Introduction
De ontstekingsreactie ziekte of letsel in het centrale zenuwstelsel (CZS) wordt slecht begrepen, vooral met betrekking tot de interacties tussen immune woonachtig cellen in het weefsel. Onderzoeken van deze cellulaire interacties in het ruggenmerg van bijzonder belang in het levende dier. De enige gemakkelijk bereikbaar CNS kwestie darmkanaal wit is in de dorsale kolommen van het ruggenmerg, waardoor dit een belangrijk gebied waarop de inspanningen op het verbeteren van haalbare experimentele aanpak richten. Deze onderzoeken zijn beperkt vanwege de technische problemen bij de toegang tot en het stabiliseren van de CNS voor beeldvorming. Live beeldvorming in het ruggenmerg beschreven eerder 1-13 echter weinig studies gericht cellulaire beweging ruggenmergletsel dan enkele uren na de eerste insult. De traumatische dwarslaesie is een complexe omgeving, met neuronen, astrocyten, fibroblasten, NG2 voorlopercellen, en immuuncellen including microglia, neutrofielen, macrofagen, T-cellen, B-cellen en dendritische cellen 14,15. Macrofagen zijn de subset van immuuncellen verantwoordelijk voor fagocytose in de laesie, infiltreren uit de circulatie. De rol van deze fagocyten is besproken, met berichten dat deze cellen zowel schadelijke en beschermende rol in het gewonde weefsel kan nemen. Deze rollen variëren van toenemende secundaire axonale dieback na een blessure en handelen op een fagocyterende manier 16-22, aan het nemen op een wondgenezing fenotype en het verminderen van functionele tekorten in de gewonde dier 21,23,24.
Eerder pogingen om macrofagen uit microglia hebben voornamelijk op de morfologie in gezond weefsel te onderscheiden. Echter, geactiveerde microglia en macrofagen tot expressie veel van dezelfde merkers en weer onderscheiden morfologie na verwonding 25-29, waardoor de scheiding van verschillende activiteiten van deze cellen moeilijk bas bestuderened op deze factoren alleen al 30. Deze cellen kunnen worden gescheiden door differentiële expressie van CD45 middels flowcytometrie 33,34, hoewel deze aanpak minder bruikbaar bij het discrimineren deze celtypes in vivo. Gebruik makend van differentiële expressie van CCR2 en CX3CR1 in microglia en macrofagen werd ook onderzocht, maar de dynamische veranderingen in de expressie van deze markers monocyten differentiëren tot macrofagen nauwkeurige analyse 35,36 compliceren. Microglia zijn de bewoner immuuncellen in het CZS en staat op uit de dooierzak voorouders tijdens de foetale ontwikkeling, terwijl de macrofagen zijn afgeleid uit beenmerg voorouders en voer de gewonde CNS na een belediging 31,32. Een alternatieve benadering voor het gebruik morfologie deze twee celtypen te onderscheiden is het beenmerg progenitoren vervangen van een donordier expressie traceerbare marker in de macrofagen afkomstig van de donor stamcellen behoud van de hersencellen, recip-seerde afgeleide microglia. Deze beenmerg chimere modellen worden vaak gebruikt in vele andere toepassingen 37-40. Deze methode heeft unieke restricties op schade aan de integriteit van de bloed-hersenbarrière veroorzaakt door bestraling of cytotoxische geneesmiddelen tegen beenmerg progenitoren roeien in de gastheer, waardoor het gebruik ervan in bepaalde toepassingen beperken. Onlangs, functionele verschillen tussen microglia en macrofagen in de CNS beginnen te worden onderscheiden met behulp van flowcytometrie, gen-chip array analyse en chimerisme methoden 24,26,41-44, die zeer nuttig zijn in de toekomst zal blijken. Hoewel het scheiden van deze twee soorten cellen blijft moeilijk, het begrijpen van hun unieke functies is belangrijk in het leiden tot meer gerichte behandelingen van aandoeningen die zowel microglia en macrofagen in het CZS te betrekken.
