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Neuroscience

एक माउस पृष्ठीय कॉलम कुचलने चोट में Microglia और मैक्रोफेज साथ Axonal सहभागिता की intravital इमेजिंग

Published: November 23, 2014 doi: 10.3791/52228
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Neurosciences, Case Western Reserve University, 2Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University, 3Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में बीमारी या चोट के भड़काऊ प्रतिक्रिया खराब विशेष रूप से ऊतक के भीतर प्रतिरक्षा और निवासी कोशिकाओं के बीच बातचीत का संबंध है, समझा जाता है। रीढ़ की हड्डी में इन सेलुलर बातचीत की जांच रहने वाले जानवर में विशेष रुचि के हैं। केवल आसानी से सुलभ सीएनएस सफेद पदार्थ पथ यह संभव प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में सुधार के प्रयासों पर ध्यान केंद्रित करने की है जिस पर एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है, जिससे रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय स्तंभों में है। इन जांच की वजह से पहुँचने और इमेजिंग के लिए सीएनएस स्थिर में तकनीकी कठिनाई को सीमित कर दिया गया है। रीढ़ की हड्डी में लाइव इमेजिंग प्रारंभिक अपमान के बाद कुछ ही घंटों के परे एक रीढ़ की हड्डी में चोट में इससे पहले, हालांकि, कुछ अध्ययनों 1-13 संबोधित किया सेलुलर आंदोलन वर्णित किया गया है। दर्दनाक रीढ़ की हड्डी घाव न्यूरॉन्स, astrocytes, fibroblasts, NG2 पूर्वज कोशिकाओं, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं includi के साथ एक जटिल माहौल हैmicroglia, न्यूट्रोफिल, मैक्रोफेज, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और वृक्ष के समान कोशिकाओं 14,15 एनजी। मैक्रोफेज प्रचलन से घुसपैठ घाव में phagocytosis के लिए जिम्मेदार प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सबसेट हैं। इन phagocytic कोशिकाओं की भूमिका इन कोशिकाओं घायल ऊतकों में हानिकारक और सुरक्षात्मक भूमिकाओं दोनों पर ले जा सकते हैं यह दर्शाता है कि रिपोर्ट के साथ, बहस की गई है। इन भूमिकाओं घायल जानवर 21,23,24 में कार्यात्मक घाटा एक घाव पर लेने phenotype के उपचार और कम करने के लिए, एक चोट के बाद माध्यमिक axonal dieback बढ़ रही है और एक phagocytic ढंग 16-22 में अभिनय से लेकर।

इससे पहले, मुख्य रूप से स्वस्थ ऊतकों में आकृति विज्ञान पर भरोसा किया है microglia से मैक्रोफेज भेद करने के लिए प्रयास करता है। हालांकि, सक्रिय microglia और मैक्रोफेज एक ही मार्करों के कई एक्सप्रेस और बस का अध्ययन करने के लिए मुश्किल इन कोशिकाओं की विभिन्न गतिविधियों की जुदाई, जिससे चोट 25-29 के बाद पृथक आकृति विज्ञान प्रदर्शित30 अकेले इन कारकों पर एड। इस दृष्टिकोण vivo में इन प्रकार की कोशिकाओं के भेदभाव में कम उपयोगी है, हालांकि इन कोशिकाओं, 33,34 प्रवाह cytometry का उपयोग CD45 के अंतर अभिव्यक्ति के द्वारा अलग किया जा सकता है। Monocytes के रूप में इन मार्करों की अभिव्यक्ति में गतिशील परिवर्तन सटीक विश्लेषण 35,36 जटिल हो सकता है मैक्रोफेज में अंतर हालांकि microglia और मैक्रोफेज में CCR2 और CX3CR1 का उपयोग अंतर अभिव्यक्ति भी पता लगाया गया है। मैक्रोफेज अस्थि मज्जा पूर्वज से ली गई है और एक अपमान 31,32 के बाद घायल सीएनएस में प्रवेश कर रहे हैं, जबकि microglia, सीएनएस में निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं और भ्रूण के विकास के दौरान जर्दी थैली पूर्वज से उत्पन्न होती हैं। इन दो प्रकार की कोशिकाओं भेद करने के लिए आकृति विज्ञान का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सीएनएस निवासी संरक्षण, जबकि दाता पूर्वज से व्युत्पन्न मैक्रोफेज में एक मिल मार्कर व्यक्त एक दाता जानवर से पूर्वज के साथ अस्थि मज्जा की जगह है, recipient व्युत्पन्न microglia। ये अस्थि मज्जा चिमेरिक मॉडल आमतौर पर कई अन्य अनुप्रयोगों 37-40 में उपयोग किया जाता है। इस विधि जिससे कुछ अनुप्रयोगों में इसके उपयोग को सीमित करने, मेजबान में मज्जा पूर्वज उन्मूलन करने के लिए इस्तेमाल विकिरण या साइटोटोक्सिक दवाओं की वजह से रक्त मस्तिष्क बाधा की अखंडता को क्षति के साथ जुड़े अद्वितीय निरंतर है। हाल ही में, सीएनएस में microglia और मैक्रोफेज के बीच कार्यात्मक भेद प्रवाह cytometry, जीन चिप सरणी विश्लेषण और भविष्य में बहुत उपयोगी साबित होगा जो काइमेरावाद विधियों 24,26,41-44, का उपयोग करके पहचाना जा शुरुआत कर रहे हैं। इन दो प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए मुश्किल रहता है, उनके अद्वितीय कार्य को समझने सीएनएस के भीतर दोनों microglia और मैक्रोफेज शामिल है कि विकारों के अधिक लक्षित उपचार के लिए अग्रणी में महत्वपूर्ण है।

