Abstract
Collecte et traitement des échantillons de sang entier dans un cadre non clinique offre une occasion unique d'évaluer les personnes vivant dans la communauté à la fois avec et sans conditions préexistantes. Le traitement rapide de ces échantillons est essentiel pour éviter la dégradation des composants cellulaires clés. Inclus ici sont des méthodes pour simultanée périphérique cellules mononucléaires du sang (CMSP), l'ADN, l'ARN et l'isolement de sérum provenant d'un simple prélèvement de sang effectué dans les maisons des participants consentants dans une région métropolitaine, avec la transformation engagées dans les 2 heures de la collecte. Nous avons utilisé ces techniques pour traiter plus de 1.600 échantillons de sang rendement, des matériaux de haute qualité constante, qui a ensuite été utilisé dans succès méthylation de l'ADN, le génotypage, l'expression génique et la cytométrie en flux analyses. Certaines des méthodes employées sont la norme; Cependant, lorsqu'ils sont combinés de la manière décrite, ils permettent un traitement efficace des échantillons provenant de participants Population- et / ou communautaireétudes fondées qui ne seraient normalement pas être évaluées dans un cadre clinique. Par conséquent, ce protocole a le potentiel d'obtenir des échantillons (données) et par la suite qui sont plus représentatives de la population générale.
Introduction
De multiples études ont caractérisé les différences d'expression génique, méthylation de l'ADN et de sous-ensemble de cellules dans le sang chez les personnes avec et sans mentale (ou autre) des maladies 1-4. Ces études, cependant, ont été obtenus à partir des paramètres cliniques dans lesquels les différences associées à des maladies peuvent être amplifiées en raison de la nature généralement plus sévère des maladies pour lesquelles les patients sont à la recherche de traitement. Grâce aux progrès de «omiques» les approches, la dernière décennie a vu une explosion d'intérêt pour obtenir des échantillons biologiques à partir de paramètres épidémiologiques 5-7 communauté et / ou, dans le but de fournir des estimations fondées sur la population de prévalence de la maladie et une image plus large de la déterminants environnementaux de ces maladies mentales et / ou physiques.
Un défi clé à cet égard est l'obligation pour le traitement rapide des échantillons prélevés. La dégradation des cellules mononucléaires, des composants du système immunitaire qui sont frequentl clésy utilisé pour évaluer la santé d'un individu, commence immédiatement après la prise de sang avec une diminution significative de la récupération après 2 heures de la collecte 8-10. Pour relever ce défi, nous présentons un protocole optimisé dans lequel de multiples composants de sang humain entier sont simultanément isolés à partir d'échantillons obtenus dans les maisons de sujets vivant dans une grande région métropolitaine. Le protocole est basé sur notre compilation et la modification des techniques actuelles, y compris le stockage de toutes les fractions «extra» dans le cas des techniques futures permettent davantage d'isolement / analyse. Bien que les méthodes ou des kits de remplacement peuvent être utilisés à la place des méthodes individuelles décrites ici, ceux décrits se sont révélés être un moyen fiable et efficace pour le traitement des échantillons de manière à haut débit. Fractions de haute qualité (CMSP, l'ADN, sérum, et ARN) de sang frais peuvent être produites dans les 2 heures de collecte et de tous les spécimens d'analyse prêts peuvent être disponibles dans les 2 jours (Figure 1).
Ce protocole a été développé pour permettre le traitement efficace des échantillons prélevés dans la communauté-logement, les résidents adultes de la ville de Detroit pour les essais dans le Health Study Quartier Detroit (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1), un repose-population étude des déterminants sociaux et biologiques du trouble de stress post-traumatique (SSPT) et d'autres maladies mentales. La prévalence du SSPT dans Detroit est plus de deux fois la moyenne nationale 11,12. Identifier les déterminants biologiques de stress post-traumatique dans cette population peut aider à développer pharmacologique approprié et / ou interventions cognitivo-comportementales pour aider ceux qui souffrent de la maladie, à la fois dans cette population urbaine, et dans d'autres populations à haut risque (par exemple, le retour des vétérans militaires). Notre laboratoire, précédemment situé à Wayne State University de Detroit, au Michigan, a été choisi pour le traitement basée sur notre expertise dans la manipulation des échantillons de tissus frais dérivés d'une variétédes sources, la nécessité de commencer à traiter les échantillons dans les 2 heures de la collecte, et notre proximité avec les sites de collecte. Avec cette occasion unique à portée de main, notre objectif était d'optimiser le traitement pour le plus grand rendement de l'ADN, l'ARN, le sérum et des cellules mononucléées du sang périphérique (CMSP) de chaque spécimen (un total de N = 1.639 échantillons de plus de 5 vagues de collecte de l'échantillon). Les procédures décrites ici peuvent être effectuées simultanément dans un cadre non-clinique, produisant ainsi un matériau (voir le tableau 1 pour les rendements moyens) de départ pour une multitude d'applications en aval, y compris microréseau, épigénétique, en temps réel RT-PCR et cytométrie de flux analyses.
Figure 1. flux de travail global. Le processus global représenté ici comprend la logistique de l'obtention des échantillons de sang de l'identification partic consentantspants au sang se dessinent. De haute qualité, des fractions (cellules mononucléaires du sang périphérique; PBMC, de l'ADN, le sérum, et de l'ARN) de sang entier frais peut être produite à l'intérieur de 2 heures et collecte tous les échantillons d'essai en main peut être disponible dans les 2 jours. En outre, les fractions préparées par ce procédé conviennent pour le stockage à long terme ne sont pas si les échantillons à tester immédiatement. L'ensemble du calendrier décrite ici pourrait être achevée en une seule journée (~ 5 h total). Cependant, une telle journée serait extrêmement laborieux surtout pour un seul technicien avec expérience considérable avec les techniques. Ainsi, nous recommandons de diviser les procédures le jour 1 entre au moins deux techniciens et l'achèvement du traitement de l'ARN du Jour 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
L'Étude sur la santé Detroit Quartier a été examiné et approuvé par l'Université de l'Institutional Review Board du Michigan. Tous les participants ont donné leur consentement éclairé avant leur participation à l'étude.
