Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التصوير حيوي داخلي من محور عصبي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في ماوس الظهرية الإصابات سحق العمود

Published: November 23, 2014 doi: 10.3791/52228
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

Introduction

ومن المفهوم رد فعل التهابي للمرض أو إصابة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) سيئة، وخاصة فيما يتعلق التفاعلات بين الخلايا المناعية والمقيمين داخل الأنسجة. التحقيقات في هذه التفاعلات الخلوية في الحبل الشوكي هي ذات أهمية خاصة في حيوان حي. وفقط يمكن الوصول إليه بسهولة CNS الأبيض مسألة المسالك في الأعمدة الظهرية للنخاع الشوكي، مما يجعل هذه المنطقة الهامة التي لتركيز الجهود على تحسين المنهج التجريبي ممكنا. وكانت هذه التحقيقات محدود بسبب صعوبة التقنية في الوصول وتحقيق الاستقرار في الجهاز العصبي المركزي للتصوير. وقد وصفت التصوير ناري في الحبل الشوكي حركة الخلوية سابقا 1-13، ومع ذلك، فقد تناول عدد قليل من الدراسات في إصابة الحبل الشوكي وراء بضع ساعات بعد إهانة الأولية. الآفة الحبل الشوكي المؤلمة هي بيئة معقدة، مع الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، الخلايا الليفية، الخلايا الاصلية NG2، والخلايا المناعية includiنانوغرام الخلايا الدبقية الصغيرة، العدلات، الضامة، والخلايا T، خلايا B والخلايا الجذعية 14،15. الضامة هي مجموعة فرعية من الخلايا المناعية المسؤولة عن البلعمة في الآفة، التسلل من التداول. وقد تم مناقشة دور هذه الخلايا البلعمية، مع تقارير تشير إلى أن هذه الخلايا يمكن أن تتخذ على كل من الأدوار الضارة واقية في الأنسجة المصابة. وتتراوح هذه الأدوار من زيادة السقم المحاور الثانوية بعد إصابة والتصرف بطريقة أكلة 16-22، ليأخذ على التئام الجروح النمط الظاهري وخفض عجز وظيفي في الحيوان المصاب 21،23،24.

في السابق، ومحاولات لتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة الضامة من اعتمدت في المقام الأول على التشكل في الأنسجة السليمة. ومع ذلك، الخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها والضامة تعبر عن العديد من نفس علامات وعرض مورفولوجيا تمييزه بعد إصابة 25-29، مما يجعل الفصل بين الأنشطة المختلفة من هذه الخلايا صعبة لدراسة بسإد على هذه العوامل وحدها 30. هذه الخلايا يمكن فصلها عن طريق التعبير التفاضلية من CD45 باستخدام التدفق الخلوي 33،34، على الرغم من أن هذا النهج هو أقل فائدة في تمييز أنواع الخلايا هذه في الجسم الحي. كما تم استكشاف استخدام التعبير التفاضلية من CCR2 وCX3CR1 في الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة، على الرغم من التغيرات الدينامية في التعبير عن هذه العلامات كما حيدات تفرق في الضامة يمكن تعقيد تحليل دقيق 35،36. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمين في الجهاز العصبي المركزي وتنشأ من الأسلاف الكيس المحي أثناء التطور الجنيني، في حين مستمدة من الأسلاف الضامة نخاع العظم وأدخل CNS المصاب بعد إهانة 31،32. نهج بديل لاستخدام التشكل التمييز بين هذه أنواع الخلايا اثنين هو استبدال نخاع العظام مع الأسلاف من حيوان المانحة تعبر عن علامة يمكن تتبعها في الضامة المستمدة من الأسلاف المانحة، مع الحفاظ على المقيمين CNS، رجب-ient المستمدة الخلايا الدبقية الصغيرة. وتستخدم هذه النماذج خيالية نخاع العظام شائع في العديد من التطبيقات الأخرى 37-40. هذا الأسلوب له المحاذير الفريدة المرتبطة الأضرار التي لحقت سلامة حاجز الدم في الدماغ الناجم عن أشعة أو السامة للخلايا الأدوية المستخدمة للقضاء على الأسلاف نخاع في البلد المضيف، مما يحد من استخدامها في تطبيقات معينة. في الآونة الأخيرة، الفروق الوظيفية بين الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في الجهاز العصبي المركزي هي بداية لتمييزها باستخدام التدفق الخلوي، وتحليل مجموعة رقاقة الجينات وطرق الخيمرية 24،26،41-44، والتي سوف تكون مفيدة جدا في المستقبل. على الرغم من أن فصل هذه الأنواع الخلية اثنين لا يزال صعبا، فهم وظائف فريدة من نوعها المهم في المؤدية إلى علاجات أكثر استهدافا من الاضطرابات التي تنطوي على كل من الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة داخل الجهاز العصبي المركزي.