रीढ़ की हड्डी में घाव के भीतर सेलुलर बातचीत का विवरण मुख्य रूप से सेल संस्कृति मॉडल शामिल अध्ययन से आया है। इस घ हैएक जीवित प्राणी में एक साथ इमेजिंग दोनों रीढ़ की हड्डी घाव और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ शामिल चुनौतियों के लिए UE। अलग-अलग प्रकार और गंभीरता की रीढ़ की हड्डी में चोट के वर्तमान कृंतक मॉडल कुचलन मॉडल 45,46, पिन चुभन चोटों 2, पंगु बनाना 47, और यहाँ 16,18,48 वर्णित पृष्ठीय स्तंभ कुचलने चोट शामिल हैं। तानिका में सूजन की चोट की गंभीरता के साथ बढ़ जाती है और धारावाहिक इमेजिंग के लिए विंडोज या सर्जरी के आरोपण के लिए अद्वितीय चुनौतियों बन गया है। इन चुनौतियों में से कुछ phagocytic कोशिकाओं की घुसपैठ के साथ ही शल्य साइट से अधिक रेशेदार ऊतकों की पीढ़ी में शामिल हैं। पृष्ठीय स्तंभ कुचलने चोट का अध्ययन करने के लिए यहां किया जाता है के रूप में इन मुद्दों में से कुछ, छोटे घावों बनाने और ड्यूरा और बाद में फिर से खोलने की सर्जरी के लिए अनुमति देने के लिए paraspinous मांसपेशियों के बीच गैर-immunogenic सर्जिकल ड्रेसिंग के साथ उजागर रीढ़ की हड्डी को कवर द्वारा दूर किया जा सकता है । स्पिन की छवि ही पृष्ठीय भाग करने की क्षमताकुचलन मॉडल मुख्य रूप से अक्सर चोट 45,49 के बाद विशेष रूप से जल्दी समय बिंदुओं पर, पृष्ठीय स्तंभों की सबसे पृष्ठीय भाग बख्शते, केंद्रीय कॉर्ड को नुकसान हो के बाद से अल कॉर्ड भी, चोट के चुनाव को सीमित करता है। इसलिए, हम घाव के भीतर और घाव को axonal सापेक्ष स्थिति के लिए आसान मात्रा का ठहराव के लिए सेल आंदोलन का अवलोकन दोनों के लिए उपयोगी है कि एक साफ, repeatable, आयताकार आकार का घाव है कि पैदावार एक साधारण चोट मॉडल का वर्णन है।

Protocol

नोट: सभी जानवरों रखे और संस्था में जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुसार उपयोग किया जाना चाहिए। यहाँ वर्णित सभी प्रक्रियाओं केस वेस्टर्न रिजर्व विश्वविद्यालय IACUC द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं।

1. ट्रांसजेनिक जानवर

  1. एक्सोन (तेरा -1 YFP एच) 50 और microglia / monocytes लेबल करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों का उपयोग करें (CX3CR1 GFP / GFP के 51, माल की सूची देखें)। इन चूहों intercrossed और संस्थागत पशु की देखभाल की नीतियों के अनुसार अलग-अलग प्रजनन कालोनियों के रूप में बनाए रखा जाना चाहिए।

2. अस्थि मज्जा काइमेरा

  1. प्राप्तकर्ता जानवरों के रूप में उपयोग के लिए उम्र के कम से कम आठ हफ्तों हैं कि जानवरों को पहचानें।
  2. यहां तक ​​कि, पूरे शरीर विकिरण सुनिश्चित करने की स्थिति में माउस पकड़ के लिए बनाया गया एक परिपत्र विकिरण पकड़े पिंजरे में मेजबान जानवरों रखें।
  3. एक सीज़ियम पर टाइमर सेट (CS-137) irradiator एक पूरे शरीर विकिरण डॉस प्रशासन के लिएनिर्माता के निर्देशों के अनुसार जानवरों के लिए 800-1000 rads की उम्र (यहाँ दिखाया उदाहरण 980 rads) कर रहे हैं।
  4. 4 घंटे की एक न्यूनतम के लिए आराम करने के लिए उनके पिंजरों के लिए जानवरों लौटें।
  5. उपयुक्त जीनोटाइप के दाता जानवरों चुनें मज्जा पूर्वज कोशिकाओं के स्रोत के रूप में (2A चित्रा देखें)।
    नोट: उपयुक्त दाताओं अलग सेल आबादी, या नियंत्रण के रूप में एक ही जीनोटाइप में से एक की पहचान करने के लिए मेजबान से अलग वंश विशेष फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त जानवर हैं।
  6. एक पेट्री 70% शराब के साथ पकवान, और 10 मिलीलीटर रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) मीडिया और मीडिया में भिगो एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के साथ एक दूसरे पकवान भरें। RPMI मीडिया के साथ एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब भरें। बर्फ पर व्यंजन और ट्यूब रखें।
  7. संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार कंपनी द्वारा दो asphyxiation के दाता जानवरों बलिदान। सभी फर गीला है जब तक 70% इथेनॉल के साथ पूरे पशु भिगोने से त्वचा और फर से साफ करें।
  8. एसके निकालेंमध्य वर्ग के आसपास काटने और पूरी तरह से पैर की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए पिछले पैरों पर त्वचा के नीचे खींच कर पशु के निचले आधे से में।
  9. , अस्थि भंग तो बाँझ संदंश और कैंची, छील का उपयोग करने और टिबिया के दोनों सिरों से दूर मांसपेशियों में कटौती करने के लिए संयुक्त घुटने पर पूर्वकाल overextension द्वारा टिबिया निकालें। मीडिया वाले पेट्री डिश के अंदर सेल झरनी के लिए स्थानांतरण तो अप करने के लिए 30 सेकंड के लिए शराब के साथ पेट्री डिश में हड्डी रखें।
  10. हिप संयुक्त हटाना और फीमर से जुड़ी मांसपेशियों को दूर छील, शराब में फीमर संक्षेप में रखा जाता है और फिर पकवान के अंदर एक ही सेल झरनी में जगह है।
  11. एक टिशू कल्चर हुड में, हड्डियों के दोनों सिरों को काट और हड्डी के अंत में एक 1 मिलीलीटर सिरिंज पर एक 21 गेज सुई डालने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करें। मीडिया के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में मज्जा फ्लश। शेष हड्डियों के लिए प्रक्रियाओं को दोहराएँ।
  12. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से सवार के पीछे का उपयोग, क्रश हड्डी सेल में समाप्त होता हैपेट्री डिश पर झरनी अधिक कोशिकाओं को निकालने के लिए।
  13. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर फिल्टर प्लेस और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से aspirated कोशिकाओं के साथ मीडिया हस्तांतरण। एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के क्रम में मज्जा को कुचलने के लिए सवार के पीछे का प्रयोग करें। 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब, हड्डी के टुकड़े और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मीडिया के 30 मिलीलीटर के साथ सेल झरनी धो लें।
  14. गोली कोशिकाओं के लिए 500 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  15. अमोनियम क्लोराइड पोटेशियम (एसीके) के 2 मिलीलीटर के साथ lyse लाल रक्त कोशिकाओं को 2 मिनट के लिए बफर lysis। 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मीडिया के 10 एमएल के साथ lysis बफर बुझाना। 500 XG 5-10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र गोली।
  16. प्रत्येक धोने के लिए गोली 5-10 मिनट के लिए 500 XG पर centrifuging, खारा में दो बार RPMI मीडिया के 10 एमएल में एक बार कोशिकाओं को धो लें और।
  17. खारा के 200 μl में 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं Resuspend।
  18. आईआरआर में पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से ट्रांसफर 3 एक्स 10 6 मज्जा कोशिकाओंadiated प्राप्तकर्ता चूहों।
  19. प्राप्तकर्ता पिंजरे में acidified पानी (पीएच 3.0) प्लेस और चूहों को ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं।
    नोट: प्रत्यारोपण प्रक्रिया के बाद 10-14 दिनों के भीतर मर जाएगा असफल कि चूहों।
  20. आठ सप्ताह के बाद, फ्लो (चित्रा 2B-सी) का उपयोग परिधीय रक्त प्रतिरक्षा कोशिकाओं का परीक्षण करके मज्जा पुनर्गठन की पुष्टि करें।