1. Présentation
- Bien documenter toutes les étapes de recrutement grâce à l'analyse des données de point de terminaison. Effectuez les protocoles de la Journée 1 simultanément, étages de commutation et chevauchant le temps le permet. La séquence des étapes est écrit pour optimiser l'efficacité de la performance. La figure 1 donne un aperçu de l'ensemble du processus.
Note: Le terme «participant» est utilisé partout pour signifier l'échantillon de sang prélevé identifiés à partir d'une personne consentante. Les durées entre parenthèses ci-dessous indiquent le temps de manipulation. Des exemples de la feuille de suivi et le journal de l'échantillon peuvent être trouvés dans les tableaux complémentaires S1 et S2, respectivement. Les échantillons sont prélevés par des phlébotomistes dans les maisonsdes individus identifiés comme participants consentants par le coordinateur de l'étude et transportés au laboratoire par un courrier (voir Complément d'information (SI) 1 pour plus de détails de pré-traitement).
2. Jour 1 Setup
- Préparer une solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS).
- Préchauffer un bloc thermique à 56 ° C.
- Préparer la protéase (voir TR 2) en aliquotant 20 pi dans le nombre approprié de microtubes pour les livraisons de la journée (2 par participant).
- Assurez-tampons AW1 et AW2 (Les tampons de lavage fournies dans le kit d'isolement d'ADN qui augmentent la pureté de l'ADN) sont prêts à l'emploi, en ajoutant 100% d'éthanol comme indiqué sur l'étiquette, le cas échéant.
- Refroidir centrifugeuse réfrigérée à 4 ° C.
- Replacez le bouchon sur la bouteille de 1x PBS avec le fourni septum de caoutchouc et percer le bouchon en caoutchouc avec un pic de transfert, en conservant le bouchon à vis sur le dessus du spi de transfertke pour éviter l'évaporation. Répéter l'opération avec la bouteille de solution de stabilisation de l'ARN.
- Après la préparation du bloc tampons, centrifugeuse et de la chaleur, de documenter le moment de la livraison de vacutainer sur la feuille de suivi de l'échantillon (voir tableau SI).
3. Jour 1: Traitement échantillon de sang entier pour l'ADN, l'ARN CMSP et des leucocytes (2 h)
- Vue d'ensemble
- Ménager le temps nécessaire pour réduire au minimum le délai entre le prélèvement de sang et l'heure de début de traitement. Commencez traitement des vacutainers Ficoll contenant moins de 2 h de prélèvement de sang pour éviter une augmentation de la contamination de globules rouges et une diminution de la récupération des cellules mononucléaires.
- Supposons collection de 2 vacutainers contenant Ficoll gradient de gel, 2 K 2 acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) vacutainers, et 1 sérum vacutainer par participant adulte. Lors de la livraison des vacutainers au laboratoire, demandez à un technicien de signer la fiche de suivi acceptation signifiant des échantillons. Mendierdans le traitement immédiatement et l'heure de début documentée sur une base par vacutainer sur le journal de spécimen.
- Sérum Isolation Etape 1 (1 min)
- DOCUMENT Le temps de démarrage dans le journal de l'échantillon (voir le tableau 2 SI). Centrifugeuse (avec frein et d'accélération OFF) le Vacutainer 7,0 ml de sérum (rouge) (1 par participant) en utilisant un rotor à godet oscillant avec des bouchons en aérosols (niveau de biosécurité 2; BSL2 certifié) pendant 20 min, 1300 xg, 4 ºC.
- Isolement de l'ADN Etape 1 (15 min)
Remarque: Pour plus de détails sur cette procédure d'isolement, consultez le protocole du fabricant 13.- Documenter l'heure de début. Dans une culture capot de cellules de BSL2, inverser les tubes vacutainer contenant le gel de Ficoll 5 fois puis ajouter 200 ul de sang entier à partir de la partie supérieure de l'un des tubes vacutainer dans chacun des deux 20 aliquotes de la protease (400 au total ul par participant). Laissant les protéase + centrifuger le sang tubes dans la hotte, continuer à les Centrifugation du Ficoll contenant vacutainers à l'étape 3.4.1.
Remarque: Utilisez le vacutainer avec le plus grand volume de collecte, en gardant à l'esprit la nécessité d'équilibrer la centrifugeuse (ie, il peut être nécessaire de retirer 200 pi de chacun des deux vacutainers) quand on tourne les vacutainers à l'étape 3.4.1. En outre, afin d'assurer une séparation correcte pendant le traitement des tubes vacutainer bleu, le niveau de sang restant dans le Vacutainer ne doit pas être inférieure à 2,5 pouces au-dessus de la couche de Ficoll.
- Documenter l'heure de début. Dans une culture capot de cellules de BSL2, inverser les tubes vacutainer contenant le gel de Ficoll 5 fois puis ajouter 200 ul de sang entier à partir de la partie supérieure de l'un des tubes vacutainer dans chacun des deux 20 aliquotes de la protease (400 au total ul par participant). Laissant les protéase + centrifuger le sang tubes dans la hotte, continuer à les Centrifugation du Ficoll contenant vacutainers à l'étape 3.4.1.
- L'isolement des PBMC Etape 1 (1 min)
- Documenter l'heure de début (doit être à moins de 2 h de prélèvement de sang pour éviter une augmentation de la contamination de globules rouges et une diminution de la récupération des cellules mononucléaires) .Invert Ficoll contenant vacutainers 8-10 fois. Centrifugeuse (avec frein et d'accélération OFF) les vacutainers (2 par participant) en utilisant un rotor à godet oscillant avec des bouchons d'aérosols (BSL2 certifié) pendant 30 min, 1600 xg, 22 ° C.
