Introduction
Den inflammatoriske reaktion på sygdom eller skade i centralnervesystemet (CNS) er dårligt forstået, især med hensyn til vekselvirkninger mellem immun- og residente celler i vævet. Undersøgelser af disse cellulære interaktioner i rygmarven er af særlig interesse i det levende dyr. Den eneste lettilgængelige CNS hvid substans-tarmkanalen er i den dorsale kolonner i rygmarven, hvilket gør dette et vigtigt område, som at koncentrere indsatsen om at forbedre mulig eksperimentel tilgang. Disse undersøgelser har været begrænset på grund af tekniske vanskeligheder ved at få adgang til og stabilisere CNS til billeddannelse. Levende billeddannelse i rygmarven er blevet beskrevet tidligere 1-13 dog få studier har behandlet cellulær bevægelse i en rygmarvsskade over et par timer efter den første fornærmelse. Den traumatiske rygmarv læsion er et komplekst miljø, med neuroner, astrocytter, fibroblaster, NG2 progenitorceller og immunceller including microglia, neutrofiler, makrofager, T-celler, B-celler og dendritiske celler 14,15. Makrofager er undergruppen af immunceller, der er ansvarlige for fagocytose i læsionen, infiltrerer fra kredsløbet. Den rolle, som disse fagocytceller er blevet drøftet, med rapporter om, at disse celler kan tage på begge skadelige og beskyttende roller i det beskadigede væv. Disse roller spænder fra stigende sekundær axonal skovdød efter en skade, og handler på en fagocytisk måde 16-22, at tage på en sårhelende fænotype og faldende funktionelle mangler i den skadede dyr 21,23,24.
Tidligere forsøg på at skelne mellem makrofager fra mikroglia har påberåbt primært på morfologi i sundt væv. Men aktiverede mikroglia og makrofager udtrykker mange af de samme markører og vise skelnes morfologi efter skade 25-29, hvilket gør adskillelse af forskellige aktiviteter i disse celler vanskelige at studere based af disse faktorer alene 30. Disse celler kan adskilles ved differentiel ekspression af CD45 ved hjælp af flowcytometri 33,34, selv om denne fremgangsmåde er mindre anvendelige diskriminere disse celletyper in vivo. Utilizing differentiel ekspression af CCR2 og CX3CR1 i mikroglia og makrofager er også blevet undersøgt, men de dynamiske ændringer i ekspressionen af disse markører monocytter differentiere til makrofager kan komplicere nøjagtig analyse 35,36. Mikroglia er beboeren immunceller i CNS og udspringer fra blommesækken stamfædre under fosterudviklingen, mens makrofager stammer fra knoglemarv stamceller og indtaste den skadede CNS efter en fornærmelse 31,32. En alternativ metode til at bruge morfologi til at skelne disse to celletyper er at erstatte knoglemarv med stamceller fra en donor dyr udtrykker en sporbar markør i makrofager afledt fra donor stamceller samtidig med at den CNS bosiddende, Recipient afledt mikroglia. Disse knoglemarv kimære modeller er almindeligt anvendt i mange andre applikationer 37-40. Denne metode har unikke forbehold forbundet med skader integriteten af blod-hjerne-barrieren forårsaget af bestråling eller cytotoksiske lægemidler, der anvendes til at udrydde marv progenitorer i værten, og dermed begrænse dets anvendelse i visse anvendelser. For nylig er funktionelle forskelle mellem mikroglia og makrofager i CNS begynder at skelnes ved hjælp af flowcytometri gen chip array analyse og kimærisme metoder 24,26,41-44, som vil vise sig meget nyttigt i fremtiden. Selv adskille disse to celletyper fortsat vanskeligt, at forstå deres unikke funktioner er en vigtig faktor for mere målrettede behandlinger af sygdomme, der involverer både mikroglia og makrofager i CNS.