3. पृष्ठीय कॉलम कुचलने चोट

नोट: उपयुक्त कल्पना जानवरों या इच्छित प्रयोग के आधार पर सर्जरी के लिए डबल ट्रांसजेनिक जानवरों चुनें। या तो लेबल किया निवासी या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं के साथ जानवरों पिछले चरणों में बनाया गया था।

  1. तैयार है और Rongeurs सहित सर्जिकल उपकरण, आटोक्लेव, ड्यूमॉन्ट # 4 संदंश, आईरिस कैंची, पकड़े ऊतकों, सुई चालकों और घाव क्लिप के लिए संदंश।
  2. दर्द नियंत्रण के लिए चूहों को प्रशासन के लिए दवाएं तैयार करें। Bupernex और Marcaine सामान्यतः दर्द नियंत्रण के लिए उपयोग किया जाता है। आवश्यकता के रूप में उपयुक्त दवाओं का उपयोग एकएन डी संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) ने मंजूरी दे दी।
  3. 4% isoflurane के साथ संज्ञाहरण प्रेरित और प्रति मिनट 60-100 साँस के एक साँस लेने की दर हासिल करने के लिए 1-2% isoflurane के साथ बनाए रखें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने और पैर चुटकी से प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करने के लिए जानवर की आँखों में आँख स्नेहक लागू करें। एक हीटिंग पैड का उपयोग कर तापमान को बनाए रखने और एक गुदा जांच का उपयोग तापमान की निगरानी।
  4. लक्षित रीढ़ की हड्डी स्तर पर एक इलेक्ट्रिक शेवर के साथ माउस के पीछे दाढ़ी, और उसके बाद दो बार के साथ 70% शराब के बाद povidone आयोडीन के साथ इस क्षेत्र में तीन बार झाड़ू। एक बाँझ कपड़ा पर पशु रखें, और शल्य साइट कल्पना करने के लिए एक उपयुक्त स्थान में कटौती एक छेद के साथ एक और बाँझ कपड़ा के साथ पशु को कवर किया। सर्जरी के दौरान बाँझ पर्दे पर सभी उपकरण बनाए रखें।
  5. जानवर की पीठ पर मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए परितारिका कैंची के साथ वांछित रीढ़ की हड्डी के स्तर पर midline के साथ त्वचा में कटौती।
  6. एक diss के तहतमाइक्रोस्कोप ecting, trapezius और वे पृष्ठीय रीढ़ की प्रक्रियाओं को देते हैं जहां midline के साथ latissimus dorsi की स्नायुबंधन सहित पीठ की मांसपेशियों, कट, और कशेरुका स्तंभ बेनकाब।
  7. विशिष्ट बांस के पटल प्रकट करने के लिए बांस के पृष्ठीय और अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं के बीच रोटेटर मांसपेशियों निकालें (इस मामले में T11) हटा दिया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया पर पिछले गैर अस्थायी पसली की प्रविष्टि द्वारा T11 पहचानें।
  8. हटाया जा करने की प्रक्रिया के ऊपर और नीचे अंतरिक्ष में Rongeurs के सुझावों को सम्मिलित करें और सुनिश्चित करें कि वे नहीं रीढ़ की हड्डी को चोट पहुंचाना भी गहरी वर्टिब्रल लामिना चारों ओर जगह में सुरक्षित हैं, लेकिन बनाने के लिए थोड़ा उठा। एक आंदोलन में बंद Rongeurs लामिना दूर करने के लिए।
  9. शेष बांस के छोटे भागों को दूर करने के लिए Rongeurs का उपयोग करके जरूरत के रूप में laminectomy के विस्तार।
  10. एक शासक के खिलाफ उन्हें पकड़ और एक स्थायी मार्कर के साथ अंकन द्वारा एक # 4 संदंश के सुझावों से 1 मिमी उपाय। जुदाई शर्त में 1 मिमी उपायशासक के खिलाफ संदंश धारण करके दो tines के समझना और संदंश की शाफ्ट से अधिक जगह में एक रबर संदंश अंगूठी फिसलने से एक मिमी के लिए सुझावों की अधिकतम चौड़ाई तय कर लो।
  11. रीढ़ की हड्डी का उपयोग करने के लिए संदंश के tines के लिए दो प्रविष्टि बिंदुओं पर ड्यूरा के माध्यम से एक 30 गेज सुई डालने से एक छोटा सा छेद बनाएं।
  12. मार्क ड्यूरा ऊपर है यकीन कर रही है, संदंश के पक्षों पर चिह्नित 1 मिमी की गहराई तक छेद के माध्यम से ड्यूरा करने के लिए एक 90 डिग्री के कोण पर संदंश tines के डालें। संदंश को बंद करने और 10 सेकंड के लिए पकड़ पिंच। रिलीज, और दोहराने संदंश तीन धारण की कुल के लिए दो से अधिक बार निचोड़। रीढ़ की हड्डी से संदंश निकालें।
  13. चोट साइट पर खारा और जगह में से absorbable जिलेटिन संकुचित स्पंज का एक टुकड़ा लेना।
  14. एक चल सिलाई का प्रयोग, # 4 सिंथेटिक गैर absorbable नायलॉन sutures के साथ laminectomy से अधिक जगह में मांसपेशियों और लथपथ जिलेटिन स्पंज सीवन।
  15. 5 मिमी घाव सीएलआई का उपयोग कर जगह में त्वचा क्लिपपुनश्च।
  16. Intramuscularly gluteus मांसपेशियों में 10 μl Marcaine 490 चीरा साइट के आसपास खारा subcutaneously की μl और 5 μl Bupernex (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) में (1.0 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्षन।
  17. जानवर एक गर्म पैड पर वसूली और हिंद अंग में किसी भी आंदोलन में कठिनाइयों या पक्षाघात के लक्षण के लिए निगरानी करने की अनुमति। पूरी तरह से संज्ञाहरण से बरामद तक पहुंच के बाहर या अन्य जानवरों की उपस्थिति में पशु मत छोड़ो। नमूदार मोटर घाटे को प्रदर्शित करने वाले किसी भी जानवरों का प्रयोग न करें।
    नोट: इस क्रश घाव रीढ़ की हड्डी के साथ किसी भी स्तर पर प्रदर्शन किया जा सकता है, व्यावहारिक रूप से, T10-L4 साँस लेने और clamps का उपयोग कर शरीर के आंदोलन को स्थिर करने के लिए सम्मान के साथ इमेजिंग के लिए कम तकनीकी चुनौतियां खड़ी। क्लैंप नियुक्ति वक्ष स्तर पर छवि के लिए रिब पिंजरे के आसपास संशोधित किया जाना चाहिए।