- Retour à la hotte et ajouter 200 pi de tampon AL à chacun des tubes protéase + centrifuger le sang (étape 3.3.1). Cap, retirer du capot, vortex 15 sec et le flash de spin.
- Incuber 56 ºC dans un bloc de chaleur, 10 min.
- Retirer les tubes du bloc thermique. Flash de spin. Retour à la hotte de BSL2. Ajouter 200 ul d'éthanol à 100%. Cap, retirer du capot, vortex 15 sec et le flash de spin. Les étapes restantes peuvent être effectuées à l'extérieur de la hotte.
- Appliquer lysat (à moins de 30 min de l'étape 3.5.3) dans une colonne de spin marqué (dans un tube collecteur de 2 ml). Fermez le bouchon pour éviter la contamination croisée par des aérosols. Centrifugeuse 6000 xg, 1 min.
- Jeter le tube collecteur contenant l'effluent et placer la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml.
- Ajouter 500 pi de tampon AW1 dans la colonne sans humidification de la jante, fermer le bouchon, et centrifuger 6000 xg, 1 min.
- Jeter le tube collecteur contenant l'FiltraTE et placer la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml.
- Ajouter 500 pi de tampon AW2 dans la colonne sans humidification de la jante, fermer le bouchon, et centrifuger 20.000 xg, 3 min.
- Jeter le tube collecteur contenant l'effluent et placer la colonne spin dans un nouveau tube collecteur de 1,5 ml (non inclus dans le kit), et centrifuger 20.000 xg, 1 min.
- Jeter le tube collecteur contenant l'effluent et placer la colonne spin dans un nouveau tube de 1,5 ml de collecte (non inclus dans le kit).
- Ajouter 200 ul de tampon AE ou d'eau pour chaque colonne et incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifugeuse 6000 xg, 1 min.
- Répétez l'étape 3.5.11 élution dans le même tube de collecte.
- Piscine La ADN élue parmi les 2 colonnes par participant. Rendement total ~ 800 pi par participant.
- Quantifier les échantillons à l'aide d'un spectrophotomètre quand le temps le permet.
- ADN Aliquoter que désiré en cryotubes de 2 ml, de documenter la concentration de chacun sur le specimen journal. Transfert cryofioles à un cryobox et lieu à -80 ° C pour le stockage à long terme. Documenter l'heure de début de congélateur.
Remarque: Effectuez dans un certifié hotte de culture de cellules de niveau de biosécurité 2. Pour plus de détails sur cet isolement voir les instructions du fabricant 15.
- Percer la membrane de caoutchouc de l'EDTA Vacutainer K 2 avec une aiguille de transfert. Conserver la gaine et bouchon à vis pour une utilisation dans l'étape 3.6.11. Après pratiques standard BSL2, prendre soin d'éviter l'exposition à des agents pathogènes transmissibles par le sang.
- Fixez le connecteur de engobe blanc au sommet de l'aiguille de transfert.
- Etiqueter le filtre avec l'ID de participant correspondant alors relier l'entrée (d'extrémité évasée) du filtre au connecteur d'engobe blanc.
- Attacher une aiguille G 25⅝ gaine à la sortie (extrémité conique) du filtre. Préparation de l'ensemble de filtre avant la livraison accélère considérablement le processus et, par conséquent,fixer le connecteur engobe blanc à la pointe de transfert, en ajoutant le filtre, puis l'aiguille gainée et la mise l'ensemble dans un rack tube de culture jusqu'à l'utilisation, il est recommandé.
- Après l'assemblage du système de tubes d'EDTA K 2, dégainer en toute sécurité l'aiguille (utiliser l'extrémité d'une spatule en métal). Poignarder l'aiguille dans un tube de 10 ml de collecte de sang évacué vide (tube récepteur de sérum) et inverser l'assemblage de tube K 2 EDTA Vacutainer / filtre / récepteur. Après pratiques standard BSL2, prendre soin d'éviter l'exposition à des agents pathogènes transmissibles par le sang.
- Laisser le sang de filtrer à travers jusqu'à ce que les sections en forme de coin du filtre ont dégagé de sang. Filtration prend environ 2 min et peut être placé dans un porte-tube à essai pendant la filtration.
- Retirez le filtre de l'Assemblée. Laissez l'aiguille dans le tube contenant le filtrat et jeter tout l'ensemble dans un récipient Sharps.
- Joindre une seringue de 5 ml à la pointe de transfert sur la bouteille de PBS 1x, dansVert la bouteille, et de retirer 3 ml.
- Fixer la seringue avec du PBS à l'entrée du filtre et rincez le filtre (3-5 gouttes par seconde). Recueillir l'écoulement dans un conteneur de déchets biologiques. Détachez la seringue du filtre sans rétracter le plongeur.
- Après filtration et un lavage PBS, 3 ml de retirer l'agent de stabilisation de l'ARN en utilisant une nouvelle seringue de 5 ml et le procédé décrit dans l'étape 3.6.8. Rincer le filtre comme à l'étape 3.6.9. L'agent de stabilisation de l'ARN doit rester sur le filtre. Détachez la seringue du filtre sans rétracter le plongeur.
- Sceller l'entrée du filtre et la sortie de la gaine et bouchon à vis retenu de la pointe de transfert sortant du filtre saturé d'agent de stabilisation de l'ARN. Le filtre peut être stocké à ce point. Conservez le filtre à -80 ºC jusqu'à le temps le permet (~ 2 h) pour compléter les étapes 5.3 à 5.4.7.