Beskrivelse af cellulære interaktioner inden rygmarven læsion er primært kommet fra undersøgelser med cellekulturmodeller. Dette er due på problemstillingerne med billedbehandling både rygmarven læsion og immunceller sammen i et levende dyr. Aktuelle gnaver modeller af rygmarvsskade af varierende art og sværhedsgrad omfatter kontusion modeller 45,46, nålestiksaktioner skader 2, rifter 47 og den dorsale kolonne crush skade her 16,18,48 beskrevet. Betændelse i hjernehinden stiger med sværhedsgraden af skade og udgør unikke udfordringer for implantation af vinduer eller operationer for seriel billeddannelse. Nogle af disse udfordringer omfatter infiltration af fagocytiske celler samt dannelsen af fibrøst væv over operationsstedet. Nogle af disse problemer kan overvindes ved at skabe mindre læsioner og dækker udsatte rygmarven med ikke-immunogen kirurgiske forbinding mellem dura og paraspinous muskler for at muliggøre efterfølgende genåbning kirurgi, som det er gjort her for at studere den dorsale søjle knusningsskade . Evnen til at afbilde kun den dorsale del af spinal ledningen begrænser også valget af skaden, da kontusion modeller primært forårsage skade på den centrale ledning, ofte skåne den mest dorsale del af den dorsale kolonner, især på tidlige tidspunkter efter skade 45,49. Derfor beskriver vi en simpel skade model, der giver en ren, gentagelig, rektangulært formet læsion, som er nyttig for både observation af cellebevægelse inden læsionen og let kvantificering af axonal position i forhold til læsionen.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyr skal opstaldes og anvendes i overensstemmelse med pasning af dyr og brug udvalg (IACUC) på institutionen. Alle procedurer, der beskrives her, er godkendt af Case Western Reserve University IACUC.
1. Transgene dyr
- Brug kommercielt tilgængelige fluorescerende reporter mus til at mærke axoner (Thy-1 YFP H) 50 og mikroglia / monocytter (CX3CR1 GFP / GFP 51, se liste over materialer). Disse mus bør intercrossed og vedligeholdes som individuelle ynglekolonier efter institutionelle dyr pleje politikker.
2. Bone Marrow kimærer
- Identificere dyr, der er mindst 8 uger gamle til anvendelse som recipientdyr.
- Placer værtsdyr i en cirkulær bestråling holde bur til formål at holde musen i stand til at sikre endnu, hele kroppen bestråling.
- Indstil timeren på et cæsium (Cs-137) strålerøret at administrere en hel-legeme stråling dosalder af 800-1.000 Rads til dyr ifølge producentens instruktioner (som er vist her, er 980 rad).
- Retur dyrene til deres bure for at hvile i mindst 4 timer.
- Vælg donordyr af passende genotype (se figur 2A) som kilden til marv progenitorceller.
BEMÆRK: De relevante donorer er dyr, der udtrykker forskellige efternavne-specifikke fluorescerende reportere fra værten til at identificere forskellige cellepopulationer, eller en af samme genotype som kontroller. - Fyld en petriskål med 70% alkohol, og en anden skål med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medier og en 40 um cellefilter gennemvædet i medierne. Fyld en 15 ml konisk rør med RPMI medier. Hold retter og rør på is.
- Sacrifice donordyrene af CO 2 kvælning efter fastlagte retningslinier. Rens hud og pels ved at gennemvæde hele dyret med 70% ethanol, indtil alle skind er våd.
- Fjern skfra nederste halvdel af dyr ved at skære rundt midtersektionen og trække huden ned over bagbenene til fuldt ud at afsløre benmusklerne.
- Fjern skinnebenet ved forreste uheldig på knæleddet at forskubbe knoglen, derefter bruge steril pincet og saks, skræl og skæres musklerne væk fra begge ender af skinneben. Placer knogle i petriskålen med alkohol op til 30 sek derefter overføre til cellefilter inde petriskålen indeholdende medier.
- Forskubbe hofteleddet og skræl væk musklerne knyttet til lårbenet placeret lårbenet kortvarigt i alkohol og derefter placere den i den samme celle si inde i skålen.
- I en vævskultur hætte anvende steril saks til at afskære begge ender af knoglerne og indsætte en 21 gauge nål på en 1 ml sprøjte ind i enden af knoglen. Skyl marven i 15 ml konisk med medier. Gentag procedurerne for de resterende knogler.
- Brug bagsiden af stemplet fra en 3 ml sprøjte, knuse knogleender i cellensi på petriskål til at udtrække flere celler.