Beschrijving van cellulaire interacties binnen de dwarslaesie is voornamelijk afkomstig uit studies met celcultuur modellen. Dit is dUE op de uitdagingen bij beeldvorming zowel het ruggenmerg laesie en immuuncellen samen in een levend dier. Huidige knaagdier modellen van dwarslaesie van verschillende aard en de ernst bevatten kneuzing modellen 45,46, pin prik verwondingen 2, laceratie 47, en de dorsale kolom crush hier 16,18,48 beschreven. Ontsteking in de hersenvliezen neemt toe met de ernst van de verwonding en vormt unieke uitdagingen voor de implantatie van vensters en operaties voor seriële imaging. Sommige van deze uitdagingen zijn de infiltratie van fagocyterende cellen alsmede de vorming van vezelig weefsel op de operatieplaats. Sommige van deze problemen kunnen worden overwonnen door het creëren van kleinere laesies en die de blootgestelde ruggenmerg met niet-immunogene chirurgische bandages tussen de dura en de paraspinous spieren om voor latere heropening chirurgie, zoals hier gedaan om de dorsale kolom verbrijzelingsletsel bestuderen . De mogelijkheid om het beeld alleen het dorsale gedeelte van de spinal koord beperkt ook de keuze van de schade, aangezien contusie modellen eerste beschadiging van het centrale snoer, dikwijls spaarde de dorsale deel van de dorsale kolommen, vooral op vroege tijdstippen na verwonding 45,49. Daarom beschrijven we een eenvoudige traumamodel dat een schone, herhaalbare, rechthoekig gevormde laesie die bruikbaar zijn voor zowel de waarneming van celbeweging in de laesie en eenvoudige kwantificering van axonale ten opzichte van de laesie oplevert.
Protocol
OPMERKING: Alle dieren moeten worden gehuisvest en gebruikt in overeenstemming met de verzorging van dieren en het gebruik commissie (IACUC) bij de instelling. Alle procedures die hier beschreven worden goedgekeurd door de Case Western Reserve University IACUC.
1. Transgene Dieren
- Gebruik in de handel verkrijgbare fluorescerende reporter muizen voor axonen (Thy-1 YFP H) 50 en microglia / monocyten labelen (CX3CR1 GFP / GFP 51; zie de lijst van materialen). Deze muizen moeten worden gekruist en onderhouden als individuele broedkolonies volgens de institutionele verzorging van dieren beleid.
2. Bone Marrow Chimeras
- Identificeer dieren die ten minste 8 weken voor gebruik als ontvanger dieren.
- Plaats gastheer dieren in een cirkelvormige bestraling met kooi om de muiswijzer in staat zelfs gehele lichaamsbestraling waarborgen.
- Timer instellen op een cesium (Cs-137) bestraler een whole-body straling dos beherenleeftijd van 800-1.000 Rads om de dieren volgens de instructies van de fabrikant (voorbeelden die hier getoond worden 980 Rads).
- Terug dieren hun kooien te rusten voor een minimum van 4 uur.
- Kies donordieren van de juiste genotype (zie figuur 2A) als de bron van beenmerg stamcellen.
OPMERKING: De geschikte donoren dieren die verschillende afstammings-specifieke fluorescente reporters van de gastheer verschillende celpopulaties of van hetzelfde genotype als controles identificeren. - Vul een petrischaal met 70% alcohol, en een tweede schotel met 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media en een 40 micrometer cel zeef gedrenkt in de media. Vul een 15 ml conische buis met RPMI media. Houd de gerechten en de buis op ijs.
- Offeren de donordieren door CO 2 stikken volgens de institutionele richtlijnen. Het reinigen van de huid en vacht door het weken het gehele dier met 70% ethanol, totdat alle vacht is nat.
- Verwijder de skin van de onderste helft van dierlijke door te snijden rond het midden van de sectie en het trekken van de huid naar beneden over de achterpoten om de beenspieren volledig bloot.
- Verwijder de tibia van anterior overextension het kniegewricht aan het bot ontwrichten, dan met steriele pincet en schaar, schil en snijd spieren afstand van beide uiteinden van de tibia. Plaats het bot in de petrischaal met alcohol voor 30 sec vervolgens over de cel zeef in de petrischaal met de media.
- Ontwrichten het heupgewricht en het afpellen van de spieren die aan het dijbeen, plaatste het dijbeen kort in alcohol en plaats deze dan in dezelfde cel zeef in de schotel.
- In een weefselkweek kap, steriel schaar afgesneden beide uiteinden van de botten en plaats een 21 gauge naald op een 1 ml spuit in het uiteinde van het bot. Spoel het merg in de 15 ml conische met media. Herhaal de procedure voor de resterende botten.
- De achterkant van de plunjer van een injectiespuit 3 ml, verbrijzeling botuiteinden in de celzeef op de petrischaal om meer cellen te halen.
- Plaats het filter op een 50 ml conische buis en breng media afgezogen cellen uit de 15 ml conische buis. Gebruik de achterkant van de zuiger om het merg breken om een enkele celsuspensie te verkrijgen. Was de 15 ml conische buis, botfragmenten en de cel zeef met 30 ml medium in een 50 ml conische buis.
- Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 500 xg om cellen te pelleteren.
- Lyse rode bloedcellen met 2 ml van ammonium-chloride-kalium (ACK) lysis buffer gedurende 2 min. Blus de lysisbuffer met 10 ml medium dat 10% foetaal runderserum. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5-10 minuten tot pellet.
- Was de cellen eenmaal met 10 ml RPMI medium en tweemaal in zoutoplossing, centrifugeren bij 500 xg gedurende 5-10 minuten tot pellet per wasbeurt.
- Resuspendeer cellen tot een uiteindelijke concentratie van 3 x 10 6 cellen in 200 pl zoutoplossing.
- Transfer 3 x 10 6 beenmerg cellen via staartader injectie in irradiated ontvangende muizen.
- Plaats aangezuurd water (pH 3,0) in de ontvangende kooi en laat muizen om te herstellen.
OPMERKING: Muizen die niet de transplantatie zal sterven binnen 10-14 dagen na de procedure. - Na 8 weken, controleren merg reconstructie door het onderzoek van het perifere bloed afweercellen met behulp van flowcytometrie (Figuur 2B-C).
3. Dorsale Column Crush Injury
LET OP: kies de juiste hersenschim dieren of voor een operatie op basis van het experiment gewenste dubbele transgene dieren. Dieren met ofwel het label bewoner of beenmerg afgeleide cellen werden gecreëerd in de vorige stappen.
- Bereiden en autoclaaf chirurgische instrumenten, waaronder rongeurs, Dumont # 4 tang, iris schaar, pincet voor het houden van weefsels, naald chauffeurs en wond clips.
- Bereid medicijnen toe te dienen aan de muizen voor pijnbestrijding. Bupernex en Marcaine worden gebruikt voor pijnbestrijding. Gebruik de juiste medicijnen zoals vereist eennd goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
- Induceren anesthesie met 4% isofluraan en te onderhouden met 1-2% isofluraan een ademhalingsfrequentie van 60-100 ademhalingen per minuut te bereiken. Solliciteer oog smeermiddel voor de ogen van het dier tot droog onder narcose te voorkomen en te bevestigen gebrek aan reactie te voet knijpen. Houd de temperatuur met behulp van een verwarmingselement en monitoren van de temperatuur met behulp van een rectale sonde.
- Scheer de rug van de muis met een elektrisch scheerapparaat via beoogde ruggenmerg niveau en vervolgens wattenstaafje het gebied driemaal met povidonjood vervolgens tweemaal met 70% alcohol. Plaats het dier op een steriel laken en bedekken het dier met een steriele doek met een gat op een geschikte locatie op de chirurgische lokatie visualiseren. Onderhouden van alle tools op steriele doeken over de hele operatie.
- Snijd de huid langs de middellijn in de gewenste spinale niveau irisschaar de spier aan de achterzijde van het dier bloot.
- Onder een dissecterende microscoop, snijd de rugspieren, met inbegrip van de trapezius en de ligamenten van de latissimus dorsi over de middellijn, waar zij hechten aan de dorsale spinale processen, en de wervelkolom bloot.
- Verwijder de rotator spieren tussen de dorsale en dwarsuitsteeksels van de wervel de lamina van de specifieke wervel onthullen verwijderen (T11 in dit geval). Identificeer T11 door het inbrengen van de laatste niet-drijvende rib op dit proces.
- Plaats tips van rongeurs in de ruimte boven en onder het proces te worden verwijderd en enigszins moet optillen om te controleren of ze goed op hun plaats rond de wervelkolom lamina maar niet te diep om de wervelkolom te verwonden. Sluiten rongeurs in één beweging naar de lamina verwijderen.
- Vergroot de laminectomie zo nodig met behulp van de rongeurs om kleine delen van de resterende wervel te verwijderen.
- Meet 1 mm van de uiteinden van een # 4 pincet door ze tegen een liniaal en markeren met een permanent marker. Meten een 1 mm in scheiding weddenschapween de twee tanden door het vasthouden van de tang tegen de liniaal en bevestig de maximale breedte van de tips tot 1 mm door te schuiven een rubberen pincet ring op zijn plaats over de as van de tang.
- Een klein gat door het met een 30 gauge naald door de dura bij het inbrengen twee punten voor de tanden van de tang om het ruggenmerg.