Remarque: Les filtres stockés à -80 ° C pendant jusqu'à un an après la collecte ont été traitées sans decreaen soi la qualité de l'ARN.
- Retirez les contenant vacutainers Ficoll de la centrifugeuse (étape 3.4.1) et continuer dans une hotte de BSL2. Vacutainers devraient afficher séparation comme dans la figure 2. Si non, voir le tableau 2.
- Une fois le vacutainer est retourné à la hotte de BSL2, retirez le bouchon et retirer 1,5 ml de haut, jaunâtre, couche de plasma (Figure 2) à l'aide d'une pipette sérologique sans avoir à proximité de la mononucléaires (/ blanc clair) couche. Transférer le plasma pour 5 ml cryovial - (Piscine de 2 vacutainers - 1 participant). Connectez le volume collecté. Voir l'étape 3.7.6 pour les instructions de stockage.
Note: La meilleure séparation et plus grands rendements de CMSP proviennent de participants qui ont à jeun au moins 12 heures avant la collecte de sang. - Transférer le plasma restant et la couche blanchâtre mononucléaires (tout au-dessus de la couche de gel - Figure 2) uune pipette sérologique chanter, à un tube conique de 15 ml, la mise en commun de la couche de mononucléaires de chacun des deux tubes vacutainer contenant de Ficoll par participant dans un tube conique.
- Ajouter 1x PBS pour amener le volume total dans le tube conique de 15 ml. Tube de Cap et inverser 5 fois. Centrifugeuse (avec frein et d'accélération OFF) 15 min, 300 xg, 22 ° C.
- Retour à la contenant vacutainers Ficoll dans la hotte et de recueillir les globules rouges (hématies) en utilisant un "pipette 5¾ Pasteur à tourbillonner autour et desserrer l'extérieur de la couche de gel Ficoll et le retirer si possible. Utilisez une pipette sérologique de collecter et de transférer les hématies (~ 4,5 ml) à 5 ml Cryovial. Connectez le volume collecté.
- Transférer les deux 5 ml cryovials (plasma à l'étape 3.7.2 et les globules rouges à l'étape 3.7.5) à un taux conteneur de congélation contrôlée et de mettre à -80 ºC pendant au moins 24 heures, après quoi ils peuvent être transférés à un cryobox et retournés à -80 ºC pour le stockage à long terme.
- Retour le coTube nique à la hotte, lorsque la centrifugation à l'étape 3.7.4 est terminée, et aspirer tous, mais ~ 500 pi du PBS sans perturber le culot. CMSP rendement est plus grande si ~ 200 pi de PBS est laissé dessus du culot à ce stade.
- Ajouter 1x PBS frais pour porter le volume à 10 ml. Reprendre le culot doucement. Tube de Cap et inverser 5 fois. Centrifugeuse (avec frein et d'accélération OFF) 10 min, 300 xg, 22 ° C.
Remarque: Effectuez dans une hotte de BSL2.
- Aliquoter la couche supérieure de sérum du vacutainer de sérum, après la centrifugation (étape 3.2.1), en 2 ml de cryotubes souhaitée. Rendement typique est de 2,5 ml (tableau 1). Connectez le volume. Par exemple, utiliser 4 cryovials aliquotant 200 pi en cryovial 1, 1000 ul dans cryovial 2 puis divisez le reste dans cryovials 3 et 4.
- Transférer les tubes cryogéniques à un cryobox et lieu à -80 ºC pour le stockage à long terme. Documenter le début du congélateurtemps.
- Retour à la hotte, après centrifugation (étape 3.7.8), et aspirer autant surnageant / PBS que possible sans perturber le culot. Resuspendre le culot par pipetage dans 2,5 ml CMSP milieu de congélation 1 (voir SI 2).
- Ajouter 2,5 ml CMSP milieu de congélation 2 (voir TR 2) à la solution de la cellule / support à l'étape 3.9.1. Vortex doucement.
- Aliquote de 10 ul de la solution de cellules dans 0,65 ml d'un tube de microcentrifugation (dilution supplémentaire peut être nécessaire). Ajouter 10 ul de 0,4% trypan bleuissement dans le tube de 0,65 ml à centrifuger et mélanger par pipetage à plusieurs reprises. Pour plus de détails, voir le manuel du fabricant 16.
- Pipet 10 pi du mélange dans une cellule lame de comptage de chambre et le lieu glisser dans le compteur de cellules à moins de 3 min de mélange. Zoom avant et concentrer les cellules. Appuyez sur «Compter les cellules" pour obtenir compter CMSP.
- Aliquoter, si la viabilitéNuméro PBMC est de plus de 3 millions de cellules par millilitre (mc / ml), comme souhaité dans cryovials et passez à l'étape 3.9.9. CMSP de magasins à un maximum de 5 cryotubes à une concentration d'au moins 3 mc / ml chacune.
- Si le nombre est inférieur à PBMC viables 3 mc / ml, calculer le nombre total de cellules viables en multipliant le mc / ml par 5 ml. Diviser ce nombre par 4, 3, 2 ou 1 ml de sorte qu'il y aura au moins un tube avec trois mc / ml.
- Centrifugeuse tube conique contenant les cellules / solution milieu de congélation pendant 5 min à 300 g (frein et d'accélération OFF). Après centrifugation, aspirer le volume approprié de milieu de congélation (surnageant) en laissant le volume calculé ci-dessus (4, 3, 2 ou 1 ml).
- Reprendre le culot dans le surnageant restant et aliquote au moins 3 mc / ml dans le nombre approprié de tubes cryogéniques (1-4) à 1 ml / cryovial. Milieu de congélation finale est de 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) / 20% de sérum fœtal bovin (FBS) / 70% Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640.