- Placer filteret på toppen af en 50 ml konisk rør og overføre medier med aspirerede celler fra 15 ml konisk rør. Brug bagsiden af stemplet for at knuse marven for at opnå en enkelt cellesuspension. Vask 15 ml konisk rør, knoglefragmenter og cellefilter med 30 ml medier i en 50 ml konisk rør.
- Centrifuger cellerne i 5 minutter ved 500 xg for at pelletere cellerne.
- Lyse røde blodlegemer med 2 ml ammoniumklorid-kalium (ACK) lysis buffer for 2 min. Stands lysis buffer med 10 ml medium indeholdende 10% føtalt bovint serum. Centrifuger ved 500 x g i 5-10 min til pelletering.
- Vask cellerne en gang i 10 ml RPMI-medium og to gange i saltvand, centrifugering ved 500 xg i 5-10 min for at pelletere for hver vask.
- Resuspender celler til en slutkoncentration på 3 x 10 6 celler i 200 pi saltvand.
- Transfer 3 x 10 6 marvceller via haleveneinjektion i IRRadiated recipientmus.
- Placer syrnet vand (pH 3,0) i modtageren bur og tillade mus at komme sig.
BEMÆRK: Mus, der ikke transplantationen vil dø inden for 10-14 dage efter indgrebet. - Efter 8 uger kontrollere marv rekonstituering ved at undersøge perifere blod immunceller ved anvendelse af flowcytometri (figur 2B-C).
3. Dorsal Kolonne knusningsskade
BEMÆRK: Vælg passende kimære dyr eller dobbelt transgene dyr til operation på grundlag af den ønskede eksperiment. Dyr med enten mærket hjemmehørende eller knoglemarv afledte celler blev oprettet i forrige trin.
- Forbered og autoklaveres kirurgiske værktøjer, herunder rongeurs, Dumont # 4 tænger, iris saks, pincet til at holde væv, nål chauffører og sår klip.
- Forbered medicin til at administrere til musene for smerter kontrol. Bupernex og marcain er almindeligt anvendt til smerte kontrol. Brug passende medicin efter behov ennd godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
- Fremkald anæstesi med 4% isofluran og vedligeholde med 1-2% isofluran at opnå en vejrtrækning på 60-100 vejrtrækninger per minut. Anvend øjet smøremiddel til dyrets øjne for at forhindre tørhed under anæstesi og bekræft manglende reaktion fods knivspids. Temperaturen ved hjælp af en varmepude og overvåge temperaturen ved hjælp af en rektal sonde.
- Barber bagsiden af musen med en elektrisk barbermaskine over målrettet rygmarv niveau, og derefter svaber området tre gange med povidon-iod efterfulgt af to gange med 70% alkohol. Placer dyret på et sterilt afdækningsstykke og dækker dyret med en anden steril afdækning med et hul skåret i et passende sted for at visualisere det kirurgiske sted. Vedligehold alle værktøjer på sterile forhæng hele operationen.
- Skær huden langs midterlinjen på det ønskede spinal niveau med iris saks at eksponere muskel på bagsiden af dyret.
- Under en dissecting mikroskop, skære rygmuskler, herunder trapezius og ledbånd i latissimus dorsi langs midterlinjen, hvor de tillægger den dorsale spinal processer, og udsætte rygsøjlen.
- Fjern rotator musklerne mellem dorsale og tværgående processer hvirvlen at afsløre lamina af den specifikke ryghvirvel, der skal fjernes (T11 i dette tilfælde). Identificer T11 ved indsættelse af det sidste ikke-flydende ribben på denne proces.
- Indsæt tips af rongeurs i rummet over og under processen, der skal fjernes, og løft lidt for at sikre, at de er sikkert på plads omkring rygsøjlen lamina men ikke for dybt til at skade ryggen. Luk rongeurs i én bevægelse for at fjerne lamina.
- Forstør laminektomi efter behov ved hjælp af rongeurs at fjerne små dele af det resterende ryghvirvel.
- Mål 1 mm fra spidsen af en # 4 pincet ved at holde dem mod en lineal og mærkning med en permanent markør. Mål en 1 mm adskillelse betlem to tænder ved at holde tangen mod lineal og fastsætte den maksimale bredde af de tips til 1 mm ved at skubbe en gummi pincet ring på plads over akslen af tangen.