- Plaats de forceps bij 90 ° hoek met de dura door de gaten om de diepte van 1 mm aangebracht op de zijkanten van de forceps zorg ervoor dat de markering boven de dura. Knijp sluit de tang en houd gedurende 10 sec. Release, en herhaal de tang knijp nog twee keer voor een totaal van drie houdt. Verwijder tang uit het ruggenmerg.
- Doordrenk een absorbeerbare gelatine gecomprimeerd spons in een zoutoplossing en plaats over de schade ter plaatse.
- Met behulp van een rijgsteek, hechten de spier in plaats over de laminectomie en geweekte gelatine spons met # 4 synthetische niet-absorbeerbare nylon hechtingen.
- Clip de huid op zijn plaats met behulp van 5 mm wond clips.
- Injecteer 10 pi Marcaine (1,0 mg / kg) in 490 pl zoutoplossing subcutaan rond de incisie en 5 gl Bupernex (0,1 mg / kg) intramusculair in de gluteus spieren.
- Laat dier te herstellen op een warme pad en controleren op eventuele moeilijkheden bij beweging of tekenen van verlamming van de achterste ledematen. Laat dier niet onbeheerd of in aanwezigheid van andere dieren tot ze volledig hersteld van anesthesie. Gebruik geen dieren die waarneembare motorische stoornissen weer niet gebruiken.
Opmerking Hoewel dit afklemlaesie op elk niveau aan het ruggenmerg kan worden uitgevoerd, praktisch, T10-L4 zich minder technische aspecten van beeldvorming met betrekking tot ademhaling en stabiliserende lichaamsbeweging met klemmen. Klem plaatsing moet worden gewijzigd om de ribbenkast naar afbeelding bij thoracale niveaus.
4. intravitale Imaging
- Bereiden en autoclaaf chirurgische instrumenten, met inbegrip van Dumont # 4 tang, iris schaar, pincet voor het houden van weefsel, naald drivieren en wond clips.
- Verdoven van de muis als voorheen met isofluraan. Induceren anesthesie bij 4-5% en bij 1-2% te handhaven als nodig is om een adem snelheid van 60-100 ademhalingen per minuut en een gebrek aan reactie op de voet snuifje te behouden. Houd de muis verwarmd, monitoren ademhalingsfrequentie wanneer niet beeldvorming en dier temperatuur met een rectale sonde continu te monitoren.
- Het reinigen van de huid rond de wond clips met Betadine en dan alcohol en verwijder de wond clips volgens de instructies van de fabrikant. Zodra wond clips zijn verwijderd, verwijder haar met Nair als dat nodig is en reinig de site opnieuw met povidonjood en 70% alcohol.
- Re-open de huid met een schaar. Verwijder alle resterende hechtingen uit spieren en trek de spieren los met een tang, knippen met een schaar als dat nodig is.
- Onder een dissectiemicroscoop creëren zakken voor het ruggenmerg klemmen hierdoor de spier met schaar op de zijkant van de dwarsuitsteeksels van de ene wervel wervel boven en onder de Laminectomy.
- Plaats klemmen rond elk van deze wervel en draai. Pas als nodig om ruimte voor microscoopobjectief laten het ruggenmerg bereikt. Zorg ervoor dat het ruggenmerg parallel aan de beeldvorming platform en stabiliteit weefsel voor beeldvorming handhaven. Als de ademhaling artefact wordt gezien, past klemmen dienovereenkomstig om beweging in het veld beeldvorming te minimaliseren.
- Bedek de klemmen met parafilm.
- Verwijder de absorbeerbare gelatine gecomprimeerde spons van het ruggenmerg met een pincet, delicaat plukken uit zoveel stukken als mogelijk, ook het verwijderen van zo veel littekenweefsel uit over de hersenvliezen mogelijk. Cover blootgesteld ruggenmerg met een zoutoplossing en nieuwe spons indien nodig.
OPMERKING: Als het bloeden optreedt uit de omliggende spieren, ofwel fervent met spons of cauterize als dat nodig is. Echter, let er dan op het ruggenmerg aan te raken met de cauterisatie. Bedek het ruggenmerg met ofwel een stukje vochtige tissue of gelatine gecomprimeerd spons bij het dichtschroeien. - Maak een well de immersievloeistof vast bij eerste afdichtelement de huid en weefsel met Vetbond, en vervolgens met behulp van tandheelkundige acrylaat opbouwen van een put tussen de twee klemmen van het ruggenmerg houder en de zijkanten van het dier. Wacht tot de acryl kuren.
- Vul het goed met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) en controleer opnieuw voor eventuele bloedingen rond de plaats van de operatie.