- DocumEnt le nombre de cellules par tube cryogénique. Transférer les tubes cryogéniques à un taux conteneur de congélation contrôlée et de mettre à -80 ºC pendant au moins 24 heures, après quoi les cryotubes peuvent être transférés à un cryobox et mis dans un réservoir d'azote liquide (phase vapeur) pour le stockage à long terme. Document de congélateur heure de début.
4. Jour 2 Setup
- Chauffer une partie aliquote (220 ul par filtre) de nuclease libre EDTA 0,1 mM dans un tube sans nuclease à 80 ° C dans un bloc chauffant.
- Préparer des solutions de lavage 1 et 2 (voir SI 2).
5. Jour 2: Stockage de longue durée de l'échantillon et de traitement de filtrage des leucocytes (3 h)
- Vue d'ensemble.
- Effectuez cette procédure dans les 6 mois de l'application des leucocytes au filtre.
Remarque: Dans l'ensemble, Jour 2 traitement dure environ 3 heures et alors qu'il est étiqueté «Jour 2," l'exigence clé est que la partie de traitement de filtre doit être effectué sur un jour oùil n'y a pas de traitement Jour 1 survenant dans le laboratoire.
- Effectuez cette procédure dans les 6 mois de l'application des leucocytes au filtre.
- Stockage d'échantillons à long terme (15 min)
- Effectuez cette procédure tous les jours, avant la livraison de nouveaux vacutainers au laboratoire pour le Jour 1 de traitement. Transférer les tubes cryogéniques qui ont été stockées O / N dans des contenants de gel des taux contrôlés le jour 1 en cryoboîtes correctement étiquetés et les retourner à -80 ºC ou de l'azote liquide (phase vapeur) pour le stockage à long terme. Organiser les cryotubes en fonction du type de l'échantillon (par exemple, l'ADN, CMSP, globules rouges, etc.) afin d'accélérer l'emplacement de l'échantillon suivi pour les tests finaux.
- Leucocytes Filtres d'ARN traitement (45 min).
Remarque: Pour plus d'informations sur cette procédure voir les instructions du fabricant 17.- Porter le filtre à la température ambiante (environ 5 min décongélation).
- Retirer la gaine et bouchon à vis du filtre. Rétracter le piston d'une seringue de 5 ml et le connecter à l'entrée (d'extrémité évasée) du filtre, appuyer sur le pistonà expulser l'agent de stabilisation de l'ARN à partir des ports de filtre dans un conteneur de déchets biologiques.
- Chargez une nouvelle seringue de 5 ml avec 4 ml d'une solution d'isothiocyanate de phénol et guanidine pour l'isolement de l'ARN et l'attacher à l'entrée du filtre, appuyer sur le piston pour vider la solution à travers le filtre, recueillir le lysat dans un tube de 15 ml conique marqué (2 par participant).
- Déconnecter la seringue du filtre, retirer le piston, ré-attacher à le filtre, et appuyer sur le piston pour expulser l'échantillon résiduel piégé dans le disque de filtre dans les mêmes 15 ml tube conique de. Jeter le filtre et la seringue.
- Ajouter 800 ul BCP pour le tube conique, bien refermer le tube et agiter vigoureusement la préparation pendant 30 sec.
- Incuber à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger pendant 10 min à 2000 x g.
- Transférer le (sommet) d'une phase aqueuse à 15 ml tube conique fraîchement marqué (~ 2,5 ml).
- Ajouter 0,5 fois le volume de la phase aqueuse de l'eau exempte de nuclease un-D bien mélanger. Puis ajouter 1.25x le volume aqueuse d'éthanol à 100% et mélanger à nouveau.
Remarque: Pour un volume aqueux 2,5 ml, ajouter 1,25 ml d'eau sans nucléase, mélanger, puis ajouter 4,7 ml d'éthanol à 100% (2,5 ml x 0,5 = 1,25 ml nucléase l'eau libre, alors 2,5 ml + 1,25 ml = 3,75 ml nouveau volume aqueuse ALORS 3,75 ml x 1,25 = 4,7 ml 100% d'éthanol). Cette étape permet l'isolement de l'ARN total qui comprend la petite fraction de l'ARN. Une méthode d'omettre les petits ARN de l'isolement peut être trouvé dans le manuel 17. - Retirer le piston d'une seringue de 5 ml et insérez une cartouche de spin à sa place. Fixez l'ensemble cartouche / seringue à un collecteur à vide. Pour une connexion plus sécurisée au collecteur sous vide, placer l'ensemble cartouche / seringue dans un tube de centrifugation de 1,5 ml avec le fond coupé.
- Appliquer l'échantillon provenant de l'étape 5.3.8 de la cartouche d'essorage lentement avec le vide sur, ajouter avec précaution plus échantillon tel qu'il est tiré à travers la cartouche.
Remarque: Si aucun vide estActuellement, voir la méthode de centrifugation à http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf. - Transférer la cartouche de spin dans un tube de 1,5 ml et ajouter 750 ul de lavage 1. Centrifugeuse la cartouche de spin / assemblage de tubes 5 - 10 secondes à 12.000 x g.
- Jeter filtrat du tube et retourner la cartouche de spin dans le même tube à centrifuger.
- Ajouter 750 pi de Wash 2 et centrifuger la cartouche de spin / tube pendant 5 - 10 secondes à 12.000 x g. Jeter filtrat comme dans l'étape 5.3.12. Remettez la cartouche de spin dans le même tube à centrifuger.
- Répéter l'opération avec un autre 750 pi 2 de lavage et centrifugation comme dans l'étape 5.3.13. Filtrat défausse. Remettez la cartouche de spin dans le même tube à centrifuger. Centrifuger la cartouche d'essorage / tuyau à la vitesse maximale pendant 1 min à sécher le filtre.
- Transférer la cartouche de spin à une nouvelle, marquée de 1,5 microtube ul.