وصف التفاعلات الخلوية داخل الآفة الحبل الشوكي قد حان في المقام الأول من دراسات شملت نماذج ثقافة الخلية. هذا هو درق إلى التحديات المرتبطة التصوير كل من آفة في الحبل الشوكي والخلايا المناعية معا في الحيوانات الحية. وتشمل نماذج القوارض الحالية للإصابة الحبل الشوكي من نوع وشدة متفاوتة نماذج كدمة 45،46، إصابات وخز دبوس 2، تهتك 47، والظهرية إصابة العمود سحق الموصوفة هنا 16،18،48. التهاب السحايا في يزيد مع شدة الإصابة ويطرح تحديات فريدة من نوعها لزرع النوافذ أو العمليات الجراحية للتصوير المسلسل. بعض هذه التحديات تشمل تسلل الخلايا البلعمية، وكذلك توليد الأنسجة الليفية عبر موقع الجراحية. بعض هذه القضايا يمكن التغلب عليها من خلال خلق الآفات الصغيرة والتي تغطي النخاع الشوكي يتعرض مع الملابس الجراحية غير مناعة بين الجافية والعضلات paraspinous للسماح لجراحة إعادة فتح اللاحقة، كما هو الحال هنا لدراسة ظهري العمود إصابة سحق . القدرة على صورة فقط الجزء الظهري من زيادة ونقصانكما يحد الحبل آل اختيار الإصابة، منذ نماذج كدمة تسبب في المقام الأول الأضرار التي لحقت الحبل المركزي، وغالبا ما تشفق على الجزء الأكثر الظهري من الأعمدة الظهرية، وخصوصا في نقاط زمنية مبكرة بعد اصابة 45،49. لذلك، نحن تصف نموذجا إصابة بسيط هو أن تعطي، قابلة للتكرار، الآفة على شكل مستطيل نظيفة يمكن أن يكون مفيدا لكل من مراقبة حركة الخلية داخل الآفة والكمي سهل من موقف محور عصبي نسبة إلى الآفة.

Protocol

ملاحظة: يجب أن يكون مقر جميع الحيوانات والاستفادة منها وفقا للجنة رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في المؤسسة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة هنا من قبل جامعة كيس ويسترن ريزرف IACUC.

1. المعدلة وراثيا الحيوانات

  1. استخدام المتاحة تجاريا الفئران مراسل الفلورسنت لتسمية المحاور (خاصتك-1 YFP H) 50 والخلايا الدبقية الصغيرة / حيدات (CX3CR1 GFP / GFP 51؛ انظر قائمة المواد). يجب intercrossed هذه الفئران والحفاظ كمستعمرات تربية الفرد وفقا لسياسات رعاية الحيوان المؤسسية.

2. نخاع العظم الوهم

  1. تحديد الحيوانات التي هي لا يقل عن 8 أسابيع من العمر لاستخدامها كحيوانات المتلقي.
  2. وضع الحيوانات المضيفة في التعميم التشعيع عقد قفص مصممة على عقد الماوس في وضع يمكنها من ضمان ذلك، كله تشعيع الجسم.
  3. تعيين جهاز ضبط الوقت على السيزيوم (CS-137) irradiator لإدارة دوس إشعاع كامل الجسمعمر 800-1،000 راد للحيوانات وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الأمثلة المعروضة هنا هي 980 راد).
  4. العودة الحيوانات إلى أقفاصها للراحة لمدة لا تقل عن 4 ساعات.
  5. اختيار الحيوانات المانحة من النمط الجيني المناسب (انظر الشكل 2A) كمصدر للخلايا نخاع السلف.
    ملاحظة: المانحون المناسبة هي حيوانات التعبير عن مختلف صحفيين الفلورسنت نسب محددة من المضيف لتحديد السكان خلية مختلف، أو واحد من نفس النمط الجيني والضوابط.
  6. ملء واحدة طبق بيتري مع الكحول 70٪، وطبق الثاني مع 10 مل روزويل بارك المعهد التذكاري (RPMI) وسائل الاعلام ومصفاة الخلية 40 ميكرومتر غارقة في وسائل الإعلام. ملء أنبوب مخروطي 15 مل مع وسائل الاعلام RPMI. إبقاء الأطباق وأنبوب على الجليد.
  7. تضحية الحيوانات المانحة التي كتبها CO 2 الخنق وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تنظيف الجلد والفرو عن طريق نقع الحيوان بأكمله مع 70٪ من الإيثانول حتى هو كل الفراء الرطب.
  8. إزالة كورونافي من النصف السفلي من الحيوانات عن طريق قطع جميع أنحاء منتصف القسم وسحب الجلد إلى أسفل على رجليه الخلفيتين للكشف تماما عن عضلات الساق.
  9. إزالة الساق الأمامية التي كتبها المفرط في مفصل الركبة لخلخل العظم، ثم باستخدام ملقط ومقص العقيمة، وقشر وقطع العضلات بعيدا عن طرفي الساق. وضع العظام في طبق بيتري مع الكحول لمدة تصل إلى 30 ثانية ثم نقل إلى مصفاة الخلية داخل طبق بتري تحتوي على وسائل الإعلام.
  10. خلخل مفصل الورك وقشر بعيدا العضلات التي تعلق على عظم الفخذ، وضعت لفترة وجيزة الفخذ في الكحول ثم وضعه في نفس مصفاة الخلية داخل الطبق.
  11. في ثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة، واستخدام مقص العقيمة بقطع طرفي العظام وادخال ابرة مقياس 21 على حقنة 1 مل في نهاية العظام. تدفق نخاع في المخروطية 15 مل مع وسائل الإعلام. تكرار إجراءات العظام المتبقية.
  12. استخدام الجزء الخلفي من المكبس من حقنة 3 مل، ينتهي سحق العظام في الخليةمصفاة على طبق بتري لاستخراج المزيد من الخلايا.
  13. وضع مرشح على رأس 50 مل أنبوب مخروطي الشكل ونقل وسائل الاعلام مع الخلايا يستنشق من 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام الجزء الخلفي من المكبس لسحق نخاع من أجل الحصول على تعليق خلية واحدة. يغسل 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، شظايا العظام ومصفاة الخلية مع 30 مل من وسائل الإعلام إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  14. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 500 x ج لتكوير الخلايا.
  15. ليز خلايا الدم الحمراء مع 2 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) العازلة تحلل لمدة 2 دقيقة. إخماد تحلل العازلة مع 10 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5-10 دقيقة لتكوير.
  16. غسل خلايا مرة واحدة في 10 مل من وسائل الاعلام RPMI ومرتين في المياه المالحة، الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5-10 دقيقة لتكوير عن كل غسل.
  17. الخلايا resuspend إلى تركيز النهائي من 3 × 10 6 خلايا في 200 ميكرولتر من المياه المالحة.
  18. نقل 3 × 10 6 خلايا نخاع عن طريق الحقن الذيل الوريد إلى IRRالفئران المتلقي adiated.
  19. وضع المياه المحمضة (درجة الحموضة 3.0) في قفص المتلقي والسماح الفئران لاسترداد.
    ملاحظة: الفئران التي تفشل سوف زرع يموت في غضون 10-14 يوما بعد العملية.
  20. بعد 8 أسابيع، تحقق من نخاع إعادة من خلال فحص الدم المحيطي الخلايا المناعية باستخدام التدفق الخلوي (الشكل 2B-C).