- Lav et lille hul ved at indsætte en 30 gauge nål gennem dura på to indsætningspunkter for tænderne af pincet til at få adgang til rygmarven.
- Sæt tangen tænder i en 90 ° vinkel i forhold til dura gennem hullerne til dybden af 1 mm, der er markeret på siderne af tangen, og sørg mærket er over dura. Knib lukke pincet og hold i 10 sek. Release, og gentagne pincet klemme to gange mere for i alt tre holder. Fjern pincet fra rygmarven.
- Et stykke af absorberbare gelatine komprimeret svamp i saltvand og sted over læsionsstedet.
- Ved hjælp af en kørende søm Suturen musklen på plads over laminektomi og gennemvædet gelatinesvamp med # 4 syntetiske ikke-absorberbare nylonsuturer.
- Clip huden på plads ved hjælp af 5 mm sår CLIps.
- Injicer 10 pi marcain (1,0 mg / kg) i 490 pi saltvand subkutant omkring incisionssted og 5 pi Bupernex (0,1 mg / kg) intramuskulært i gluteus muskler.
- Lad dyret kan komme på en varm pad og overvåge for eventuelle vanskeligheder i bevægelse eller tegn på lammelse i bagbenene. Efterlad ikke dyr uden opsyn eller i nærværelse af andre dyr, indtil helt efter anæstesi. Brug ikke dyr, der viser observerbare motoriske underskud.
BEMÆRK: Selvom dette crush læsion kan udføres på ethvert niveau langs rygmarven, praktisk, T10-L4 udgøre færre tekniske udfordringer for billeddannelse med hensyn til vejrtrækning og stabilisere kroppens bevægelser ved hjælp af klemmer. Clamp placering skal ændres omkring brystkassen til billedet på thorax niveauer.
4. Intravital Imaging
- Forbered og autoklaveres kirurgiske værktøjer, herunder Dumont # 4 tænger, iris saks, pincet til at holde væv, nål dfloder og sår klip.
- Bedøver musen som før med isofluran. Fremkald anæstesi på 4-5% og holdes ved 1-2% efter behov for at opretholde et pust på 60-100 vejrtrækninger per minut og manglende reaktion på mund knivspids. Hold musen opvarmede, overvåge ånde sats, når ikke billeddannelse og løbende overvåge dyrs temperatur med en rektal sonde.
- Rens huden omkring såret klip med Betadine og derefter alkohol og fjern sårklemmer overensstemmelse med producentens anvisninger. Når sårklemmer er fjernet, fjerne hår med Nair hvis nødvendigt og rengør stedet igen med povidon-iod og 70% alkohol.
- Genåbne huden med en saks. Fjern tilbageværende suturer fra muskler og træk muskel fra hinanden med en pincet, skæring med en saks, hvis nødvendigt.
- Under et dissektionsmikroskop, skabe lommer til rygmarven klemmer ved at skære musklen med en saks på siden af de tværgående processer på hvirvlen en vertebral niveau over og under laminectomy.
- Placer klemmer omkring hver af disse ryghvirvel og stram. Juster efter behov for at give plads til mikroskop mål at nå rygmarven. Kontroller, at rygmarven er parallel med billeddannelse platform og vedligeholde vævsstabilitet til billeddannelse. Hvis vejrtrækningen artefakt ses, justere klemmer overensstemmelse hermed for at minimere bevægelse i billedbehandling området.
- Dæk klemmerne med parafilm.
- Fjern absorberbare gelatine komprimeret svamp fra rygmarven med pincet, fint plukke ud som mange stykker som muligt, også at fjerne så meget arvæv fra over meninges som muligt. Cover udsatte rygmarven med saltvand og ny svamp, hvis nødvendigt.
BEMÆRK: Hvis der opstår blødning fra den omgivende muskler, enten trofast med svamp eller ætse efter behov. Men passe på ikke at røre rygmarven med kautering. Dæk rygmarven med enten et stykke fugtet væv eller gelatine komprimeret svamp når ætsende. - Opret en welll at holde nedsænkning væske ved først at forsegle hud og væv med Vetbond og derefter bruge dental akryl at opbygge et godt mellem de to klemmer i rygmarven holderen og siderne af dyret. Vent, indtil akryl hærder.