- Ajouter 200 pi de sans nucléase-EDTA 0,1 mM (préchauffé à 80 & #176; C) par rapport au centre du filtre à cartouche de filage (2 par participant). Incuber à température ambiante pendant 1 min.
- Centrifuger pendant 1 min à 12 000 xg pour éluer l'ARN. Conserver le filtrat. Jeter la cartouche de spin.
- Fendez chaque filtrat de 200 pi en deux, 100 ul aliquotes en frais de 1,5 ml microtubes, étiquette et garder sur la glace. À ce stade, en commençant par 2 filtres par participant donnera quatre 100 aliquotes d'ARN par participant.
- Traitement à la DNase (1 h)
Remarque: Pour plus de détails sur ce traitement voient le protocole du fabricant 18.- Créer un mélange maître en combinant 10 ul de DNase I tampon et 2 ul rDNase I par aliquote + 1 (pour tenir compte de pipetage erreur).
Remarque: Pour quatre échantillons, 100 aliquotes de 50 pi utilisent DNase I tampon + 10 pl rDNase I. - Aliquote de 12 pi de mélange maître dans l'étape 5.4.1 dans chacune des aliquotes d'ARN de l'étape 5.3.18 et mélanger délicatement. Incuber à 37° C pendant 30 minutes dans un bloc chauffant.
- Vortex DNase inactivation réactif et ajouter 11,2 pi à chaque aliquote, bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 2 min vortex 2-3 fois pendant l'incubation.
- Centrifuger à 10 000 g pendant 1,5 min.
- Transférer le surnageant (ARN) dans un nouveau tube de 1,5 ml. Aliquotes du même participant peuvent être regroupés ici.
- Exécutez chaque échantillon sur un spectrophotomètre pour obtenir la concentration. Une analyse de la qualité de l'ARN est recommandé d'utiliser un Bioanalyzer (voir l'étape 5.5).
- Aliquoter l'ARN en cryotubes souhaitée. Si une analyse Bioanalyzer ne sera pas effectuée immédiatement, aliquote de 1,5 ul d'échantillon dans un tube à centrifuger pour une analyse ultérieure. Documenter les concentrations et l'heure de début de congélateur. Conserver les échantillons à -80 ° C.
- Créer un mélange maître en combinant 10 ul de DNase I tampon et 2 ul rDNase I par aliquote + 1 (pour tenir compte de pipetage erreur).
- Analyse Bioanalyzer (1 h)
- Suivre le protocole du fabricant 19. Lorsque la course est terminée, les données sont automatiquement stockées, mais l'enregistrer à nouveau wvec un nom de fichier plus petit, plus reconnaissable. Résultats attendus (figure 3): l'échelle devraient avoir 6 sommets, les échantillons doivent avoir 3 pics (2 pics ribosomique à 44 sec et 50 sec, respectivement, et 1 pic précoce de marqueur à 25 sec).
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Representative Results
Il est essentiel que la procédure globale de produire un matériau de haute qualité pour analyse dans une multitude d'applications en aval, y compris l'expression génique par l'intermédiaire de puce à ADN et analyse par RT-PCR, la détection de modifications épigénétiques, et les variations de sous-ensembles de la cellule. Le tableau 1 indique le rendement moyen et la qualité des matériaux à partir de chacun des processus. La figure 3 donne un exemple de la sortie de la qualité des procédés de traitement d'isolement de l'ARN de leucocytes et de filtrage. L'image en haut à gauche de la figure 3 est l'image du gel résultant de l'électrophorèse capillaire. Chaque piste devrait produire deux bandes distinctes avec observation minimale qui indiquerait la dégradation. Les chromatogrammes ci-dessous le gel fournissent un regard supplémentaire au niveau et le type de dégradation qui peut être déterminé en fonction de l'emplacement et la taille des pics. Le numéro de l'intégrité de l'ARN (RIN) est une autre mesure de la qualité qui va de 1 (faible; dégradée) à10 (haute; pur, bonne ARN de la qualité).
Une telle méthodologie à haut débit se prête à une erreur occasionnelle, mais il ya plusieurs points de contrôle tout au long des différentes étapes du traitement pour assurer le contrôle de la qualité. Figure 2 affiche la séparation appropriée après centrifugation de l'vacutainer contenant Ficoll. Il ya plusieurs raisons pour lesquelles un vacutainer ne peut pas afficher cette séparation, y compris une erreur dans la vitesse de centrifugation, le volume de collecte faible, ou de l'absence d'un participant au jeûne comme indiqué dans le tableau 2.
Des sous-ensembles (n = 100) des spécimens isolés en utilisant cette procédure ont été analysées avec succès par HumanMethylation27 (HM27) Analyse BeadChips ADN, y compris la validation de ces résultats par pyroséquençage 11. Génotypage, ciblé pyroséquençage bisulfite, et en temps réel RT-PCR a été réalisée avec succès dans le Wildman et Uddin laboratoires 20,21,22,23. Sérum, isolé dans le paragrapheallel avec l'isolement de l'ADN à la fois pour le génotypage BeadChip et analyses ont été analysées avec succès pour l'IL-6 et C-réactive activité de la protéine 24. Sous-ensembles de cellules T à partir des PBMC isolées ont été analysées par cytométrie de flux avec succès 25-28. En outre, l'ARN à partir de la procédure de leucocytes modifié a été soumis à Génome l'expression du gène 29 de profilage large.