3. الظهرية الإصابات سحق العمود

ملاحظة: اختيار الحيوانات الوهم المناسبة أو الحيوانات المعدلة وراثيا مزدوجة لعملية جراحية على أساس التجربة المطلوب. تم إنشاؤها الحيوانات مع المقيمين أو نخاع العظام المستمدة الخلايا إما المسمى في الخطوات السابقة.

  1. إعداد والأوتوكلاف الأدوات الجراحية، بما في ذلك رينجرز، دومون # 4 ملقط، مقص القزحية، ملقط لأنسجة عقد، والسائقين إبرة ومقاطع الجرح.
  2. تحضير الأدوية لإدارة للفئران للسيطرة على الألم. وتستخدم Bupernex وMarcaine عادة للسيطرة على الألم. استخدام الأدوية المناسبة كما هو مطلوب لالثانية وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC).
  3. لحث التخدير مع 4٪ الأيزوفلورين والمحافظة مع 1-2٪ الأيزوفلورين لتحقيق معدل التنفس من 60-100 الأنفاس لكل دقيقة. تطبيق مواد التشحيم العين لعيون الحيوان لمنع جفاف تحت التخدير وتأكيد عدم استجابة قرصة القدم. الحفاظ على درجة الحرارة باستخدام وسادة التدفئة ومراقبة درجة الحرارة باستخدام مسبار المستقيم.
  4. حلق الخلفي من الماوس مع ماكينة حلاقة كهربائية على مستوى النخاع الشوكي المستهدفة، ومن ثم مسحة المنطقة ثلاث مرات مع بوفيدون اليود تليها مرتين مع 70٪ كحول. وضع الحيوان على ثنى العقيمة، وتغطية حيوان مع ثنى العقيمة آخر مع وجود ثقب قطع في الموقع المناسب لتصور موقع الجراحية. الحفاظ على كل الأدوات على الستائر العقيمة في جميع أنحاء الجراحة.
  5. قطع الجلد على طول خط الوسط على مستوى العمود الفقري المطلوب مع قزحية مقص لفضح العضلات في الجزء الخلفي من الحيوان.
  6. تحت ديسecting المجهر، وقطع عضلات الظهر، بما في ذلك شبه المنحرفة والأربطة من الظهرية العريضة على طول خط الوسط حيث نعلق على عمليات العمود الفقري الظهري، وفضح العمود الفقري.
  7. إزالة العضلات المدورة بين العمليات الظهرية وعرضية من فقرة للكشف عن الصفيحة للفقرة محددة لإزالتها (T11 في هذه الحالة). تحديد T11 من قبل الإدراج من الماضي الضلع غير العائمة على هذه العملية.
  8. إدراج نصائح من رينجرز في الفضاء فوق وتحت عملية لإزالتها ورفع قليلا للتأكد من أنها في مكان آمن في جميع أنحاء الصفيحة الفقرية ولكن ليس عميق جدا على إصابة العمود الفقري. رينجرز وثيقة في حركة واحدة لإزالة الصفيحة.
  9. توسيع الثقب حسب الحاجة باستخدام رينجرز لإزالة أجزاء صغيرة من فقرة المتبقية.
  10. قياس 1 ملم من النصائح ل# 4 ملقط بعقدها ضد حاكم ووضع العلامات مع علامة دائمة. قياس قطرها 1 مم في فصل الرهانوين أسنان اثنين من خلال عقد ملقط ضد الحاكم وإصلاح أقصى عرض من النصائح إلى 1 ملم من الانزلاق حلقة ملقط المطاط في مكانه على رمح من الملقط.
  11. إنشاء ثقب صغير عن طريق إدخال إبرة قياس 30 خلال الجافية في النقطتين الإدراج للأسنان من ملقط للوصول إلى الحبل الشوكي.
  12. أدخل أسنان الملقط في زاوية 90 درجة إلى الجافية من خلال الثقوب إلى عمق 1 ملم ملحوظ على الجانبين من ملقط، والتأكد من العلامة فوق الجافية. قرصة إغلاق ملقط وعقد لمدة 10 ثانية. الإفراج، وتكرار ملقط تضغط مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث حاصل. إزالة ملقط من الحبل الشوكي.
  13. نقع قطعة من امتصاص الجيلاتين الإسفنج المضغوط في المياه المالحة ومكان على موقع الإصابة.
  14. باستخدام غرزة على التوالي، خياطة العضلات في مكان وخلال الثقب وغارقة الإسفنج الجيلاتين مع # 4 خيوط النايلون غير قابل للامتصاص الاصطناعية.
  15. مقطع الجلد في مكانها باستخدام 5 ملم الجرح المبادرة القطريةملاحظة.
  16. ضخ 10 ميكرولتر Marcaine (1.0 ملغ / كلغ) في 490 ميكرولتر من المياه المالحة تحت الجلد حول موقع شق و 5 ميكرولتر Bupernex (0.1 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن العضلي في العضلات الألوية.
  17. تسمح الحيوانات لاستعادة على وسادة دافئة ومراقبة أي صعوبات في الحركة أو علامات الشلل في الأطراف الخلفية. لا تترك الحيوان غير المراقب أو في وجود حيوانات أخرى حتى تعافى تماما من التخدير. لا تستخدم أي الحيوانات التي تعرض العجز الحركي ملاحظتها.
    ملاحظة: على الرغم من الزحام آفة لا يمكن أن يؤديها في أي مستوى على طول الحبل الشوكي، عمليا، T10-L4 تشكل التحديات التقنية أقل للتصوير فيما يتعلق التنفس واستقرار حركة الجسم باستخدام المشابك. يجب أن يتم تعديل وضع المشبك حول القفص الصدري للصورة عند مستويات الصدرية.