4. intravital इमेजिंग

  1. तैयार है और ऊतक, सुई डी के आयोजन के लिए ड्यूमॉन्ट # 4 संदंश, आईरिस कैंची, संदंश सहित सर्जिकल उपकरण, आटोक्लेवनदियों और घाव क्लिप।
  2. Isoflurane के साथ पहले के रूप में माउस anesthetize। 4-5% से कम संज्ञाहरण प्रेरित और प्रति मिनट 60-100 साँस के एक सांस की दर और पैर चुटकी के जवाब की कमी को बनाए रखने की जरूरत के रूप में 1-2% पर बनाए रखें। गरम माउस रखें इमेजिंग नहीं जब सांस की दर पर नजर रखने और लगातार एक गुदा जांच के साथ पशु तापमान की निगरानी।
  3. शराब तो घाव betadine के साथ क्लिप और आसपास की त्वचा साफ और निर्माता के निर्देशों के अनुसार घाव क्लिप को हटा दें। घाव क्लिप को हटा रहे हैं एक बार, अगर जरूरत नायर के साथ बालों को हटाने और povidone आयोडीन और 70% शराब के साथ फिर से साइट को साफ।
  4. कैंची के साथ त्वचा फिर से खोलने। पेशी से किसी भी शेष टांके निकालें और यदि आवश्यक हो तो कैंची से काटने, संदंश के साथ अलग मांसपेशी खींच।
  5. रीढ़ की हड्डी के ऊपर और lami नीचे बांस एक वर्टिब्रल स्तर पर अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं के पक्ष में कैंची के साथ मांसपेशियों के काटने से clamps के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, जेब बनाnectomy।
  6. इन बांस से प्रत्येक के आसपास clamps के प्लेस और कस लें। रीढ़ की हड्डी तक पहुँचने के लिए माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए कमरे की अनुमति के लिए जरूरत के रूप में समायोजित करें। रीढ़ की हड्डी इमेजिंग मंच के समानांतर है कि सुनिश्चित करें, और इमेजिंग के लिए ऊतक स्थिरता बनाए रखने के लिए। साँस लेने विरूपण साक्ष्य में देखा जाता है, तो इमेजिंग क्षेत्र में गति कम करने के लिए तदनुसार clamps के रद्दोबदल।
  7. Parafilm के साथ clamps के कवर।
  8. संदंश के साथ रीढ़ की हड्डी से absorbable जेलाटीन स्पंज संकुचित निकालें नाजुक भी संभव के रूप में तानिका भर से ज्यादा के रूप में निशान ऊतक को हटाने, के रूप में संभव के रूप में कई टुकड़ों बंद उठा। अगर जरूरत कवर खारा और नए स्पंज के साथ रीढ़ की हड्डी से अवगत कराया।
    नोट: किसी भी खून बह रहा है स्पंज के साथ कट्टर या जरूरत के रूप में दाग़ना, या तो आसपास के मांसपेशियों से होता है। हालांकि, दाग़ना साथ रीढ़ की हड्डी को छूने के लिए नहीं ख्याल रखना। Cauterizing जब घटा ऊतक या जिलेटिन संकुचित स्पंज का एक टुकड़ा के साथ या तो रीढ़ की हड्डी को कवर किया।
  9. एक wel के बनाएँएल पहले रीढ़ की हड्डी धारक के दो clamps और जानवर के पक्षों के बीच एक अच्छी तरह का निर्माण करने के लिए दंत एक्रिलिक का उपयोग कर तो Vetbond साथ त्वचा और ऊतकों को सील, और द्वारा विसर्जन द्रव धारण करने के लिए। एक्रिलिक इलाज करने तक प्रतीक्षा करें।
  10. कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (ACSF) के साथ अच्छी तरह से भरें और सर्जरी स्थल के चारों ओर खून बह रहा है किसी के लिए फिर से जाँच करें।
  11. वैकल्पिक रूप से इस बिंदु पर, इमेजिंग के दौरान रक्त वाहिकाओं को उजागर करने के पूंछ नस में इंजेक्शन द्वारा नसों फ्लोरोसेंट पोत रंजक इंजेक्षन।
    नोट: क्वांटम डॉट्स और fluorescently लेबल lectins के रूप में भी उपयोगी पोत रंगों की सेवा हालांकि 70 केडीए से ऊपर फ्लोरोसेंट dextran अक्सर प्रयोग किया जाता है। 150,000 WM TRITC-dextran के 50 μl आमतौर पर नसों के द्वारा इंजेक्शन है।
  12. Physiologically प्रासंगिक प्रतिरक्षा सेल गतिशीलता को प्राप्त करने के लिए, माउस का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए। इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप के तहत एक तापमान नियंत्रित वातावरण के लिए माउस ले जाएँ और सही Anes के लिए पशु की निगरानीसांस की दर और पैर चुटकी द्वारा थेसिया स्तर। प्रति मिनट 100 साँस - 60 के एक सांस की दर हासिल करने का लक्ष्य, संज्ञाहरण की गहराई का निर्धारण करने के लिए इमेजिंग के दौरान अक्सर जानवरों की निगरानी करें।
  13. माइक्रोस्कोप ऐपिस के माध्यम से इमेजिंग साइट का पता लगाएँ।
  14. गतिशील इमेजिंग डेटा प्राप्त करने के लिए एक z ढेर छवि हर 30-60 सेकंड लेने के लिए 2 फोटॉन लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन समायोजित करें।
  15. इमेजिंग सत्र पूरा हो गया है एक बार गर्म बॉक्स से पशु हटा दें।
  16. रीढ़ की हड्डी में clamps के ढीला और clamps से माउस को हटा दें। Clamps के हटाने के दौरान त्वचा से अच्छी तरह से दूर एक्रिलिक खींचो।
  17. माउस फिर imaged किया जा रहा है, रीढ़ की हड्डी के ऊपर खारा लथपथ जिलेटिन स्पंज संकुचित जगह है। सर्जरी साइट पर मांसपेशियों और त्वचा को बंद करें। संज्ञाहरण से उबरने जबकि नायाब जानवर छोड़ने के लिए या अन्य जानवरों की उपस्थिति में न करें। पशु वसूली के बाद तंत्रिका संबंधी घाटे के कोई लक्षण दिखाता है, तो पशु euthanized किया जाना चाहिए। अन्यथा, euthanizeसीओ 2 चैम्बर में माउस यह IACUC को मंजूरी दे दी इच्छामृत्यु प्रोटोकॉल के अनुसार संज्ञाहरण से उभर पहले।
  18. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण।