Figure 2. séparation de la couche de Ficoll après centrifugation contenant Vacutainer. Une visualisation de la séparation de plusieurs composants du sang après centrifugation. La couche de mononucléaires est encore purifiée alors que les autres couches sont conservés à -80 ° C. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Résultats attendus de traitement de l'ARN de leucocytes. Résultats Bioanalyseur affichant deux bandes distinctes représentant 18S et 28S ARN ribosomal avec des numéros de l'intégrité de l'ARN (RIN) de plus de 8 isolées avec les méthodes leucocytes décrit l'isolement de l'ARN et le filtre de traitement (voir le protocole 3.6 et 5.3). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Rendement total moyen (N≈500) | Qualité Moyenne | |
| Sérum | 2.30 ml | N / A |
| ADN à partir de sang entier | 39,97 pg | Absorbance à 260/280 = 1,74 |
| CMSP | 22,25 millions de cellules viables | Au moins 95% de viabilité isolement global |
| ARN de leucocytes | 44.09 pg | Absorbance à 260/280 = 2,01 Nombre intégrité ARN (RIN) = 6,48 |
Tableau 1. prévue des rendements. Quantité moyenne et la qualité des échantillons traités en utilisant les méthodes décrites.
| Problème | Solution possible |
| Pas de séparation après centrifugation Ficoll vacutainer contenant | Vacutainer est pas rempli à pleine capacité - le volume minimal de collecte de traitement adéquat est de 6 ml. |
| Vérifiez les paramètres de centrifugation, assurez-vous que la vitesse est dans G-Force. Si elle est incorrecte, mis à g-force et de respin. | |
| Faible co CMSPunt | Volume de sang dessiner trop faible. |
| Aspiration trop près de la pastille à l'étape 3.7.8 | |
| Participant non-jeûne. | |
| Pas de séparation de sérum après centrifugation vacutainer | Vérifiez les paramètres de centrifugation, assurez-vous que la vitesse est dans G-Force. Si elle est incorrecte, mis à g-force et de respin. |
| Concentration inattendue utilisant le Nanodrop mille | Assurez-vous que la mesure est pour le type approprié de l'échantillon (par exemple, ADN ou ARN). |
Tableau 2. Dépannage. Les problèmes fréquemment rencontrés avec les méthodes décrites et les solutions possibles.
Supplémentaires Tableau 1. feuille de suivi. Un exemple de suivre les vacutainers from collecte de sang à la livraison de laboratoire. S'il vous plaît cliquer ici pour consulter ce tableau.
Supplémentaires Tableau 2. journal des échantillons. Un exemple du document utilisé pour documenter le traitement des vacutainers lors de la livraison au laboratoire. S'il vous plaît cliquer ici pour consulter ce tableau.
Tableau complémentaire 3. Système de numérotation Cryovial. Un exemple du système de numérotation utilisé pour chaque participant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir ce tableau.
Renseignements supplémentaires 1. Les détails de prétraitement. Détails des fonctions du coordonnateur de l'étude, Courier et Phlébotomiste. S'il vous plaît cliquez ici pour afficher des informations complémentaires 1.
Renseignements supplémentaires 2. Recettes. Une liste de recettes pour les réactifs nécessaires. S'il vous plaît cliquez ici pour afficher des informations complémentaires 2.
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Discussion
Nous avons décrit un protocole simplifié qui a été appliquée avec succès pour traiter plus de 1.600 échantillons de sang total dans l'étude de la santé Detroit Quartier. Bien que nombre de ces techniques sont disponibles dans la littérature existante, notre compilation étape par étape, y compris les modifications chronométrés précisément entre chaque étape, reflète une optimisée, le protocole efficace qui produit avec succès une variété de spécimens biologiques avec une large gamme d'applications en aval, y compris méthylation de l'ADN, l'expression des ARNm et l'analyse immunologique. Ces spécimens ont déjà été testés dans une variété d'expériences, dont les résultats ont été publiés dans des revues à comité de lecture et / ou présentés lors des réunions nationales 11,20,21,23,24,29. Ce protocole devrait donc être d'intérêt pour d'autres enquêteurs cherchent à recueillir des échantillons biologiques dans les études basées sur la population similaires à l'DNHS.
Lors du traitement des échantillons dans un tel haut-throughput manière, il est de la plus haute importance de maintenir des registres précis à toutes les étapes. Nous recommandons de développer une base de données pour stocker toutes les informations cryovial au départ. Cette base de données devrait inclure tous les aspects de l'échantillon dans chaque cryovial y compris le volume, la concentration, la qualité, code à barres, et l'emplacement de stockage (stockage de numéro de boîte et la localisation dans la boîte). Nous recommandons la préparation cryovials pré-étiquetés et boîtes de rangement qui contiennent un code-barres. En outre, nous avons trouvé commode d'avoir un document «maître» contenant les codes à barres pour chaque tube, spécifiques à chaque participant (tableau S3). Cela permet l'entrée rapide des données Cryovial dans la base de données sans manipulation excessive des échantillons, l'introduction de cycles de gel / dégel inutiles aux échantillons et élimine le risque d'erreur humaine à entrer dans les codes-barres manuellement. Il est également essentiel que les étiquettes adhèrent à l'extrême (par exemple, phase vapeur de l'azote liquide à -150 -178ºC) températures. La documentation peut prendre beaucoup de temps, et avec la nécessité d'un traitement efficace lors de la livraison, nous avons constaté que, ayant au moins deux techniciens divisent les processus produit la plus grande efficacité.
Une limitation de cette méthode est la proximité du laboratoire sur le site de collecte. Pour CMSP isolement en particulier, les échantillons doivent être traités dans les 2 heures de la collecte afin d'éviter des augmentations significatives de la contamination de globules rouges et une diminution dans les cellules mononucléaires viables. En tant que tel, le laboratoire ne devrait pas être plus de 30 minutes à partir d'un site de collecte pour tenir compte de tous les problèmes liés à la circulation qui pourraient survenir. En outre, tout laboratoire propose d'entreprendre le protocole décrit ici, il faudra deux techniciens sur place pour assurer le traitement de l'échantillon optimal. En outre, chaque laboratoire doit avoir accès à l'équipement nécessaire pour chaque étape décrite ci-dessus. Ainsi, les laboratoires avec moins de personnel et / ou un équipement limité would probablement pas en mesure de procéder à ce protocole.