4. حيوي داخلي التصوير

  1. إعداد والأوتوكلاف الأدوات الجراحية، بما في ذلك دومون # 4 ملقط، مقص القزحية، ملقط لعقد الأنسجة، إبرة دالأنهار ومقاطع الجرح.
  2. تخدير الماوس كما كان من قبل مع isoflurane. لحث التخدير في 4-5٪ والحفاظ على 1-2٪ حسب الحاجة للحفاظ على معدل التنفس من 60-100 الأنفاس في الدقيقة الواحدة، وعدم الاستجابة لقرصة القدم. الحفاظ على الماوس تسخينها، ومراقبة معدل التنفس عند عدم تصوير ورصد مستمر درجة حرارة الحيوان مع التحقيق الذي تجريه المستقيم.
  3. تنظيف الجلد حول الجرح مع لقطات بتدين ثم الكحول وإزالة مقاطع الجرح وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حالما تتم إزالة مقاطع الجرح، وإزالة الشعر مع ناير إذا لزم الأمر وتنظيف الموقع مرة أخرى مع بوفيدون اليود و 70٪ كحول.
  4. إعادة فتح الجلد مع مقص. إزالة أي الغرز المتبقية من العضلات وسحب العضلات بعيدا مع ملقط، وقطع مع مقص إذا لزم الأمر.
  5. تحت المجهر تشريح، وخلق جيوب للالحبل الشوكي المشابك عن طريق قطع مع مقص العضلات في جانب من عمليات عرضية على مستوى العمود الفقري فقرة واحدة فوق وتحت اللاميnectomy.
  6. وضع المشابك حول كل من هذه فقرة وتشديد. ضبط حسب الحاجة للسماح للغرفة الهدف المجهر للوصول إلى الحبل الشوكي. تأكد من أن الحبل الشوكي هو مواز للمنصة التصوير، والحفاظ على الاستقرار الأنسجة للتصوير. إذا وينظر التنفس قطعة أثرية، تعدل وفقا لذلك المشابك لتقليل الحركة في مجال التصوير.
  7. تغطية المشابك مع parafilm.
  8. إزالة قابل للامتصاص الجيلاتين الإسفنج المضغوط من الحبل الشوكي مع ملقط، واختيار بدقة من العديد من القطع ممكن، وأيضا إزالة أكبر قدر ممكن من ندبا من أكثر من السحايا ممكن. يتعرض غطاء الحبل الشوكي مع المياه المالحة والاسفنج جديد إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: في حالة حدوث أي نزيف من العضلات المحيطة بها، إما قوي مع اسفنجة أو كوى حسب الحاجة. ومع ذلك، والحرص على عدم لمس الحبل الشوكي مع الكي. تغطية الحبل الشوكي إما مع قطعة من النسيج أو تخفيفه أو الجيلاتين ضغط الاسفنج عندما كية.
  9. إنشاء أهلا وسهلال لعقد السائل الغمر بإغلاق أول الجلد والأنسجة مع Vetbond، ثم باستخدام الاكريليك الأسنان لبناء بئر بين اثنين من المشابك لصاحب الحبل الشوكي وعلى جانبي الحيوان. الانتظار حتى يشفي من الاكريليك.
  10. ملء البئر مع الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي (ACSF) والتحقق مرة أخرى لأي نزيف حول موقع الجراحة.
  11. اختياريا عند هذه النقطة، حقن الأصباغ سفينة الفلورسنت عن طريق الوريد قبل الذيل حقن الوريد لتسليط الضوء على الأوعية الدموية أثناء التصوير.
    ملاحظة: غالبا ما يستخدم ديكستران الفلورسنت فوق 70 كيلو دالتون، على الرغم من نقاط الكم ويكتينس fluorescently المسمى أيضا يخدم الأصباغ سفينة مفيدة. 50 ميكرولتر من 150،000 WM TRITC-ديكستران عادة يتم حقن عن طريق الوريد.
  12. للحصول على الحركة الخلايا المناعية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية، ويجب المحافظة على درجة حرارة الماوس عند 37 درجة مئوية. تحريك الماوس إلى بيئة درجة الحرارة للرقابة تحت المجهر للتصوير ومراقبة الحيوانات لأنيس الصحيحةمستوى thesia بمعدل التنفس وقرصة القدم. مراقبة الحيوان في كثير من الأحيان أثناء التصوير لتحديد عمق التخدير، وتهدف لتحقيق معدل التنفس من 60-100 الأنفاس في الدقيقة الواحدة.
  13. تحديد الموقع التصوير من خلال العدسة المجهر.
  14. ضبط 2 الفوتون المسح الضوئي ليزر المجهر لالتقاط صورة ض المكدس كل 30-60 ثانية للحصول على بيانات التصوير الديناميكية.
  15. بمجرد الانتهاء من دورة التصوير إزالة الحيوان من مربع ساخنة.
  16. تخفيف المشابك العمود الفقري وإزالة الماوس من المشابك. سحب الاكريليك جيدا بعيدا عن الجلد أثناء إزالة المشابك.
  17. إذا كان الماوس ليتم تصويرها مرة أخرى، ضع المالحة غارقة الجيلاتين الإسفنج المضغوط على الحبل الشوكي. إغلاق العضلات والجلد اكثر من موقع الجراحة. لا تترك الحيوان غير المراقب أو في وجود الحيوانات الأخرى بينما يتعافى من التخدير. إذا يظهر الحيوان أي علامات العجز العصبي بعد الشفاء، يجب أن يتم التخلص من الحيوانات. خلاف ذلك، الموت ببطءالماوس في غرفة CO 2 قبل أن يخرج من التخدير وفقا لبروتوكول القتل الرحيم وافق IACUC.
  18. تحليل الصور الفلورسنت باستخدام صورة برامج التحليل باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