Representative Results

पृष्ठीय स्तंभ को कुचलने के घाव का चित्रण एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। घाव के बाद, पशु तैयार किया जाता है और रीढ़ की हड्डी में clamps (चित्रा 1 बी) का उपयोग intravital माइक्रोस्कोपी के लिए स्थिर हो। पृष्ठीय स्तंभ कुचलने की चोट के बाद तुरंत ले लिया एक छवि स्पष्ट रूप से पहचान कर रहे हैं कि संदंश शाखा प्रविष्टि अंक के साथ एक स्पष्ट रूप से दिखाई आयताकार घाव से पता चलता है। चोट स्थल पर axons पूरे पृष्ठीय स्तंभ (चित्रा 1C) की अवधि भर में कटे हुए हैं। रक्त वाहिकाओं की अखंडता को अक्षुण्ण बनी हुई है, और पोत डाई रिसाव के कोई सबूत नहीं प्रतिदीप्ति द्वारा खोजा गया था। सप्ताह भर में एक ही घाव के धारावाहिक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, मांसपेशियों और त्वचा बाद फिर से लोगों तक पहुंचाने के लिए laminectomy अधिक sutured किया जा सकता है। इसी प्रकार के घाव आकृति विज्ञान बाद में समय अंक (आंकड़े -1 डी, ई) में देखा जाता है। 5 दिनों चोट के बाद, संदंश प्रविष्टि साइटों अभी भी दिखाई दे रहे हैं, लेकिन घाव आकार विकास में वृद्धि करने के लिए शुरू हो गया हैसूजन की वजह से माध्यमिक चोट करने के लिए UE। घाव की दुम अंत में एक्सोन "axonal dieback" नामक एक प्रक्रिया के माध्यम से चोट के प्रारंभिक साइट से मुकर गए हैं। घाव का व्याख्यान चबूतरे वाला अंत में एक्सोन Wallerian तरह अध: पतन (चित्रा -1, ई) का प्रदर्शन किया। दिन 5 और चोट के बाद 22 के बीच, घाव के आकार स्थिर हो गया है। चित्रा 1 में दिखाया गया है कि इन कोशिकाओं (मैक्रोफेज बनाम microglia) की पहचान की तैयारी में प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, हालांकि समवर्ती, CX3CR1 + कोशिकाओं की एक बड़ी बाढ़, में और इन समय बिंदुओं के दौरान क्रश घाव के आसपास घुसपैठ देखा जा सकता है।

क्रश घाव microenvironment भीतर microglia और मैक्रोफेज के व्यवहार को अलग करने के लिए आदेश में, एक विकिरण कल्पना मॉडल (2A चित्रा में उल्लिखित) का इस्तेमाल किया गया था। सबसे पहले, एक CX3CR1 / + GFP माउस का अस्थि मज्जा पूर्वज कोशिकाओं गैर फ्लोरोसेंट दाता सेल के साथ बदल रहे हैंरास, इस प्रकार केवल + GFP सीएनएस निवासी microglia फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा दिखाई दे रहे हैं। मज्जा पुनर्गठन की दक्षता में 8 सप्ताह मज्जा प्रत्यारोपण (चित्रा 2B, सी) के बाद परिधीय रक्त की परीक्षा के प्रवाह cytometry द्वारा की पुष्टि की जा सकती है। चित्रा 2B, F4 / 80 और GFP सकारात्मक मैक्रोफेज में, नीले रंग में प्रकाश डाला है, जिसमें कुछ GFP के नकारात्मक लेकिन F4 / 80 सकारात्मक monocytes भी मौजूद हैं, एक CX3CR1 / + GFP → C57BL 6 / चिमेरिक माउस में पता चला रहे हैं। चित्रा -2, कोई डबल सकारात्मक F4 / 80 और GFP सकारात्मक कोशिकाओं में जंगली प्रकार अस्थि मज्जा के साथ CX3CR1 / + GFP के प्राप्तकर्ता अस्थि मज्जा के प्रतिस्थापन के बाद छोड़ दिया जाता है। चोट से पहले, microglia समान रूप से एक आराम, डालियां फैला हुआ आकारिकी (चित्रा 2 डी) प्रदर्शित करने, रीढ़ की हड्डी के भीतर वितरित कर रहे हैं। 8 दिन की चोट के बाद, केवल कुछ ही microglia में और घाव के आसपास का पता लगाया जा सकता है। ये microglia एक अमीबीय आकारिकी (चित्रा 2 ई) प्रदर्शित करते हैं। दूसरा, हड्डीएक गैर फ्लोरोसेंट माउस में मज्जा पूर्वज कोशिकाओं इसलिए अस्थि मज्जा CX3CR1 + monocytes / GFP प्रतिदीप्ति द्वारा दिखाई मैक्रोफेज (2A चित्रा) व्युत्पन्न प्रतिपादन, एक CX3CR1 / + GFP के माउस से मज्जा कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं। चोट से पहले, केवल + GFP का पता चला कोशिकाओं अस्थि मज्जा ली गई है और लगातार एक नियमित आधार 28 (चित्रा 2 एफ) पर मोड़ पर होने की सूचना दी गई है, जो काफी हद तक परिवाहकीय हैं। एक क्रश चोट के बाद, CX3CR1 / + GFP कोशिकाओं घाव (चित्रा 2H-जे) के आसपास के रक्त वाहिकाओं के अंदर के साथ देखा जा सकता है, और घाव केंद्र CX3CR1 / + GFP के मैक्रोफेज (चित्रा 2 जी) घुसपैठ से भर जाता है।