- Fyld godt med kunstig cerebral spinalvæske (aCSF) og kontroller igen for blødning omkring operationsstedet.
- Eventuelt på dette punkt injiceres fluorescerende fartøj farvestoffer intravenøst ved haleveneinjektion at fremhæve blodkarrene under billedbehandling.
BEMÆRK: Fluorescent dextran over 70 kDa bruges ofte, selv om quantum prikker og fluorescensmærkede lektiner også tjene som nyttige fartøj farvestoffer. 50 pi 150.000 WM TRITC-dextran typisk injiceres intravenøst. - For at opnå fysiologisk relevant immune cellemotilitet, skal temperaturen af musen holdes på 37 ° C. Flyt musen til en temperatur kontrolleret miljø under lup for billedbehandling og overvåge dyret for korrekte Anesvelse niveau ved ånde sats og fod knivspids. Overvåg dyret ofte under billedbehandling til at bestemme dybden af anæstesi med henblik på at opnå en respirationsfrekvens på 60-100 vejrtrækninger per minut.
- Find imaging websted via mikroskop okularet.
- Juster 2-foton laserscanningmikroskop at tage en z-stak billede hver 30-60 sek at opnå dynamiske billeddata.
- Når imaging session er afsluttet fjernes dyret fra den opvarmede kassen.
- Løsn spinal klemmer og fjerne musen fra klemmerne. Træk akryl godt væk fra huden, mens fjernelse af klemmer.
- Hvis musen skal afbildes igen placere saltvand gennemvædet gelatine komprimeret svamp over rygmarven. Luk musklen og huden over operationsstedet. Efterlad ikke dyr uden opsyn eller i nærværelse af andre dyr, mens overvinde anæstesi. Hvis dyret viser tegn på neurologisk underskud efter genvinding, bør dyret aflives. Ellers aflivemusen i en CO 2 kammer, før det kommer ud anæstesi ifølge IACUC godkendt eutanasi protokol.
- Analyser fluorescerende billeder ved hjælp af billedanalyse-software ved at følge producentens instruktioner.
Representative Results
Et skematisk diagram, der afbilder den dorsale søjle crush læsion er vist i figur 1A. Efter læsionen dyret fremstillet og stabiliseret for intravital mikroskopi under anvendelse af spinal klemmer (figur 1b). Et billede taget umiddelbart efter dorsale kolonne crush skade viser en klart synlig rektangulær læsion med pincet tine indsætningspunkter, der tydeligt kan identificeres. Axoner på læsionsstedet afskæres på tværs af span af hele dorsale søjle (figur 1C). Integriteten af blodkar forbliver intakt, og ingen tegn på fartøjets farvestoflækage blev detekteret ved fluorescens. For at udføre seriel billeddannelse af samme læsion over uger, kan muskler og huden sutureres over laminektomi til efterfølgende re-eksponering. Tilsvarende læsion morfologi ses ved senere tidspunkter (figur 1D, E). 5 dage efter skaden, tangen insertionssteder er stadig synlige, men læsionen er begyndt at stige i størrelse due til sekundær skade forårsaget af betændelse. Axoner ved den kaudale ende af læsionen er tilbagetrukket fra den oprindelige stedet for skade via en proces, der kaldes "axonal skovdød". Axoner på rostrale ende af læsionen udviste Wallerian-lignende degeneration (figur 1D, E). Mellem dag 5 og 22 efter skade, er størrelsen af læsionen stabiliseret. Samtidig kan en stor tilstrømning af CX3CR1 + celler ses infiltrere i og omkring crush læsion i disse tidspunkter, men identiteten af disse celler (microglia versus makrofager) ikke kan adskilles i præparatet som vist i figur 1.