- Optioneel op dit moment injecteren fluorescente kleurstoffen verblijf intraveneuze staartader injectie aan de bloedvaten tijdens de beeldvorming te markeren.
OPMERKING: Fluorescent dextran boven 70 kDa wordt vaak gebruikt, hoewel kwantumdots fluorescent gelabelde lectinen ook dienen als nuttige kleurstoffen verblijf. 50 ui 150.000 WM TRITC-dextran is gewoonlijk intraveneus. - Om fysiologisch relevante immune celbeweeglijkheid verkrijgen, moet de temperatuur van de muis worden gehandhaafd op 37 ° C. Beweeg de muis op een temperatuur gecontroleerde omgeving onder de microscoop voor beeldvorming en bewaken van het dier voor de juiste anesThesia niveau door ademhalingsfrequentie en voet knijpen. Bewaak het dier vaak tijdens de beeldvorming naar de diepte van de anesthesie te bepalen, met als doel een ademfrequentie van 60 bereiken - 100 ademhalingen per minuut.
- Zoek de beeldvorming site via de microscoop oculair.
- Pas de 2-foton laser scanning microscoop om een beeld van z-stack nemen elke 30-60 sec tot dynamische beeldvorming gegevens te verkrijgen.
- Zodra beeldvorming is voltooid verwijder het dier uit de verwarmde doos.
- Maak de spinale klemmen en verwijder de muis uit de klemmen. Trek de acryl ver weg van de huid, terwijl het verwijderen van de klemmen.
- Als de muis opnieuw te beelden, plaatst zoutoplossing geweekte gelatine gecomprimeerd spons over het ruggenmerg. Sluit de spieren en huid over de operatie plaats. Laat het dier niet onbeheerd of in aanwezigheid van andere dieren terwijl u herstelt van anesthesie. Als het dier toont geen tekenen van neurologische tekort na herstel, moet het dier worden gedood. Anders euthanaserende muis in een CO 2 kamer voordat het naar voren komt uit narcose volgens IACUC-goedgekeurde euthanasie protocol.
- Analyseren fluorescerende beelden met behulp van beeldanalyse software volgens de instructies van de fabrikant.
Representative Results
Een schematisch diagram van de dorsale kolom afklemlaesie wordt getoond in figuur 1A. Nadat de laesie, wordt het dier bereid en gestabiliseerd intravitale microscopie met spinale klemmen (Figuur 1B). Een beeld direct na de dorsale kolom crush genomen toont een duidelijk zichtbare rechthoekige laesie met een pincet tine inbrengen punten die zijn duidelijk herkenbaar. Axonen bij het letsel site zijn doorgesneden over de spanwijdte van de gehele dorsale kolom (figuur 1C). De integriteit van de bloedvaten blijft intact, en geen bewijs van kleurstof vat lekkage gedetecteerd door fluorescentie. Serial beeldvorming van dezelfde laesie te voeren over weken, kunnen de spieren en de huid worden gehecht over de laminectomie voor volgende re-exposure. Soortgelijke laesiemorfologie gezien op latere tijdstippen (figuur 1D, E). 5 dagen na het letsel, de tang insertieplaatsen zijn nog steeds zichtbaar, maar het letsel is begonnen met het in omvang toenemen due secundaire letsel veroorzaakt door een ontsteking. De axonen aan het caudale einde van de laesie heeft teruggetrokken uit de oorspronkelijke plaats van het letsel door een proces genaamd "axonale afsterving". De axonen in het rostrale einde van de laesie vertoonde Wallerian-achtige degeneratie (figuur 1D, E). Tussen 5 en 22 dagen na verwonding, is de grootte van de laesie gestabiliseerd. Tegelijkertijd kan een grote toestroom van CX3CR1 + cellen zien infiltreren in en rond de afklemlaesie gedurende deze tijdstippen, hoewel de identiteit van deze cellen (microglia versus macrofagen) niet te onderscheiden in het preparaat zoals in figuur 1.