पृष्ठीय स्तंभों की समय चूक इमेजिंग 6 घंटा अप करने के लिए किया जा सकता है। जिसमें प्रचलन से कोशिकाओं को देखने जा सकते हैं चित्रा 3 में, हम चोट के बाद तुरंत एक गैर चिमेरिक CX3CR1 / + GFP माउस दिखानेएन घाव कोर की ओर रक्त वाहिका से बाहर जा रहा है और चोट साइट (चित्रा 3 ए, बी, पूरक मूवी 1) के भीतर चल। मैक्रोफेज (; पूरक मूवी 1 चित्रा 3 ए, बी) द्वारा उठाए गए रास्तों को ट्रैक कर सकते कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग छवि विश्लेषण। इमेजिंग विश्लेषण से निकाली गई सांख्यिकी घाव में मैक्रोफेज की औसत गतिशीलता 3.6 माइक्रोन / मिनट (चित्रा 3 डी) है दिखाते हैं। चोट, एक्सोन, microglia और मैक्रोफेज के बाद 22 दिनों के अभी भी इमेजिंग के क्षेत्र का प्रदर्शन घाव के भीतर पाया जा सकता है पर अंत में, समय (अनुपूरक मूवी 2) की लंबी अवधि में स्थिर है।

चित्रा 1
चित्रा 1: निर्माण और पृष्ठीय स्तंभ कुचलने चोट के अनुक्रमिक इमेजिंग। (ए) पृष्ठीयस्तंभ कुचलने चोट ब्याज के स्तर पर बांस के पृष्ठीय प्रक्रिया को हटाने के द्वारा किया जाता है। संदंश के अलावा रीढ़ की हड्डी 1 मिमी की पृष्ठीय स्तंभ में डाला जाता है और फिर बैंगनी रंग में दिखाया गया है घाव का उत्पादन करने के लिए 3 बार बंद हो जाती हैं। (बी) जानवर तो रीढ़ की हड्डी के साथ तैनात है intravital इमेजिंग के लिए स्थिरता प्राप्त करने के लिए clamps। (सी) इसके तत्काल बाद चोट के बाद, संदंश प्रविष्टि साइटों (लाल अंडाकार) और आयताकार कुचलने चोट मात्रा (ग्रे बॉक्स) स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है। पृष्ठीय जड़ों में axons (सफेद तीर), साथ ही घाव (भरा तीर सिर) की दुम तरफ axons की घायल समाप्त होता देखा जा सकता है। (डी) 5 दिनों चोट के बाद, संदंश प्रविष्टि साइटों (लाल अंडाकार ), और घाव (ग्रे बॉक्स की हद) अभी भी आसानी से देखे जा सकते हैं। घाव प्रारंभिक अपमान के बाद से आकार में वृद्धि हुई है। Wallerian तरह अध: पतन के दौर से गुजर axons additi में घाव (खुला तीर सिर) को चोंच पर देखा जा सकता हैपृष्ठीय जड़ों (सफेद तीर) और घायल axons की समाप्त होता है (सफेद तीर)। (ई) 22 दिनों की चोट के बाद में axons करने पर, घाव साइट अभी भी 5 दिनों के बाद चोट के समान आयामों के साथ पहचान योग्य है। में और घायल स्थल के चारों ओर CX3CR1 + कोशिकाओं की बड़ी संख्या नोट करें। लेबल वाली सुविधाएँ (डी) के रूप में ही हैं। सभी पैमाने सलाखों के 200 माइक्रोन =। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2: काइमेरिक चूहों के निर्माण पृष्ठीय स्तंभ को कुचलने के घाव में सीएनएस निवासी microglia या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज व्यक्त CX3CR1 / + GFP के ट्रैक करने के लिए। (ए) CX3CR1 / + GFP या तो मील व्यक्त साथ काइमेरिक चूहों पीढ़ी का एक योजनाबद्ध आरेखcroglia या मैक्रोफेज। सबसे पहले, तेरा-एक YFP एच चूहों किरणित रहे हैं और अस्थि मज्जा जिसका मैक्रोफेज + GFP हैं एक chimeric माउस, जिसके परिणामस्वरूप एक CX3CR1 / + GFP के माउस से अलग मज्जा कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन किया गया है। दूसरा, तेरा-एक YFP एच / CX3CR1 / + GFP चूहों किरणित रहे हैं और अस्थि मज्जा जिसका microglia + GFP हैं एक chimeric माउस के उत्पादन, एक गैर फ्लोरोसेंट माउस से अलग मज्जा कोशिकाओं के साथ पुनर्गठन किया गया है। (बी) के डेटा प्रवाह cytometry का उदाहरण एक विकिरणित C57BL 6 / प्राप्तकर्ता में प्रत्यारोपित एक CX3CR1 / + GFP के मज्जा दाता के साथ एक chimeric पशु से रक्त में F4 / 80 + और ​​CX3CR1 + GFP कोशिकाओं के साथ। एक C57BL6 साथ एक chimeric जानवर में F4 / 80 + और ​​CX3CR1 GFP + कोशिकाओं के साथ डाटा प्रवाह cytometry के नीले क्षेत्र पर प्रकाश डाला में दोनों GFP और F4 / 80 के लिए सकारात्मक रहे हैं कि CX3CR1 सकारात्मक दाताओं से ली गई कोशिकाओं दिखाए जाते हैं। (सी) उदाहरण दाता मज्जा एक आईआर में प्रत्यारोपितनिकलने CX3CR1 / + GFP के प्राप्तकर्ता। नीले क्षेत्र पर प्रकाश डाला भीतर डबल सकारात्मक CX3CR1 / + GFP और F4 / 80 कोशिकाओं की कमी पर ध्यान दें। (डी) पहले चिमेरिक योजना से एक माउस के एक intravital दो photon सूक्ष्म स्नैपशॉट, पृष्ठीय भीतर डालियां फैला हुआ आकृति विज्ञान के साथ + GFP microglia दिखा स्तंभ (तीर सिर)। इन कोशिकाओं पृष्ठीय रूट और पृष्ठीय स्तंभ में axons (पीला) के बीच interspersed हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ई) में एक ही माउस के intravital इमेजिंग (बी) के 8 दिन पृष्ठीय स्तंभ चोट प्रक्रियाओं (तीर सिर) कमी कर रहे हैं कि बड़े और अमीबीय आकार का सेल शरीर के साथ कुछ CX3CR1 + microglia बाद पता चलता है। सीएनएस पैरेन्काइमा भीतर अल्प + GFP मैक्रोफेज दिखा स्केल बार में दूसरा चिमेरिक योजना से एक माउस के = 100 माइक्रोन। (एफ) स्नैपशॉट (ए),। 100 माइक्रोन। आठ दिनों पृष्ठीय स्तंभ चोट के बाद (जी) (एफ) में एक ही माउस के intravital इमेजिंग अल पता चलता = स्केल बारमें और घाव के आसपास मैक्रोफेज की ARGE तांता। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (एच) रिहाई जानवर में जहाजों के साथ संपर्क में CX3CR1 + रक्त ली गई कोशिकाओं के एक उच्च बढ़ाई तस्वीर। स्केल बार = 30 माइक्रोन। पोत के अंदर से देखा पोत, के साथ संपर्क में CX3CR1 कोशिकाओं (i) एक पुनर्निर्माण। स्केल बार = 30 माइक्रोन। (जे) पोत के साथ संपर्क में CX3CR1 कोशिकाओं के पुनर्निर्माण, पोत के बाहर से देखा। स्केल बार = 20 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 3 :. तुरंत पृष्ठीय स्तंभ कुचलने के बाद एक गैर चिमेरिक CX3CR1 / + GFP के माउस में प्रतिनिधि सेल ट्रैकिंग डेटाचोट। (ए) तुरंत एक पृष्ठीय स्तंभ कुचलने की चोट के बाद CX3CR1 + microglia और पूरक मूवी 1 से मैक्रोफेज के आसपास क्षतिग्रस्त एक्सोन (पीला) के एक स्नैपशॉट। (बी) (ग्रे) पथ (ए) में CX3CR1 + कोशिकाओं द्वारा उठाए गए एक 110 दौरान न्यूनतम intravital इमेजिंग सत्र। (सी) (बी) में पटरियों के एक समय कोडित प्रतिनिधित्व। समय पट्टी में दिखाया गया के रूप में पटरियों, पूरे 110 मिनट की फिल्म के भीतर अपने समय के आधार पर रंग के होते हैं। CX3CR1 + कोशिकाओं के समग्र गतिशीलता (डी) हिस्टोग्राम। सभी स्केल सलाखों 30 माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 1: तुरंत डबल विषम युग्मज में पृष्ठीय स्तंभ कुचलने की चोट के बाद प्रतिनिधि intravital फिल्म तेरा -1 YFP / + GFP / + माउस। intravital रीढ़ की इमेजिंग T11 स्तर पर एक पृष्ठीय स्तंभ कुचलने चोट के तुरंत बाद किया गया था। राइट पैनल CX3CR1 + microglia और मैक्रोफेज के आंदोलन से पता चलता है। सेल आंदोलन के रास्तों बाएं पैनल पर सफेद पटरियों के रूप में दिखाया जाता है। चोट ऊपरी बाएं कोने में स्थित है। CX3CR1 + कोशिकाओं इन पटरियों के साथ चोट की साइट में चलती देखा जा सकता है। Axons पीले रंग में दिखाया गया है। स्केल बार 40 माइक्रोन =। कुल समय: 110 मिनट। प्लेबैक गति: 300x।