For at kunne skelne adfærd mikroglia og makrofager i crush læsion mikromiljø blev en stråling kimære model, der anvendes (skitseret i figur 2A). Først bliver knoglemarvsstamceller en CX3CR1 + / GFP mus erstattet med ikke-fluorescerende donor cells, således kun GFP + CNS-resident mikroglia er synlige ved fluorescerende billeddannelse. Effektiviteten af marv rekonstitution kan bekræftes ved flowcytometri undersøgelse af det perifere blod 8 uger efter knoglemarvstransplantation (figur 2B, C). I figur 2B, F4 / 80 og GFP-positive makrofager, fremhævet i blåt, der påvises i en CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 kimære mus, hvor nogle GFP negative men F4 / 80 positive monocytter er også til stede. I figur 2C, ingen dobbelt positive F4 / 80 og GFP-positive celler er tilbage efter udskiftning af CX3CR1 + / GFP modtager knoglemarv med vildtype knoglemarv. Før skaden er mikroglia jævnt fordelt i rygmarven, viser en hvile, forgrenet morfologi (figur 2D). 8 dage efter skaden, kan kun et par mikroglia påvises i og omkring læsionen. Disse mikroglia vise en amoeboid morfologi (figur 2E). Andet benmarv progenitorceller på en ikke-fluorescerende mus erstattes af marvceller fra en CX3CR1 + / GFP mus derfor gøre knoglemarv afledte CX3CR1 + monocytter / makrofager synlige ved GFP-fluorescens (figur 2A). Før skade, kun GFP + -celler detekterede er stort set perivaskulær, som er blevet rapporteret at være knoglemarv afledte og tiden vende på en regelmæssig basis 28 (fig 2F). Efter en knusningsskade kan CX3CR1 + / GFP-celler ses langs indersiden af blodkar, der omgiver læsionen (fig 2H-J), og læsionen centrum er fyldt med infiltrerende CX3CR1 + / GFP makrofager (figur 2G).
Time lapse billeddannelse af den dorsale kolonner kan udføres i op til 6 timer. I figur 3, viser vi en ikke-kimært CX3CR1 + / GFP mus umiddelbart efter skaden, hvor celler fra cirkulationen kan sen bevæge sig ud af blodkarret mod læsion kerne og bevæger sig inden skaden site (figur 3A, B; Supplemental Movie 1). Billedanalyse udnytte fluorescensintensitet at identificere celler kan spore de veje, der træffes af makrofager (figur 3A, B; Supplerende Movie 1). Statistik afledt fra imaging analyse viser den gennemsnitlige motilitet af makrofager i læsionen er 3,6 um / min (figur 3D). Endelig, ved 22 dage efter skade, axoner, mikroglia og makrofager stadig kan detekteres inden læsionen demonstrerer området billeddannelse er stabilt over lange tidsperioder (Supplerende Movie 2).
Figur 1: Fremstilling og sekventiel afbildning af den dorsale søjle knusningsskade. (A) Den dorsalekolonne knusningsskade udføres ved at fjerne den dorsale fremgangsmåden ryghvirvel på niveauet af interesse. Pincet indsættes i den dorsale søjle af rygmarven 1 mm fra hinanden og lukkes derefter 3 gange for at frembringe læsionen vist i lilla. (B) Dyret anbringes derpå med rygmarv klemmer for at opnå stabilitet for intravital billeddannelse. (C) Umiddelbart efter skaden, kan tangen insertionssteder (rød ovale) og rektangulære crush skade volumen (grå boks) klart identificeres. Axoner i den dorsale rødder kan ses (hvide pile), samt de sårede ender af axoner på den kaudale side af læsionen (udfyldte pilespidser). (D) 5 dage efter skaden, tangen insertionssteder (rød oval ), og omfanget af læsion (grå kasse) stadig kan visualiseres. Læsionen er steget i størrelse siden den første fornærmelse. Axoner gennemgår Wallerian-lignende degeneration ses rostralt til læsionen (åben pilespidser) i Additipå axoner i den dorsale rødder (hvide pile) og enderne af sårede axoner (hvide pilespidser). (E) 22 dage efter skaden, læsionsstedet er stadig kan identificeres med lignende dimensioner til skaden efter 5 dage. Bemærk det store antal CX3CR1 + -celler i og omkring det beskadigede sted. Features mærket er de samme som i (D). Alle skala barer = 200 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2: Konstruktion af kimære mus til at spore CX3CR1 + / GFP udtrykker CNS-hjemmehørende mikroglia eller knoglemarv-afledte makrofager i dorsale kolonne crush læsion. (A) et skematisk diagram af kimære mus generation med enten CX3CR1 + / GFP-udtrykkende microglia eller makrofager. Først Thy-1 YFP H mus bestrålet og knoglemarven rekonstitueres med marvceller isoleret fra en CX3CR1 + / GFP mus, hvilket resulterer i et kimært mus, hvis makrofager er GFP +. For det andet er Thy-1 YFP H / CX3CR1 + / GFP mus bestrålet og knoglemarven rekonstitueres med marvceller isoleret fra et ikke-fluorescerende mus, der producerer et kimært muse hvis mikroglia er GFP +. (B) Eksempel på flowcytometri data med F4 / 80 + og CX3CR1 GFP + -celler i blodet fra et kimært dyr med en CX3CR1 + / GFP Marrow Donor transplanteret ind i en bestrålet C57BL / 6 modtager. Celler afledt af CX3CR1 positive donorer, der er positive for både GFP og F4 / 80 er vist i den blå fremhævede område. (C) Eksempel på flowcytometri data med F4 / 80 + og CX3CR1 GFP + -celler i et kimært dyr med en C57BL6 donor marv transplanteres ind i en IRudstrålet CX3CR1 + / GFP modtager. Bemærk manglen på dobbelt positive CX3CR1 + / GFP og F4 / 80 celler i blå fremhævede område. (D) en intravital to-foton mikroskopisk billede af en mus fra den første kimære ordning, der viser GFP + microglia med forgrenet morfologi i dorsale søjle (pilespids). Disse celler er spækket blandt axoner (gul) i den dorsale rod og den dorsale kolonne. Scale bar = 100 um. (E) Intravital billeddannelse af samme mus i (B) 8 dage efter dorsal kolonne skade afslører et par CX3CR1 + microglia med store og amoeboid formet cellelegemer, der mangler processer (pilespids). Scale bar = 100 um. (F) øjebliksbillede af en mus fra den anden kimære ordning (A), hvilket viser ringe GFP + makrofager i CNS parenkym. Scale bar = 100 um. (G) Intravital billeddannelse af samme mus i (F) 8 dage efter dorsal kolonne skade afslører alarge tilstrømning af makrofager i og omkring læsionen. Scale bar = 100 um. (H) En højere forstørrelse billede af CX3CR1 + blod afledte celler i kontakt med fartøjerne i skadede dyr. Scale bar = 30 um. (I) en rekonstruktion af CX3CR1-celler i kontakt med beholderen, set fra indersiden af beholderen. Scale bar = 30 um. (J) en rekonstruktion af CX3CR1-celler i kontakt med beholderen, set fra ydersiden af beholderen. Scale bar = 20 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3 :. Repræsentative celle sporing data i en ikke-kimære CX3CR1 + / GFP mus umiddelbart efter dorsal kolonne crushskade. (A) Et øjebliksbillede af CX3CR1 + mikroglia og makrofager omkring beskadigede axoner (gul) fra Supplerende Movie 1 umiddelbart efter en dorsal kolonne crush skade. (B) Stierne (grå) truffet af CX3CR1 + celler i (A) i løbet af en 110 min intravital imaging session. (C) En tid kodet repræsentation af sporene i (B). Spor farvet baseret på deres tid i hele 110 minutter filmen, som vist i den tid bar. (D) Histogram af den samlede motilitet af CX3CR1 + -celler. Alle skala søjler er 30 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Supplerende Movie 1: Repræsentant intravital film umiddelbart efter dorsale kolonne crush skade i den dobbelte heterozygote Thy-1 YFP / +
Supplerende Movie 2:. Repræsentant intravital film på 22 dage efter dorsal kolonne crush læsion i den dobbelte heterozygote Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + mus Vist her er en repræsentativ film taget i en mus 22 dage efter den indledende dorsale kolonne crush skade på spinal niveau T11. Den injUry er placeret i øverste højre hjørne af rammen. Axoner (gul) stigende rostrally vises nederst til højre. Den dorsale vene og blodkar er mærket med TRITC-dextran (rød). CX3CR1 + celler i læsionen flytte en langsommere hastighed sammenlignet med dem umiddelbart efter skaden. Scale bar = 50 um. Samlet tid: 90 min. Playback hastighed: 600x.