Un avantage de ce protocole est la capacité à recueillir des échantillons directement dans les foyers de personnes consentantes. Cela permet à l'étude pour atteindre les personnes ayant des problèmes de santé mentale ou d'autres qui ne cherchent généralement de l'aide médicale, peut-être en raison d'un manque d'assurance ou de transport. Il a également le permet la comparaison des individus affectés et non affectés vivant dans la même communauté qui ont connu déclencheurs similaires, mais diffèrent en termes de leurs symptômes de santé mentale. L'obtention de spécimens de cette manière nécessite une synchronisation précise et la coordination des phlébotomistes dans le domaine. Parce que notre laboratoire a été situé dans la communauté que nous étudiions, un préleveur pourrait typiquement prélever des échantillons à partir de deux-trois maisons et de livrer les échantillons au laboratoire dans la fenêtre de 2 heures de la première collection. L'efficacité est la clé de notre traitement de l'échantillon, et en tant que tel, nous avons eu plusieurs phlébotomistes dans ledomaine, l'augmentation de la nécessité d'une coordination précise. Le laboratoire a reçu plusieurs livraisons de sang avec un maximum de huit participants par livraison espacées de 2 heures d'intervalle. Les phlébotomistes sont réunis à un endroit désigné et ont combiné leurs collections avec un seul préleveur livraison des échantillons au laboratoire en un seul lot. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour étudier de nombreux autres phénotypes et les échantillons biologiques collectés peuvent être utilisés dans une multitude de dosages en aval.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun conflit d'intérêts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Day 1: DNA isolation |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-1L | Day 1: PBMC isolation |
| 5 ¾” Pasteur pipets | Fisher | 13-678-6A | Day 1: PBMC isolation |
| Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | Life Technologies | 10082147 | Day 1: PBMC isolation |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418-500ml | Day 1: PBMC isolation |
| RPMI Medium 1640, liquid | Invitrogen | 11875119 | Day 1: PBMC isolation |
| 0.4% trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Cell Counting Chamber | Invitrogen | C10283 | Day 1: PBMC isolation |
| Countess Automated Cell Counter or cell counting device such as a microscope and hemocytometer | Invitrogen | C10281 | Day 1: PBMC isolation |
| LeukoLOCK Fractionation & Stabilization Kit | Ambion | 1933 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| 25 G x 5/8 in. needles | Becton Dickinson | 305122 | Day 1: Leukocyte RNA isolation |
| Syringes (5 ml) | Becton Dickinson | 309646 | Days 1 and 2: Leukocyte RNA isolation |
| Denaturing Lysis Solution | Ambion | 8540G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 5 M NaCl | Life Technologies | 24740011 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| TRI Reagent | Ambion | 9738 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| Bromo-3-chloro-propane (BCP) | Sigma | B-9673 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| spin cartridges | Ambion | 10051G | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| 0.1 mM EDTA | Ambion | 9912 | Day 2: Leukocyte RNA isolation |
| DNA-free Kit | Ambion | AM1960 | Day 2: DNase treament |
| RNA 6000 Ladder | Agilent | 5067-1529 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNA 6000 Nano Series II Kit | Agilent | 5067-1511 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| RNaseZAP | Ambion | AM8782 | Day 2: Bioanalyzer analysis |
| Ethanol >99% | Sigma | E7023-500ml | |
| Isopropanol >99% | Sigma | I9516-500ml | |
| Nuclease-free ultra pure water | Invitrogen | 9938 | |
| Pipette tips (nuclease-free) | Eppendorf | 22491253 | |
| Pipetter (serological) | Eppendorf | 2223020-4 | |
| Pipetters (for volumes under 1 ml) | Eppendorf | 3120000-054 | |
| Pipettes (serological) | Fisher | 13-678-27E | |
| Controlled rate freezing containers | Nalgene | 5100-0001 | |
| Cryoboxes (to hold 2 ml and 5 ml cryovials and 1.5 ml microcentrifuge tubes) | Fisher | 03-395-464 | |
| Test tube rack | Thermo Scientific | 14-804-134 | |
| 15 ml polypropylene tubes | Fisher | 14-959-49D | |
| 1.5 ml and 0.65 microcentrifuge tubes | Fisher | 07-200-534 and 07-200-185 | |
| 2 ml and 5 ml cryovials | Fisher | 10-500-26 and 10-269-88F | |
| 8 ml CPT vacutainer | BD Biosciences | 362761 | 2 tubes |
| 6 ml K2 EDTA vacutainer | BD Biosciences | 367863 | 2 tubes |
| 8.5 ml SST vacutainer | BD Biosciences | 367988 | 1 tube |
| Vortexer | Fisher | 2215365 | |
| Dry bath incubator with heating block for microcentrifuge tubes | Fisher | 11-715-1250 | |
| Filtration/vacuum system for use within the cell culture hood | Fisher | 01-257-87 | |
| Fixed-angle rotor for microcentrifuge tubes with aerosol-tight lid | Eppendorf | 22637002 | |
| Refrigerated centrifuge with a swing-bucket rotor and aerosol-tight caps for 16 x 125 mm vacutainers and 15 ml polypropylene tubes | Eppendorf | 22628157 | 2, one does not need to be refrigerated |
| Nanodrop 2000 (recommended for accuracy of small volumes) or other spectrophotometric device | Fisher | 13-400-411 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Liquid nitrogen tank | Thermo Scientific | 11-676-56 | |
| Sharps container | Fisher | 22-037-970 | |
| Biological waste container | Thermo Scientific | 1223P52 | |
| Biosafety Level 2 certified cell culture hood | Thermo Scientific | 13-261-315 |
References
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