पूरक मूवी 2:। डबल विषम युग्मज तेरा -1 YFP / / + CX3CR1 GFP / + माउस में पृष्ठीय स्तंभ को कुचलने के घाव के बाद 22 दिनों में प्रतिनिधि intravital फिल्म यहाँ दिखाया गया 22 दिनों प्रारंभिक पृष्ठीय स्तंभ कुचलने के बाद एक माउस में ले लिया एक प्रतिनिधि फिल्म है रीढ़ की हड्डी स्तर T11 पर चोट। injUry फ्रेम के ऊपरी दाहिने कोने पर स्थित है। Axons (पीला) आरोही rostrally नीचे सही पर दिखाए जाते हैं। पृष्ठीय नस और रक्त वाहिकाओं (लाल) TRITC-dextran के साथ लेबल रहे हैं। तुरंत चोट के बाद उन लोगों की तुलना में एक धीमी गति से घाव चाल भीतर CX3CR1 + कोशिकाओं। स्केल बार 50 माइक्रोन =। कुल समय: 90 मिनट। प्लेबैक गति: 600x।

Discussion

वास्तविक समय में विकृति आगामी दौरान उनके मूल ऊतक डिब्बों में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की इमेजिंग बातचीत बहुत रुचि उत्पन्न किया है। सीएनएस, सेल सेल संपर्क के घने नेटवर्क के भीतर और आसन्न कोशिकाओं के साथ संकेत सामान्य कार्य के लिए और सीएनएस विकृति को समझने के लिए आवश्यक हैं। यहाँ, हम रीढ़ की हड्डी में एक यांत्रिक घाव के भीतर सेलुलर आंदोलन के अवलोकन के लिए 2 फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन किया। सर्जरी और ऊतक तैयारी की गुणवत्ता के अलावा, ऊतक के यांत्रिक स्थिरता सफल समय चूक माइक्रोस्कोपी, गति विरूपण साक्ष्य साँस लेने से रीढ़ की हड्डी की विशेष रूप से अलगाव के लिए सर्वोपरि है। स्थिरता जानवर के दिल की दर या सांस लेने से मेल खाती है कि एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे रीढ़ की हड्डी के आंदोलन के लिए देख द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। सर्जरी प्रदर्शन और भी इमेजिंग शुरुआत से ठीक पहले, जबकि स्थिरता दोनों मूल्यांकन किया जाना चाहिए। एनिमा हैंएल समायोजन रीढ़ की हड्डी clamps के स्थान और तंगी के लिए किया जाना चाहिए, स्थिर नहीं है। अस्थि मज्जा कल्पना दृष्टिकोण के साथ युग्मित सेल प्रकार विशिष्ट फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस मॉडल microglia और एक्सोन बनाम monocytic कोशिकाओं की पहचान की अनुमति दी है। पिछले अध्ययनों से रक्त व्युत्पन्न monocytes और नहीं microglia यहां 43 में वर्णित पद्धति का उपयोग कर आघात के बाद माध्यमिक axonal क्षति के लिए जिम्मेदार हैं कि पता चला है। Dextran संयुग्मित पोत डाई दोनों स्थलों प्रदान करने और पोत अखंडता में उल्लंघनों की पहचान करने के पोत की पहचान के लिए अनुमति देता है। उपयुक्त फ्लोरोसेंट संवाददाता माउस मॉडल का चयन वांछित सेल प्रकार की उचित पहचान imaged किया जा करने की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है।