Representative Results

ويظهر رسم تخطيطي تصور ظهري العمود سحق الآفة في الشكل 1A. بعد الآفة، ويتم إعداد الحيوان واستقرت لintravital المجهري باستخدام المشابك الشوكي (الشكل 1B). صورة اتخاذها على الفور بعد الإصابة ظهري العمود سحق تظهر آفة مستطيلة واضحة للعيان مع ملقط طينة نقطة الإدراج التي يمكن تحديدها بشكل واضح. وقطعت محاور في مكان الاصابه عبر فترة من كامل العمود الظهري (الشكل 1C). سلامة الأوعية الدموية لا تزال سليمة، والكشف عن أي دليل على تسرب السفينة صبغ من قبل مضان. لإجراء التصوير التسلسلي للنفس الآفة على مدى الأسابيع، والعضلات والجلد يمكن خياطة على الثقب لاحقا إعادة التعرض. وينظر الآفة مماثل التشكل في نقاط زمنية لاحقة (أرقام 1D، E). بعد 5 أيام الإصابة، والمواقع ملقط الإدراج لا تزال مرئية ولكن بدأت الآفة إلى زيادة في حجم درق إلى إصابة الثانوية الناجمة عن الالتهاب. وقد تراجع عن محاور في نهاية الذيلية للآفة من موقع الأولي للإصابة من خلال عملية تسمى "السقم محور عصبي". المحاور في نهاية منقاري الآفة أظهرت ولري مثل انحطاط (الشكل 1D، E). بين أيام 5 و 22 بعد الإصابة، قد استقر حجم الآفة. وفي الوقت نفسه، تدفق أعداد كبيرة من CX3CR1 + الخلايا يمكن أن ينظر إلى التسلل داخل وحول الآفة سحق خلال هذه النقاط الوقت، على الرغم من أن هوية هذه الخلايا (الخلايا الدبقية الصغيرة مقابل الضامة) لا يمكن تمييزها في إعداد كما هو مبين في الشكل (1).

من أجل التمييز بين سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة داخل سحق الآفة المكروية، تم استخدام نموذج الوهم الإشعاع (الموضحة في الشكل 2A). أولا، يتم استبدال خلايا نخاع العظام من السلف CX3CR1 + / GFP الماوس مع سل غير الفلورسنت المانحةليرة سورية، وبالتالي GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة CNS المقيمة الوحيدة مرئية بواسطة التصوير الفلورسنت. ويمكن التأكد من كفاءة نخاع إعادة التدفق الخلوي فحص الدم المحيطي بعد 8 أسابيع زرع نخاع (الشكل 2B، C). في الشكل 2B، F4 / 80 الضامة وإيجابية GFP، سلط الضوء باللون الأزرق، يتم الكشف عنها في CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 الماوس خيالية، فيها بعض GFP حيدات إيجابية سلبية ولكن F4 / 80 موجودة أيضا. في الشكل 2C، لا F4 إيجابي مزدوج / 80 وخلايا إيجابية GFP وغادر بعد استبدال CX3CR1 + / GFP نخاع العظام المتلقي مع النوع البري نخاع العظام. قبل الإصابة، وتوزع بالتساوي الخلايا الدبقية الصغيرة داخل الحبل الشوكي، وعرض يستريح، مورفولوجيا متشعبة (الشكل 2D). بعد 8 أيام الإصابة، ويمكن الكشف سوى عدد قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة في وحول الآفة. تعرض هذه الخلايا الدبقية الصغيرة في التشكل متموريات الحركة (الشكل 2E). الثاني، العظاميتم استبدال خلايا نخاع السلف في الماوس غير الفلورسنت من قبل خلايا نخاع من CX3CR1 + / GFP الماوس، ومن ثم يجعل نخاع العظم تستمد CX3CR1 + حيدات / الضامة وضوحا من قبل GFP مضان (الشكل 2A). قبل الإصابة، وGFP الوحيد + خلايا الكشف عن هم إلى حد كبير حول الأوعية، والتي تم الإبلاغ عن أن يكون نخاع العظام تستمد وتتحول باستمرار على على أساس منتظم 28 (الشكل 2F). بعد إصابة سحق، يمكن أن ينظر CX3CR1 خلايا + / GFP على طول داخل الأوعية الدموية المحيطة الآفة (الشكل 2H-J)، وملأت مركز الآفة مع تسلل الضامة CX3CR1 + / GFP (الشكل 2G).