Om het gedrag van microglia en macrofagen binnen de afklemlaesie micro onderscheiden, werd een straling chimeer model gebruikt (beschreven in figuur 2A). Eerst worden de beenmerg stamcellen van een CX3CR1 + / GFP muis vervangen met niet-fluorescerende donor CELls, dus alleen GFP + CNS-resident microglia zijn zichtbaar door fluorescerende beeldvorming. De efficiëntie van beenmerg reconstitutie kan worden bevestigd door flowcytometrie onderzoek van het perifere bloed 8 weken na beenmerg transplantatie (Figuur 2B, C). In figuur 2B, F4 / 80 en GFP positieve macrofagen, in het blauw, worden gedetecteerd in een CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 chimère muis, waarin sommige GFP negatieve, F4 / 80 positieve monocyten aanwezig. In figuur 2C, geen dubbele positieve F4 / 80 en GFP positieve cellen worden gelaten na het vervangen van CX3CR1 + / GFP ontvanger beenmerg met wild type beenmerg. Voordat letsel, zijn microglia gelijkmatig verdeeld binnen het ruggenmerg, het weergeven van een sterk vertakte rustende vorm (figuur 2D). 8 dagen na verwonding, slechts enkele microglia worden gedetecteerd in en rond de laesie. Deze microglia vertonen een amoeboid morfologie (figuur 2E). Tweede beenmerg progenitorcellen in een niet-fluorescerende muis vervangen door beenmergcellen uit een CX3CR1 + / GFP muis, dus waardoor beenmerg afgeleide CX3CR1 + monocyten / macrofagen zichtbaar door GFP fluorescentie (Figuur 2A). Voor schade, alleen GFP + cellen gedetecteerd grotendeels perivasculaire, waarvan is gerapporteerd dat beenmerg afgeleide en voortdurend draaien regelmatig 28 (figuur 2F). Na een crush kunnen CX3CR1 + / GFP cellen gezien langs de binnenkant van bloedvaten rond de laesie (Figuur 2H-J) en de laesie middel gevuld infiltreren CX3CR1 + / GFP macrofagen (figuur 2G).
Time lapse beeldvorming van de dorsale kolommen worden uitgevoerd tot 6 uur. In figuur 3 tonen wij een niet-chimeer CX3CR1 + / GFP muis onmiddellijk na verwonding waarbij cellen uit de circulatie te zienn verhuizen van het bloedvat in de richting van de laesie kern en die zich binnen de blessure website (Figuur 3A, B; Aanvullende Film 1). Beeldanalyse met behulp van fluorescentie-intensiteit om cellen te identificeren kan de maatregelen die door macrofagen (figuur 3A, B; Aanvullende Film 1) paden te volgen. Statistieken afgeleid van de beeldvorming analyse geven de gemiddelde beweeglijkheid van macrofagen in de laesie is 3,6 micrometer / min (Figuur 3D). Tenslotte, op 22 dagen na verwonding, axonen, microglia en macrofagen nog steeds worden gedetecteerd binnen de laesie tonen het gebied van beeldvorming is stabiel over langere perioden (aanvullende film 2).
Figuur 1: Oprichting en sequentiële beeldvorming van de dorsale kolom crush. (A) De dorsalekolom crush wordt uitgevoerd door het verwijderen van de dorsale proces van de wervel op het niveau van de rente. Pincet ingebracht in de dorsale kolom van het ruggenmerg 1 mm van elkaar en zijn dan gesloten 3 keer om de in paarse letsel veroorzaken. (B) Het dier wordt dan gepositioneerd ruggenmerg klemmen om stabiliteit te verkrijgen voor intravitale beeldvorming. (C) Onmiddellijk na het letsel, kan de tang insertieplaatsen (rood ovaal) en de rechthoekige crush volume (grijze doos) duidelijk worden aangegeven. Neuronen van het dorsale wortel te zien (witte pijlen), alsmede de gewonden uiteinden van de axonen aan de caudale kant van de laesie (gevulde pijlpunten). (D) 5 dagen na verwonding, de tang insertieplaatsen (rood ovaal ) en de omvang van de laesie (grijs kader) nog gemakkelijk gevisualiseerd. De laesie is toegenomen in omvang sinds de eerste belediging. Axonen ondergaan Wallerian-achtige degeneratie kan rostraal van de laesie (open pijlpunten) in additi gezien wordenop neuronen van het dorsale wortels (witte pijlen) en de uiteinden van beschadigde axonen (witte pijlen). (E) 22 dagen na verwonding, de laesie blijft herkenbaar met gelijke afmetingen van de schade na 5 dagen. Noteer het grote aantal CX3CR1 + cellen in en rond de verwonde plaats. Kenmerken gelabeld zijn dezelfde als in (D). Alle schaalbalken = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: De bouw van chimere muizen om CX3CR1 + / GFP tot expressie CNS-resident microglia of beenmerg-afgeleide macrofagen in de dorsale kolom afklemlaesie volgen. (A) Een schematisch diagram van de chimere muizen generatie met ofwel CX3CR1 + / GFP expressie microglia of macrofagen. Eerst worden Thy-1 H YFP muizen bestraald en het beenmerg wordt gereconstitueerd met beenmergcellen geïsoleerd uit een CX3CR1 + / GFP muizen, resulterend in een chimeer muis waarvan macrofagen GFP +. Ten tweede worden Thy-1 YFP H / CX3CR1 + / GFP muizen bestraald en het beenmerg wordt gereconstitueerd met beenmergcellen geïsoleerd uit een niet fluorescerende muis, waardoor een chimere muis waarvan microglia GFP +. (B) Voorbeeld van doorstroomcytometrie gegevens met F4 / 80 + en CX3CR1 GFP + cellen in het bloed van een chimeer dier met een CX3CR1 + / GFP beenmerg donor getransplanteerd in een bestraalde C57BL / 6 ontvanger. Cellen afkomstig van de CX3CR1 positieve donoren die positief voor zowel GFP en F4 / 80 zijn weergegeven in het blauw gemarkeerde gebied. (C) Voorbeeld van doorstroomcytometrie gegevens F4 / 80 + en CX3CR1 GFP + cellen in een chimeer dier met een C57BL6 donor beenmerg getransplanteerd in een iruitgestraalde CX3CR1 + / GFP ontvanger. Let op het ontbreken van dubbele positieve CX3CR1 + / GFP en F4 / 80 cellen in het blauw gemarkeerde gebied. (D) Een intravitale twee-foton microscopische momentopname van een muis uit de eerste chimeer regeling, waaruit blijkt GFP + microglia met vertakte morfologie binnen de dorsale kolom (pijlpunt). Deze cellen worden afgewisseld tussen axonen (geel) in de dorsale wortel en de dorsale kolom. Schaal bar = 100 urn. (E) Intravitale beeldvorming van dezelfde muis (B) 8 dagen na verwonding dorsale kolom toont enkele CX3CR1 + microglia met grote en amoeboid gevormde cellichamen die ontbreken processen (pijlpunt). Schaal bar = 100 urn. (F) Foto van een muis uit de tweede chimere regeling (A) toont weinig GFP + macrofagen in het CZS parenchym. Schaal bar = 100 urn. (G) Intravitale beeldvorming van dezelfde muis (F) 8 dagen na dorsale kolom letsel onthult alarge toevloed van macrofagen in en rond de laesie. Schaal bar = 100 urn. (H) Een hogere vergroting beeld van CX3CR1 + bloed afgeleide cellen in contact met de schepen in de verwonde dieren. Schaalbalk = 30 um. (I) een reconstructie van CX3CR1 cellen in contact met het vat, bekeken vanuit het vat. Schaalbalk = 30 um. (J) Een reconstructie van CX3CR1 cellen in contact met het vat, gezien van buiten het vat. Schaal bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 :. Representatieve cell tracking data in een niet-chimeer CX3CR1 + / GFP muis direct na het dorsale kolom verpletterenletsel. (A) Een momentopname van CX3CR1 + microglia en macrofagen om beschadigde zenuwbanen (geel) van aanvullende Film 1 onmiddellijk na dorsale kolom crush. (B) De paden (grijs) door de CX3CR1 + cellen (A) gedurende een 110 min intravitale opnamesessie. (C) Een tijd gecodeerde weergave van de tracks in (B). Sporen gekleurd basis van hun tijd binnen de gehele 110 minuten film, zoals in de tijdbalk. (D) Histogram van algemene motiliteit van de CX3CR1 + cellen. Alle schaal bars zijn 30 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende Film 1: Vertegenwoordiger intravitale film direct na dorsale kolom verbrijzelingsletsel in de dubbele heterozygote Thy-1 YFP / +
Aanvullende Movie 2:. Vertegenwoordiger intravitale film op 22 dagen na de dorsale kolom afklemlaesie in de dubbele heterozygote Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + muis Hier afgebeeld is een representatieve film genomen in een muis 22 dagen na de eerste dorsale kolom oogje letsel bij spinale niveau T11. De injury bevindt zich aan de rechterbovenhoek van het frame. Axonen (geel) oplopend rostraal worden weergegeven in de rechterbenedenhoek. De dorsale ader en bloedvaten worden gelabeld met TRITC-dextran (rood). CX3CR1 + cellen in de laesie beweging langzamer vergeleken met die onmiddellijk na het letsel. Schaal bar = 50 micrometer. Totale tijd: 90 min. Afspeelsnelheid: 600x.