Discussion
Imaging interaktioner af forskellige celletyper i deres native vævsrum under efterfølgende patologi i realtid har genereret stor interesse. Inden for tæt net af CNS, kontakt celle-celle og signaler med tilstødende celler er afgørende for normal funktion og for at forstå CNS patologi. Her har vi beskrevet anvendelsen af 2-foton laser scanning mikroskopi til observation af cellulære bevægelse inden for en mekanisk læsion i rygmarven. Ud over kvaliteten af kirurgi og vævspræparat, mekanisk stabilitet af vævet er altafgørende for en vellykket time-lapse mikroskopi, især isolering af rygmarven fra vejrtrækning bevægelsesartifakt. Stabilitet kan vurderes ved at se bevægelsen af rygmarven for under et dissektionsmikroskop, der svarer til puls eller vejrtrækning i dyret. Stabilitet bør vurderes både mens de udfører operationen og også umiddelbart før du begynder billeddannelse. Hvis animal er ikke stabilt, burde foretages justeringer til placering og tæthed af rygmarven klemmer. Celletypespecifik fluorescerende reporter musemodeller kombineret med knoglemarv kimære tilgange har tilladt identifikationen af monocytceller versus mikroglia og axoner. Tidligere undersøgelser har afsløret, at blodafledte monocytter og ikke mikroglia er ansvarlige for sekundær axonal skade efter traumer anvendelse af metoden her 43 beskrevet. Dextran konjugeret fartøj farvestof muliggør identifikation fartøj både at give vartegn og kunne påvise brud på beholderen integritet. Udvælgelsen af det passende fluorescerende reporter musemodel er kritisk for at tillade en korrekt identifikation af de ønskede celletyper, der skal afbildes.
Udvikling af fluorescerende musemodeller, der er passende for de undersøgelser, der gennemføres, er også afgørende for succes af eksperimenter. At skelne mellem de to fagocytiske populationer af CX3CR1 + / GFP 52. Her har vi iagttaget, at antallet af celler infiltrerer ind i CNS ved steady state som følge af kimær generation er ubetydelig i modsætning til følelsesløsER af celler ind i læsionen. Andre alternative modeller til at overveje omfatter narkotikaforårsagede kimærer 52 eller parabiotic musemodeller 53.
Her har vi præsenteret en konkret, enkel og reproducerbar lille skade model, der resulterer i en læsion på den dorsale hvide substans i rygmarven, der er let at billedet ved hjælp af 2-foton mikroskopi. Denne fremgangsmåde tilvejebringer også en kvantificerbar læsion at analysere graden af axonal skovdød i den dorsale kolonner, der i litteraturen er blevet koblet med supplerende fast vævsanalyse 16,18,43,48,54. I denne model viser dyr kun minimale underskud og kræver ingen særlig behandling efter skade. Fremtidige forsøg med den dorsale kolonne crush skade og billeddannende teknikker, der beskrives her, kan være effektive screening-værktøjer til at vurdere effekten af behandling for rygmarvsskade. Disse behandlinger kan omfatte småmolekylære inhibitorer, lægemidler, celleprodukter, vævstransplantater og kombinatorisk behandlings. Samspillet mellem makrofager, mikroglia og neuroner sandsynligvis også spille en rolle i andre sygdomstilstande modeller i rygmarven, herunder multipel sklerose, tumorer, meningitis og amyotrofisk lateral sklerose, og denne teknik kan være nyttig i undersøgelsen af disse sygdomme samt .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
| Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
| Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
| 60 mm2 Petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
| Falcon 40 μm cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
| 1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
| 21 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
| ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
| HBSS | Corning Cellgro | 21-022-CV | For bone marrow isolation |
| RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
| F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
| 30 gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
| Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
| Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
| Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
| Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9034201 | For imaging |
| 4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
| Reflex Clips, 7 mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
| 45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
| 30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
| Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
| Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
| Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
| Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
| O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
| Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
| Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
| Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
| Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
| Marcaine | Henry Schein | NDC 0409-1587-50 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
| Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
| aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
For surgery From Cold Spring Harbor Protocols |
| TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |
References
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081 (2013).
- Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
- Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
- Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
- Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
- Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113 (2009).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
- Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (1152).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
- Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693 (2010).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
- Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89 (2012).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
- Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030 (2013).
- Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
- Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021 (2010).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544 (2013).
- Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).
