 | 吸光度260/280 = 1.74 |
| PBMC | 22250000活细胞 | 在整体的隔离至少95％的存活率 |
| 从白细胞RNA | 44.09微克 | 吸光度260/280 = 2.01 RNA完整性（RIN）= 6.48 |
表1.预期产量。平均量和样品的质量进行处理使用所描述的方法。
| 问题 | 可能的解决方案 |
| 菲含真空采血管离心后无分离 | 真空采血管没有满额 - 有足够的处理最低收集量为6毫升 |
| 检查离心机的设置，可以肯定的速度在G力。如果不正确，设置为G力和重新流片。 | |
| 低PBMC合作UNT | 血容量画得太小。 |
| 吸气太靠近粒料在步骤3.7.8 | |
| 非禁食参与者。 | |
| 真空采血管血清离心后无分离 | 检查离心机的设置，可以肯定的速度在G力。如果不正确，设置为G力和重新流片。 |
| 使用的NanoDrop 1000意外浓度 | 确保测量是合适的样品类型 （例如，DNA或RNA）。 |
表2.故障排除与所描述的方法和可能的解决方案的常见问题。
补充表1.跟踪表。来回跟踪的真空采血管的例子米采血实验室交付。 请点击这里查看此表。
补充表2.样品日志。用于运送到实验室后，记录下真空采血管的处理文档的一个例子。 请点击这里查看此表。
补充表3.冷冻管编号系统。用于每个参与者的编号系统的一个例子。 请点击这里查看此表。
补充资料1，预处理的细节。细节的研究协调员，快递和放学医师的职责。 请点击此处查看补充资料1。
补充信息2.食谱，食谱所需试剂的列表。 请点击此处查看补充资料2。
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Discussion
我们描述了一个精简的协议，已成功地应用于处理超过1600的全血样本底特律邻里健康研究进展。虽然许多这些技术可在现有的文献中，我们的一步一步汇编，包括每个步骤之间精确计时的改变，反映了成功地生产各种生物样本具有广泛的下游应用的优化，高效的协议，包括DNA甲基化，表达和免疫学分析。这些标本已经在各种实验，结果其中已发表 在同行评审文献和/或提出了在国家会议11,20,21,23,24,29了测试。因此，该协议应该会感兴趣的其他研究人员试图采集生物标本在类似DNHS人群为基础的研究。
当处理在这样的高throughp样品UT的方式，这是最重要的是在各个阶段保持准确的记录。我们建议开发一个数据库来存储所有的离心管信息在一开始就。该数据库应包括样品的各冷冻管内的所有方面，包括体积，浓度，质量，条码，和存储位置（存储箱编号和位置中的框）。我们建议准备预先标记的离心管和储物盒含有条形码。此外，我们已经发现合宜的是具有包含条形码对于每个管，具体到每一个参加者（表S3）一个“主”的文件。这使冷冻管数据到数据库中的快速输入而不过度处理样品，引入不必要的冷冻/解冻循环的样品，并消除了对在手动输入在条形码人为错误的可能性。这也是至关重要的是，唱片公司坚持在极端（ 例如，汽液氮-178至-150期℃）的温度。的文档可能是耗时，并与高效的处理的交付时的必要性，我们已发现，具有至少两个技师分割过程产生最大的效率。
这种方法的一个限制是实验室到收集站的附近。对于PBMC隔离尤其，样品必须在2小时收集处理以避免显著增加红血细胞污染和减少存活的单核细胞。因此，实验室应不超过30分钟，从一个收集地点以考虑可能出现的任何交通有关的问题。此外，任何实验室提出承接此处概述将需要在手边两名技术以确保最佳的样品处理的协议。此外，每个实验室必须访问所需设备为上述每一个步骤。因此，用较少的员工和/或有限的设备②实验室乌尔德很可能无法承担这一协议。
此协议的一个优点是能够在同意的个人的家直接采集标本的能力。这使得研究达到与谁也不会通常寻求也许是因为缺乏保险或运输医疗救助，心理或其他健康问题的人。这也使得居住谁也经历过类似的触发器，但不同的心理健康方面的症状在同一社区内的影响和不受影响的个体进行比较。以这种方式获得的标本，需要在现场抽血的精确定时和协调。因为我们的实验室位于我们正在研究在社区内，一个抽血一般都可以采集样本来自两个三口之家，并提供样品到实验室的第一个集合的2小时范围内。效率是关键，我们的来样加工，正因为如此，我们曾在多个抽血场，增加了需要精确的协调。该实验室获得多个血液交货，每运送多达八个参与者间隔2小时开。在抽血会见了在指定位置，并结合自己的藏品只有一个抽血提供样品到实验室为一个批次。此处描述的方法可以很容易地适应研究许多其他表型，并收集可在众多下游测定中所使用的生物样本。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的利益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25 G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2 ml and 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
- Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder. Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).
- Weigelt, K., et al. TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors. Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).
- Robertson, M. J., et al. Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression. Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).
- Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder. J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).
- Klengel, T., et al. Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions. Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).
- Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors. Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).
- Smith, B. H., et al. Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness. Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).
- Mallone, R., et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).
- Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression. J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).
- Debey, S., et al. Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types. Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).
- Uddin, M., et al. Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).
- Kessler, R. C., Wang, P. S. The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States. Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).
- Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea (2010).
- Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from: http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8 (2010).
- Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf (2011).
- Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess (2009).
- Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html (2011).
- Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from: http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf (2012).
- Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from: http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf (2006).
- Koenen, K. C., et al. SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder. Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).
- Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples. J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).
- Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).
- Sipahi, L., et al. Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder. Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).
- Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample. Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).
- Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).
- Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
- Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).
- Bustamante, A. C., et al. Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).