Discussion
Beeldvorming interacties van verschillende celtypes in hun eigen weefsel compartimenten tijdens daaropvolgende pathologie in real-time heeft grote belangstelling gegenereerd. Binnen het dichte net van de CNS, cel-cel contact en signalering met aangrenzende cellen zijn essentieel voor de normale functie en voor het begrijpen van CZS pathologie. Hier beschrijven we het gebruik van 2-foton laser scanning microscopie voor waarneming van cellulaire verkeer binnen een mechanische laesie in het ruggenmerg. Naast de kwaliteit van de chirurgie en weefselbereiding, mechanische stabiliteit van het weefsel is essentieel voor een succesvolle time-lapse microscopie, met name de isolatie van het ruggenmerg inademt bewegingsartefacten. Stabiliteit kan worden beoordeeld door te kijken voor beweging van het ruggenmerg onder een dissectie microscoop die overeenkomt met de hartslag en ademhaling van het dier. Stabiliteit moeten worden beoordeeld, zowel tijdens het uitvoeren van de operatie en ook onmiddellijk voor het begin van beeldvorming. Als de animal is niet stabiel, aanpassingen moeten worden gedaan om de plaatsing en de dichtheid van het ruggenmerg klemmen. Celtype specifieke fluorescente reporter muismodellen combinatie met beenmerg hersenschim benaderingen hebben toegelaten dat de identificatie van monocytcellen versus microglia en axonen. Eerdere studies hebben aangetoond dat op basis van bloed monocyten en niet microglia zijn verantwoordelijk voor secundaire axonale schade na trauma met behulp van de hier 43 beschreven methode. Dextran geconjugeerde kleurstof vat zorgt voor identificatie van het vaartuig, zowel aan bezienswaardigheden te bieden en om inbreuken op de integriteit vaartuig te identificeren. De keuze van de geschikte fluorescente reporter muismodel cruciaal om de juiste identificatie van het gewenste celtypes te beelden.
Ontwikkeling van fluorescente muismodellen die voor de studies ondernomen zijn ook cruciaal voor het succes van experimenten. Onderscheid te maken tussen de twee fagocytisch populaties van CX3CR1 + / GFP 52. Hier hebben we vastgesteld dat het aantal cellen infiltreren in het CZS bij steady state als gevolg van chimeer generatie onbeduidend in tegenstelling tot het gevoellooser cellen die in de laesie. Andere alternatieve modellen te beschouwen, omvatten drugs veroorzaakte chimera 52 of parabiotic muismodellen 53.
Hier tonen we een specifieke, eenvoudige en reproduceerbare kleine letselmodel die resulteert in een laesie op het dorsale witte stof van het ruggenmerg die gemakkelijk beeld met de 2-foton microscopie. Deze werkwijze verschaft ook een meetbaar laesie om de mate van axonale zullen verdwijnen in de dorsale kolommen die in de literatuur is gekoppeld met aanvullende vaste weefselonderzoek 16,18,43,48,54 assay. In dit model, dieren geven slechts minimale tekorten en vereisen geen speciale zorg na een blessure. Toekomstige onderzoeken waarin de dorsale kolom crush en beeldvormende technieken die hier beschreven zijn krachtige screening hulpmiddelen om de werkzaamheid van behandeling van ruggenmergletsel beoordelen. Deze behandelingen kunnen bestaan uit kleine molecule inhibitoren, drugs, mobiele producten, weefseltransplantaten en combinatorische behandelings. De wisselwerking tussen macrofagen, microglia en neuronen waarschijnlijk ook een rol bij andere ziektemodellen in het ruggenmerg, waaronder multiple sclerose, tumors, meningitis en amyotrofe laterale sclerose spelen, en deze techniek kan bruikbaar zijn in de studie van dergelijke ziekten en .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
| Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
| Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
| 60 mm2 Petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
| Falcon 40 μm cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
| 1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
| 21 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
| ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
| HBSS | Corning Cellgro | 21-022-CV | For bone marrow isolation |
| RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
| F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
| 30 gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
| Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
| Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
| Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
| Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9034201 | For imaging |
| 4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
| Reflex Clips, 7 mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
| 45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
| 30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
| Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
| Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
| Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
| Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
| O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
| Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
| Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
| Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
| Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
| Marcaine | Henry Schein | NDC 0409-1587-50 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
| Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
| aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
For surgery From Cold Spring Harbor Protocols |
| TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |
References
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081 (2013).
- Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
- Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
- Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
- Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
- Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113 (2009).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
- Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (1152).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
- Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693 (2010).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
- Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89 (2012).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
- Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030 (2013).
- Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
- Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021 (2010).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544 (2013).
- Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).