किए जा रहे अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं कि फ्लोरोसेंट माउस मॉडल का विकास भी प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। CX3CR1 / + GFP के दो phagocytic आबादी के बीच भेद 52 परिरक्षित नहीं है, भले ही विकिरण के बाद रीढ़ की हड्डी में सेल घुसपैठ में कमी दर्ज की गई है। यहाँ हम कल्पना पीढ़ी का एक परिणाम के रूप में स्थिर अवस्था में सीएनएस में घुसपैठ कोशिकाओं की संख्या सुन्न करने के लिए इसके विपरीत में नगण्य है कि मनायाघाव में प्रवेश कोशिकाओं के एर। विचार करने के लिए अन्य वैकल्पिक मॉडल दवा प्रेरित काइमेरा 52 या parabiotic माउस मॉडल 53 में शामिल हैं।

यहाँ, हम दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि के लिए आसान है कि रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सफेद बात करने के लिए एक घाव में यह परिणाम है कि एक विशिष्ट, सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य छोटी सी चोट मॉडल प्रस्तुत किया है। इस विधि को भी साहित्य में पूरक तय ऊतक विश्लेषण 16,18,43,48,54 के साथ युग्मित किया गया है कि पृष्ठीय कॉलम में axonal dieback की डिग्री परख करने के लिए एक quantifiable घाव प्रदान करता है। इस मॉडल में, जानवरों केवल न्यूनतम घाटे को प्रदर्शित करने और चोट के बाद कोई विशेष देखभाल की आवश्यकता होती है। यहाँ वर्णित पृष्ठीय स्तंभ कुचलने चोट और इमेजिंग तकनीक के उपयोग के भविष्य के अध्ययन रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए इलाज की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण हो सकता है। इन उपचार छोटे अणु निरोधक, दवाओं, सेल के उत्पादों, ऊतक ग्राफ्ट और मिश्रित उपचार शामिल हो सकते हैंएस। मैक्रोफेज, microglia और न्यूरॉन्स के बीच परस्पर क्रिया भी एकाधिक काठिन्य, ट्यूमर, दिमागी बुखार और amyotrophic पार्श्व काठिन्य सहित रीढ़ की हड्डी में अन्य रोग मॉडल, में एक भूमिका निभा सकती हैं, और इस तकनीक के रूप में अच्छी तरह से इन बीमारियों के अध्ययन में उपयोगी हो सकता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CX3CR1 GFP mice Jackson laboratories 5582
Thy-1 YFP H mice Jackson laboratories 3782
Mouse pie cage Braintree Scientific MPC 2 set
60 mm2 Petri dish Corning 430166 For bone marrow isolation
Falcon 40 μm cell filter Fisher Scientific 08-771-1 For bone marrow isolation
1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube Fisher Scientific For bone marrow isolation
21 gauge needle BD 305177 For bone marrow isolation
1 ml syringe BD 309628 For bone marrow isolation
ACK lysis buffer Gibco A10492-01 For bone marrow isolation
HBSS Corning Cellgro 21-022-CV For bone marrow isolation
RPMI media Sigma R8758 For bone marrow isolation
F4/80 antibody Ebioscience 12-4801 PE For FACS verification of chimeras
30 gauge insulin syringe BD 328280 For tail vein injection
Spinal Cord Clamps Narshinge STS-A For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic powder Lang Dental REF1320 For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid Lang Dental REF1404 For imaging
Gelfoam gelatin sponges Pfizer 9034201 For imaging
4-0 Ethilon sutures Ethilon 1667G For surgery
Reflex Clips, 7 mm Kent Scientific INS750344 For surgery. Sterilize before use
Iris Scissors Fine Science Tools 14061-09 For surgery
45/5 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11251-35 For surgery
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 For surgery
30 gauge needle BD 305106 For making access holes in dura
Forceps Dumont #4 Biology tips Dumont 11242-40 For surgery
Needle Drivers Fine Science Tools 12002-12 For surgery
Michel Wound Clip Forceps Kent Scientific INS700753 For surgery
Wound clip remover Fine Science Tools 12033-00 For surgery
O-rings for Forceps Fine Science Tools 11200-00 For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately
Cordless Rechargable Animal trimmer Wahl Series 8900 for surgery
Vetbond 3M 1469SB For surgery
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) Purdue Products L.P. NDC 67618-150-08 For surgery
Nair Hair remover lotion Church & Dwight Co., Inc. NRSL-22329-05 For surgery
Isoflurane Butler Schein NDC 11695-6776-2 Drugs – for surgery
Marcaine Henry Schein NDC 0409-1587-50 Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously
Bupernex Henry Schein 121-7793 Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg
aCSF Chemicals from Sigma 119 mM NaCl
26.2 mM NaHCO3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM glucose		 For surgery
From Cold Spring Harbor Protocols
TRITC-dextran 150,000 MW Sigma T1287 For intravenous administration to label vasculature

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 93 intravital रीढ़ की हड्डी को कुचलने चोट कल्पना microglia मैक्रोफेज पृष्ठीय स्तंभ क्रश axonal dieback
एक माउस पृष्ठीय कॉलम कुचलने चोट में Microglia और मैक्रोफेज साथ Axonal सहभागिता की intravital इमेजिंग
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Evans, T. A., Barkauskas, D. S.,… More

Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury. J. Vis. Exp. (93), e52228, doi:10.3791/52228 (2014).

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