وقت التصوير مرور الأعمدة الظهرية يمكن أن يؤديها لمدة تصل إلى 6 ساعات. في الشكل 3، وتبين لنا من CX3CR1 غير خيالية + / GFP الماوس مباشرة بعد الإصابة التي الخلايا من التداول ويمكن رؤيةن تتحرك للخروج من الأوعية الدموية نحو جوهر الآفة وتتحرك داخل موقع الإصابة (الشكل 3A، B، التكميلي الفيلم 1). تحليل الصور باستخدام كثافة مضان لتحديد الخلايا يمكن تتبع مسارات التي اتخذتها الضامة (الشكل 3A، B، التكميلي الفيلم 1). وتظهر الاحصاءات المستمدة من تحليل التصوير متوسط ​​الحركة الضامة في الآفة هي 3.6 ميكرون / دقيقة (الشكل 3D). وأخيرا، في 22 أيام بعد الإصابة، محاور، الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة لا يزال من الممكن الكشف عن داخل الآفة مما يدل على مجال التصوير غير مستقرة على مدى فترات طويلة من الزمن (فيلم التكميلي 2).

الشكل (1)
الشكل 1: إنشاء والتصوير المتتابع للإصابة العمود الظهري سحق. (A) والظهريةيتم تنفيذ إصابة العمود سحق من خلال إزالة عملية الظهري للفقرة على مستوى الفائدة. يتم إدراج ملقط في العمود الظهري للحبل الشوكي 1 ملم، وبصرف النظر ثم يتم إغلاق 3 مرات لإنتاج الآفة هو مبين في الأرجواني. (B) ثم يتم وضع الحيوان مع الحبل الشوكي المشابك للحصول الاستقرار للتصوير حيوي داخلي. (C) مباشرة بعد الإصابة، ملقط المواقع الإدراج (بيضاوي أحمر) ومستطيلة حجم الإصابة سحق (مربع رمادي) يمكن تحديدها بشكل واضح. ويمكن رؤية محاور في الجذور الظهرية (السهام البيضاء)، وكذلك نهايات الجرحى من المحاور على الجانب الذيلية الآفة (رؤساء السهم شغل). (D) بعد 5 أيام الإصابة، ملقط المواقع الإدراج (بيضاوي أحمر )، ومدى الآفة (مربع رمادي) لا يزال من الممكن تصور بسهولة. وزاد الآفة في حجم منذ إهانة الأولية. محاور تمر ولري مثل التنكس يمكن رؤية منقاري إلى الآفة (رؤساء السهم مفتوح) في additiإلى محاور في الجذور الظهرية (السهام البيضاء) ونهايات محاور أصيب (السهام البيضاء). (E) بعد 22 يوما الإصابة، موقع الآفة لا يزال التعرف ذات أبعاد مشابهة للإصابة بعد 5 أيام. لاحظ عدد كبير من CX3CR1 + الخلايا في وحول موقع بجروح. الميزات وصفت هي نفسها كما في (D). جميع الحانات النطاق = 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: بناء الفئران خيالية لتتبع CX3CR1 + / GFP معربا عن الخلايا الدبقية الصغيرة أو العظام الضامة CNS المقيمين المشتقة من نخاع في الآفة ظهري العمود سحق. (A) رسم تخطيطي لتوليد الفئران خيالية مع أي CX3CR1 + / GFP تعبر عن ميلcroglia أو الضامة. أولا، والمشع خاصتك-1 YFP H الفئران وأعيد نخاع العظام مع خلايا نخاع معزولة عن CX3CR1 + / GFP الماوس، مما أدى إلى الماوس خيالية الذي الضامة هي GFP +. ثانيا، المشع خاصتك-1 YFP الفئران H / CX3CR1 + / GFP وإعادة تشكيل نخاع العظام مع خلايا نخاع معزولة عن ماوس غير الفلورسنت، وإنتاج الماوس خيالية الذين الخلايا الدبقية الصغيرة هي GFP +. (ب) مثال من التدفق الخلوي البيانات مع الخلايا F4 / 80 + وCX3CR1 GFP + في الدم من حيوان خيالية مع CX3CR1 + / GFP نخاع المزروع المانحة إلى المشع C57BL / 6 المتلقي. وتظهر الخلايا المشتقة من المانحين إيجابية CX3CR1 التي هي ايجابية لكلا GFP وF4 / 80 في الزرقاء أبرز المنطقة. (C) مثال من التدفق الخلوي البيانات مع F4 / 80 + وCX3CR1 GFP + الخلايا في الحيوانات خيالية مع C57BL6 نخاع المانحة زرع إلى الأشعة تحت الحمراءالمشعة CX3CR1 + / GFP المتلقي. لاحظ عدم وجود مزدوج إيجابي CX3CR1 + / GFP وF4 / 80 الخلايا داخل الأزرق أبرز المنطقة. (D) ان اثنين من الفوتون قطة مجهرية حيوي داخلي على فأرة الحاسوب من نظام خيالية الأول، والتي تبين GFP + الخلايا الدبقية الصغيرة مع التشكل متشعبة داخل الظهرية العمود (رأس السهم). ويتخلل هذه الخلايا بين المحاور (الأصفر) في جذر ظهري والعمود الظهري. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. (E) التصوير حيوي داخلي من نفس الماوس في (B) 8 أيام بعد إصابة العمود الظهري تكشف عن عدد قليل CX3CR1 + الخلايا الدبقية الصغيرة مع أجسام الخلايا الكبيرة ومتموريات الحركة على شكل التي تفتقر العمليات (رأس السهم). شريط النطاق = 100 ميكرومتر. (F) لقطة من الماوس من مخطط خيالية الثاني في (A)، والتي تبين GFP ضئيل + الضامة، ضمن لحمة الجهاز العصبي المركزي. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. (G) التصوير حيوي داخلي من نفس الماوس في (F) بعد 8 أيام إصابة العمود الظهري يكشف اللهالدو تدفق الضامة في وحول الآفة. شريط النطاق = 100 ميكرومتر. (H) صورة التكبير أعلى من CX3CR1 + الدم الخلايا المشتقة في اتصال مع السفن في الحيوان لم يصب. شريط النطاق = 30 ميكرومتر. (I) وإعادة بناء خلايا CX3CR1 في اتصال مع السفينة، ينظر اليها من داخل السفينة. مقياس شريط = 30 ميكرون. (J) وإعادة بناء خلايا CX3CR1 في اتصال مع السفينة، ينظر إليها من خارج السفينة. شريط النطاق = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل (3) :. بيانات تتبع خلية تمثيلية في CX3CR1 غير خيالية + / GFP الماوس مباشرة بعد العمود الظهري سحقالاصابة. (A) لقطة من CX3CR1 + الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة محاور تلف حول (الصفراء) من فيلم التكميلي 1 مباشرة بعد اصابة في العمود الظهري سحق. (B) مسارات (الرمادية) التي اتخذتها CX3CR1 + الخلايا في (A) خلال 110 دقيقة دورة التصوير حيوي داخلي. (C) وهناك وقت التمثيل مشفرة من المسارات في (B). يتم تلوين المسارات على أساس وقتهم داخل كله فيلم 110 دقيقة، كما هو مبين في شريط الوقت. (D) الرسم البياني من الحركة العامة للCX3CR1 + الخلايا. جميع الحانات النطاق هي 30 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الفيلم التكميلي 1: فيلم حيوي داخلي الممثل فورا بعد إصابة العمود الظهري سحق في متغايرة مزدوجة خاصتك-1 YFP / + GFP / + الماوس. تم إجراء التصوير الشوكي حيوي داخلي مباشرة بعد عمود إصابة سحق الظهرية على مستوى T11. وتظهر اللوحة اليمنى حركة CX3CR1 + الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة. وتظهر مسارات حركة الخلية من المسارات بيضاء على اللوحة اليمنى. يقع إصابة في الزاوية اليسرى العليا. ويمكن رؤية CX3CR1 + خلايا الانتقال إلى موقع الإصابة على طول هذه المسارات. وتظهر المحاور باللون الأصفر. = شريط نطاق 40 ميكرون. مجموع الوقت: 110 دقيقة. قراءة السرعة: 300X.

الفيلم التكميلي 2: فيلم حيوي داخلي الممثل في 22 يوما بعد الآفة العمود الظهري سحق في متغايرة مزدوجة خاصتك-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + الماوس يظهر هنا هو الفيلم الممثلة المأخوذة في الماوس بعد 22 أيام من سحق العمود الظهري الأولي إصابة في T11 مستوى العمود الفقري. وينجيقع URY في الزاوية اليمنى العليا من الإطار. محاور (الصفراء) تصاعدي ترد rostrally في أسفل اليمين. وصفت الأوعية الوريد الظهري والدم مع TRITC-ديكستران (الحمراء). CX3CR1 + الخلايا داخل هذه الخطوة الآفة بسرعة أبطأ مقارنة بتلك مباشرة بعد الإصابة. = شريط نطاق 50 ميكرون. مجموع الوقت: 90 دقيقة. قراءة السرعة: 600X.

Discussion

التفاعلات التصوير من أنواع مختلفة من الخلايا في مقصورات الأنسجة الأم أثناء تلت ذلك علم الأمراض في الوقت الحقيقي ولدت اهتماما كبيرا. ضمن شبكة كثيفة من الجهاز العصبي المركزي، خلية خلية الاتصال و الإنذار مع الخلايا المجاورة ضرورية لالوظيفة العادية ولفهم CNS علم الأمراض. هنا، وصفنا استخدام 2 الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر لمراقبة الحركة الخلوية داخل الآفة الميكانيكية في الحبل الشوكي. وبالإضافة إلى نوعية إعداد الجراحة والأنسجة، والاستقرار الميكانيكي للأنسجة أمر بالغ الأهمية لنجاح المجهري الوقت الفاصل، وخاصة عزل الحبل الشوكي من التنفس الحركة قطعة أثرية. يمكن تقييم الاستقرار من خلال البحث عن حركة الحبل الشوكي تحت المجهر تشريح الذي يتوافق مع معدل ضربات القلب أو التنفس من الحيوان. ينبغي تقييم الاستقرار على حد سواء أثناء أداء الجراحة وأيضا على الفور قبل البدء في التصوير. إذا كان أنيمال ليست مستقرة، وينبغي بذل تعديلات على التنسيب وضيق من المشابك الحبل الشوكي. وقد سمحت الخلية من نوع نماذج الفلورسنت معين مراسل الماوس إلى جانب النهج الوهم نخاع العظام تحديد خلايا الوحيدات مقابل الخلايا الدبقية الصغيرة ومحاور عصبية. وقد كشفت الدراسات السابقة أن الدم المستمدة حيدات الخلايا الدبقية الصغيرة وليس مسؤولة عن الأضرار محور عصبي بعد الصدمة الثانوية باستخدام المنهجية الموصوفة هنا 43. ديكستران مترافق صبغ السفينة يسمح للهوية السفينة على حد سواء لتوفير المعالم وتحديد المخالفات في سلامة السفينة. اختيار الفلورسنت نموذج مراسل الماوس المناسب أمر حاسم للسماح التحديد السليم من أنواع الخلايا المراد تصويرها.

تطوير نماذج الماوس الفلورسنت التي تتناسب مع الدراسات التي يجري الاضطلاع بها أمر بالغ الأهمية لنجاح التجارب أيضا. التمييز بين اثنين من السكان أكلة من CX3CR1 + / GFP 52. هنا لاحظنا أن عدد الخلايا التسلل الى الجهاز العصبي المركزي في حالة مستقرة نتيجة لجيل الوهم غير ذات أهمية على النقيض من خدرإيه الخلايا دخول الآفة. وتشمل نماذج بديلة أخرى للنظر في الوهم المخدرات التي يسببها 52 أو نماذج الماوس التعايش الالتصاقي 53.

هنا، قدمنا ​​نموذجا إصابة صغيرة محددة وبسيطة وقابلة للتكرار في ذلك من آفة إلى المادة البيضاء الظهري للحبل الشوكي أن من السهل أن الصورة باستخدام المجهر 2 الفوتون. يوفر هذا الأسلوب أيضا آفة قابلة للقياس الكمي لفحص درجة السقم محور عصبي في الأعمدة الظهرية أنه في الأدب وقد يقترن مكملة الأنسجة الثابتة تحليل 16،18،43،48،54. في هذا النموذج، عرض الحيوانات فقط الحد الأدنى من العجز ولا تحتاج إلى رعاية خاصة بعد الاصابة. الدراسات المستقبلية باستخدام تقنيات إصابة العمود سحق والتصوير الظهرية الموصوفة هنا قد تكون أدوات الفحص قوية لتقييم فعالية العلاج لإصابة الحبل الشوكي. ويمكن أن تشمل هذه العلاجات مثبطات جزيء صغير، والمخدرات، ومنتجات الخلية، وترقيع الأنسجة والعلاج اندماجيالصورة. التفاعل بين الضامة، الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية ومن المرجح أيضا أن تلعب دورا في نماذج المرض أخرى في الحبل الشوكي، بما في ذلك التصلب المتعدد، والأورام والتهاب السحايا والتصلب الجانبي الضموري، وربما يكون هذا الأسلوب مفيدا في دراسة هذه الأمراض وكذلك .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CX3CR1 GFP mice Jackson laboratories 5582
Thy-1 YFP H mice Jackson laboratories 3782
Mouse pie cage Braintree Scientific MPC 2 set
60 mm2 Petri dish Corning 430166 For bone marrow isolation
Falcon 40 μm cell filter Fisher Scientific 08-771-1 For bone marrow isolation
1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube Fisher Scientific For bone marrow isolation
21 gauge needle BD 305177 For bone marrow isolation
1 ml syringe BD 309628 For bone marrow isolation
ACK lysis buffer Gibco A10492-01 For bone marrow isolation
HBSS Corning Cellgro 21-022-CV For bone marrow isolation
RPMI media Sigma R8758 For bone marrow isolation
F4/80 antibody Ebioscience 12-4801 PE For FACS verification of chimeras
30 gauge insulin syringe BD 328280 For tail vein injection
Spinal Cord Clamps Narshinge STS-A For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic powder Lang Dental REF1320 For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid Lang Dental REF1404 For imaging
Gelfoam gelatin sponges Pfizer 9034201 For imaging
4-0 Ethilon sutures Ethilon 1667G For surgery
Reflex Clips, 7 mm Kent Scientific INS750344 For surgery. Sterilize before use
Iris Scissors Fine Science Tools 14061-09 For surgery
45/5 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11251-35 For surgery
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 For surgery
30 gauge needle BD 305106 For making access holes in dura
Forceps Dumont #4 Biology tips Dumont 11242-40 For surgery
Needle Drivers Fine Science Tools 12002-12 For surgery
Michel Wound Clip Forceps Kent Scientific INS700753 For surgery
Wound clip remover Fine Science Tools 12033-00 For surgery
O-rings for Forceps Fine Science Tools 11200-00 For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately
Cordless Rechargable Animal trimmer Wahl Series 8900 for surgery
Vetbond 3M 1469SB For surgery
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) Purdue Products L.P. NDC 67618-150-08 For surgery
Nair Hair remover lotion Church & Dwight Co., Inc. NRSL-22329-05 For surgery
Isoflurane Butler Schein NDC 11695-6776-2 Drugs – for surgery
Marcaine Henry Schein NDC 0409-1587-50 Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously
Bupernex Henry Schein 121-7793 Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg
aCSF Chemicals from Sigma 119 mM NaCl
26.2 mM NaHCO3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM glucose		 For surgery
From Cold Spring Harbor Protocols
TRITC-dextran 150,000 MW Sigma T1287 For intravenous administration to label vasculature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  2. Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
  3. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760 (2012).
  4. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
  5. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
  6. Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081 (2013).
  7. Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
  8. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
  9. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
  10. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  11. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
  12. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  13. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
  14. Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
  15. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
  16. Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
  17. Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
  18. Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
  19. Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
  20. Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
  21. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
  22. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113 (2009).
  25. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  26. Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
  27. Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
  28. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  29. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  30. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (1152).
  31. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  32. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  33. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  34. Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
  35. Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693 (2010).
  36. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  37. Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
  38. Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
  39. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
  40. Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208 (2012).
  41. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  42. Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89 (2012).
  43. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
  44. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
  45. Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
  46. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
  47. Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030 (2013).
  48. Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
  49. Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021 (2010).
  50. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  51. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  52. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  53. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544 (2013).
  54. Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).

Tags

علم الأحياء الخلوي، العدد 93، حيوي داخلي، الحبل الشوكي إصابة سحق، والوهم، الخلايا الدبقية الصغيرة، الضامة، الظهرية العمود سحق، والسقم محور عصبي
التصوير حيوي داخلي من محور عصبي التفاعل مع الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة في ماوس الظهرية الإصابات سحق العمود
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evans, T. A., Barkauskas, D. S.,… More

Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury. J. Vis. Exp. (93), e52228, doi:10.3791/52228 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter