Introduction
Den inflammatoriska reaktionen på sjukdom eller skada i det centrala nervsystemet (CNS) är dåligt förstådd, särskilt med avseende på samspelet mellan immun och residensceller i vävnaden. Undersökningar av dessa cellulära interaktioner i ryggmärgen är av särskilt intresse i det levande djuret. Den enda lättillgänglig CNS vita substansen tarmkanalen är i de dorsala kolumnerna i ryggmärgen, vilket gör detta ett viktigt område som att koncentrera insatserna på att förbättra genomförbart experimentellt förhållningssätt. Dessa undersökningar har varit begränsade på grund av den tekniska svårigheter att få tillgång och stabilisera CNS för avbildning. Live avbildning i ryggmärgen har beskrivits tidigare 1-13 dock få studier har tagit upp cellulär rörelse i en ryggmärgsskada utöver några timmar efter den första förolämpning. Den traumatiska ryggmärgsskada är en komplex miljö, med neuron, astrocyter, fibroblaster, NG2 progenitorceller, och immunceller including mikroglia, neutrofiler, makrofager, T-celler, B-celler och dendritiska celler 14,15. Makrofager är den undergrupp av immunceller som är ansvariga för fagocytos i lesionen, infiltrerande från cirkulationen. Den roll som dessa fagocytceller har debatterats, med rapporter som indikerar att dessa celler kan ta på både skadliga och skyddande roller i den skadade vävnaden. Dessa roller allt från ökad sekundär axonal skogsskador efter en skada och agera på ett sätt fagocytisk 16-22, för att ta på en sårläknings fenotyp och minskande funktionella brister i den skadade djuret 21,23,24.
Tidigare försök att skilja makrofager från mikroglia har förlitat sig huvudsakligen på morfologi i frisk vävnad. Men aktiverade mikroglia och makrofager uttrycker många av samma markörer och visa oskiljbara morfologi efter skada 25-29, vilket gör separationen av olika aktiviteter i dessa celler är svåra att studera based på enbart 30 av dessa faktorer. Dessa celler kan separeras genom differentiell expression av CD45 genom att använda flödescytometri 33,34, även om detta tillvägagångssätt är mindre användbar vid diskriminera dessa celltyper in vivo. Använda differentiella uttryck av CCR2 och CX3CR1 i mikroglia och makrofager har också undersökts, även om de dynamiska förändringar i uttrycket av dessa markörer som monocyter differentierar till makrofager kan komplicera noggrann analys 35,36. Mikroglia är bosatta immunceller i CNS och härrör från gulesäcken stamceller under fosterutvecklingen, medan makrofager härrör från benmärgsstamfäder och ange den skadade CNS efter en förolämpning 31,32. Ett alternativt sätt att använda morfologi för att skilja dessa två celltyper är att ersätta benmärgen med stamceller från en donator djur som uttrycker en spårbar markör i makrofagerna härrör från donatorstamfäder, samtidigt som den CNS bosatt, recipient härledda mikroglia. Dessa benmärgs chimära modellerna vanligen används i många andra tillämpningar 37-40. Denna metod har unika förbehåll för de skador på integriteten hos blod-hjämbarriären orsakad av bestrålning eller cytotoxiska läkemedel som används för att utrota märg progenitorer i värden, vilket därmed begränsar dess användning i vissa tillämpningar. Nyligen, är funktionella skillnader mellan mikroglia och makrofager i CNS börjar urskiljas genom flödescytometri, genchip array analys och chimerism metoder 24,26,41-44, vilket kommer att vara mycket användbar i framtiden. Även separera dessa två celltyper är fortfarande svårt, är viktigt för att leda till mer riktade behandlingar av sjukdomar som involverar både mikroglia och makrofager inom CNS förstå deras unika funktioner.
Beskrivning av cellulära interaktioner inom ryggmärgen lesionen har främst kommit från studier som involverar cellodlingsmodeller. Detta är due till de utmaningar som med bild både ryggmärgsskada och immunceller tillsammans i ett levande djur. Nuvarande gnagare modeller av ryggmärgsskada av varierande typ och svårighetsgrad inkluderar kontusion modeller 45,46, pin-prick skador 2, skärsår 47 och rygg kolumnen krosskada beskrivs här 16,18,48. Inflammation i hjärnhinnorna ökar med skadornas och ställer unika utmaningar för implantation av fönster eller operationer för seriell avbildning. Några av dessa utmaningar omfattar infiltrationen av fagocytiska celler såväl som generering av fibrös vävnad över den kirurgiska platsen. Några av dessa frågor kan övervinnas genom att skapa mindre skador och täcker den exponerade ryggmärgen med nonimmunogena kirurgiskt förband mellan dura och paraspinous muskler för att möjliggöra efterföljande återöppnande kirurgi, som görs här för att studera rygg kolumnen krosskada . Förmågan att bilden endast den dorsala delen av spinnal sladden begränsar också valet av skada, eftersom kontusion modeller orsaka främst skador på centrala sladden, ofta skona den mest dorsala delen av dorsala kolonnerna, särskilt vid tidiga tidpunkter efter skada 45,49. Därför beskriver vi en enkel skada modell som ger en ren, repeterbar, rektangulärt formade lesion som är användbar både för observation av cellrörelse inom lesionen och för enkel kvantifiering av axonal position i förhållande till skadan.
Protocol
OBS: Alla djur bör hållas och användas i enlighet med djuromsorg och använda kommitté (IACUC) vid institutionen. Alla förfaranden som beskrivs här är godkända av Case Western Reserve University IACUC.
1. Transgena djur
- Använd kommersiellt tillgängliga fluorescerande reporter möss att märka axoner (Thy-1 YFP H) 50 och mikroglia / monocyter (CX3CR1 GFP / GFP 51, se materiallista). Dessa möss bör intercrossed och underhållas som enskilda häckningskolonier enligt institutionella politik djurskötsel.
2. Benmärg chimärer
- Identifiera djur som är minst åtta veckors ålder för användning som mottagande djur.
- Placera värddjur i en cirkulär bestrålning hålla bur designad för att hålla musen i stånd att säkerställa jämn, helkroppsbestrålning.
- Ställ timern på en cesium (Cs-137) bestrå att administrera en hel-kroppsstrålning dosålder 800-1000 Rads till djuren enligt tillverkarens instruktioner (exempel visas här är 980 Rads).
- Återgå djur till sina burar för att vila i minst 4 h.
- Välj donatordjur av den lämpliga genotypen (se fig 2A) som källa till märg progenitorceller.
OBS: De lämpliga donatorer är djur som uttrycker olika härstamning specifika fluorescerande reportrar från värd att identifiera olika cellpopulationer, eller en av samma genotyp som kontroller. - Fyll en petriskål med 70% alkohol, och en andra skålen med 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -media och en 40 | im cellfilter indränkt i media. Fyll en 15 ml koniska rör med RPMI media. Håll disken och rör på is.
- Offra donatordjuren från CO2 kvävning enligt institutionens riktlinjer. Rengör huden och pälsen genom att blötlägga hela djuret med 70% etanol tills all päls är blöt.
- Avlägsna skin från nedre halvan av animaliska skära runt mittsektionen och dra huden ner över bakbenen till fullo exponera benmusklerna.
- Ta skenbenet genom främre överextension vid knäleden för att flytta ut benet, sedan använda steril pincett och sax, skal och skär muskler bort från båda ändarna av skenbenet. Placera benet i petriskål med alkohol under upp till 30 sek sedan överföra till cellen silen inuti petriskålen innehållande media.
- Rubba höftleden och skala bort musklerna bifogas lårbenet, placerade lårbenet kort i alkohol och sedan placera den i samma cell sil inuti skålen.
- I en vävnadskultur huva, använd steril sax för att skära av båda ändarna av benen och för in en 21 gauge nål på en 1 ml spruta in i änden av benet. Spola märgen i 15 ml koniska med media. Upprepa procedurerna för de återstående benen.
- Använda baksidan av kolven från en 3 ml spruta, krossa benändar i cellensil på petriskål för att utvinna fler celler.
- Placera filtret på toppen av en 50 ml koniska rör och överför media med aspire celler från 15 ml koniska rör. Använd baksidan av kolven för att krossa märg i syfte att erhålla en enkelcellsuspension. Tvätta 15 ml koniska rör, benfragment och cellen sil med 30 ml av media i en 50 ml koniska rör.
- Centrifugera cellerna under 5 min vid 500 xg för att pelletera cellerna.
- Lyse röda blodkroppar med 2 ml Ammonium Klorid-Kalium (ACK) lysbuffert i 2 min. Släck lysbuffert med 10 ml medium innehållande 10% fetalt bovint serum. Centrifugera vid 500 xg under 5 till 10 minuter för att pelletera.
- Tvätta cellerna en gång i 10 ml RPMI-medium och två gånger i saltlösning, centrifugering vid 500 xg under 5 till 10 minuter för att pelletera för varje tvätt.
- Resuspendera celler till en slutlig koncentration av 3 x 10 6 celler i 200 | il koksaltlösning.
- Överför 3 x 10 6 benmärgsceller via svansvenen injektion i irradiated recipientmöss.
- Placera syrad vatten (pH 3,0) i mottagaren bur och låta möss att återhämta sig.
OBS: Möss som misslyckas transplantationen kommer att dö inom 10-14 dagar efter ingreppet. - Efter åtta veckor, verifiera märg rekonstituering genom att undersöka perifera blodimmunceller med användning av flödescytometri (Figur 2B-C).
3. Dorsal Kolumn krosskada
OBS: Välj lämpliga chimera djur eller dubbla transgena djur för kirurgi baserad på önskad experimentet. Djur med antingen märkta bosatta eller benmärgs härledda celler skapades i föregående steg.
- Förbered och autoklaveras kirurgiska verktyg, inklusive rongeurs, Dumont # 4 pincett, iris sax, pincett för innehav vävnader, nål förare och sårklämmor.
- Förbered mediciner för att administrera till mössen för smärtkontroll. Bupernex och Marcaine används vanligtvis för smärtkontroll. Använd lämpliga mediciner som krävsnd godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
- Inducera anestesi med 4% isofluran och underhålla med 1-2% isofluran för att uppnå en andningshastighet av 60 till 100 andetag per minut. Applicera ögon smörjmedel till djurets ögon att förhindra torrhet under narkos och bekräfta bristande respons fots nypa. Håll temperaturen med hjälp av en värmedyna och övervaka temperaturen med hjälp av en rektal sond.
- Raka baksidan av musen med en elektrisk rakapparat över riktade ryggmärgsnivå, och sedan ta provet området tre gånger med povidon-jod, följt av två gånger med 70% alkohol. Placera djuret på en steril duk, och täcka djuret med en annan steril duk med ett hål skärs i ett lämpligt läge för att visualisera det kirurgiska stället. Behåll alla verktyg på sterila draperier hela operationen.
- Skär huden längs mittlinjen vid den önskade spinal nivå med iris sax för att exponera muskeln på baksidan av djuret.
- Under en dissecting mikroskop, skär ryggmusklerna, inklusive trapezius och ligament i latissimus dorsi längs mittlinjen där de fäster vid de dorsala spinal processer, och exponera ryggraden.
- Avlägsna rotator musklerna mellan de dorsala och tvärutskotten av kotan för att avslöja lamell av den specifika kota som skall avlägsnas (T11 i detta fall). Identifiera T11 genom införande av den sista icke-flytande ribba på denna process.
- Sätt tips av rongeurs i utrymmet ovanför och under processen tas bort och lyft något för att se till att de är ordentligt på plats runt ryggraden lamina men inte alltför djupt att skada ryggraden. Stäng rongeurs i en rörelse för att ta bort lamina.
- Större laminektomi efter behov med hjälp av de rongeurs att avlägsna små delar av den återstående kota.
- Mät 1 mm från tips av en # 4 pincett genom att hålla dem mot en linjal och märkning med en permanent markör. Mät en 1 mm i separations satsninglan två pinnar genom att hålla tången mot linjalen och fixa den maximala bredden av tipsen till 1 mm genom att skjuta en gummi pincett ring på plats över axeln av tången.
- Skapa ett litet hål genom att föra in en 30 gauge nål genom dura vid de två inmatningspunkterna för pinnarna av tången för att komma till ryggmärgen.
- Sätt pincetten pinnarna i 90 ° vinkel mot dura genom hålen till djup av 1 mm markerade på sidorna av pincetten och se märket är över dura. Nyp stänga tången och håll i 10 sek. Release och upprepa pincett pressa två gånger för totalt tre innehar. Ta pincett från ryggmärgen.
- Blöt en bit absorber gelatin komprimerad svamp i saltlösning och plats över skadan webbplats.
- Med hjälp av en rakstygn, sutur muskeln på plats över laminektomi och dränkts gelatinsvamp med # 4 syntetiska icke absorber nylonsuturer.
- Clip huden på plats med 5 mm sår clips.
- Injicera 10 ul Marcaine (1,0 mg / kg) i 490 | il koksaltlösning subkutant runt snittstället och 5 pl Bupernex (0,1 mg / kg) intramuskulärt i gluteus muskler.
- Låt djuret att återhämta sig på en varm dyna och övervaka eventuella svårigheter rörelse eller tecken på förlamning i bakbenen. Lämna inte djur utan uppsikt eller i närvaro av andra djur, tills helt återhämtat sig från anestesi. Använd inte något djur som visar observer motoriken.
OBS: Även om detta krossa lesion kan utföras på alla nivåer längs ryggmärgen, praktiskt, T10-L4 pose färre tekniska utmaningar för avbildning med avseende på andning och stabilisera kroppsrörelse använder klämmor. Clamp placering måste modifieras runt bröstkorgen till bilden vid bröstkorg nivåer.
4. Intravital Imaging
- Förbered och autoklaveras kirurgiska verktyg, inklusive Dumont # 4 pincett, iris sax, pincett för att hålla vävnad, nål dfloder och lindade klipp.
- Bedöva musen som förut med isofluran. Inducera anestesi på 4-5% och hålls kvar vid 1-2% som behövs för att upprätthålla en andningsfrekvens på 60-100 andetag per minut och en brist på respons på foten nypa. Håll musen uppvärmda, övervaka andningsfrekvens när de inte imaging och kontinuerligt övervaka djurens temperatur med en rektal sond.
- Rengör huden runt såret klipp med Betadine och sedan alkohol och ta bort sårklämmor enligt tillverkarens anvisningar. När lindade klipp tas bort, ta bort hår med Nair om det behövs och rengör platsen igen med povidon-jod och 70% alkohol.
- Åter öppna huden med en sax. Ta bort eventuella återstående suturer från muskler och dra muskler isär med pincett, skära med sax om det behövs.
- Under ett dissektionsmikroskop, skapa fickor för ryggmärgen klämmor genom skärning av muskeln med en sax vid sidan av de tvärgående processerna på kotan en vertebral nivå ovanför och under laminectomy.
- Placera klämmor runt varje av dessa kota och dra åt. Justera vid behov för att ge utrymme för mikroskop mål att nå ryggmärgen. Se till att ryggmärgen är parallell med bildplattform, och hålla vävnader stabilitet för avbildning. Vid andnings artefakt ses, justera klämmor följaktligen att minimera rörelse i bildfältet.
- Täck klämmorna med parafilm.
- Avlägsna absorber gelatin komprimerade svamp från ryggmärgen med pincett, fint plocka bort så många bitar som möjligt, även ta bort så mycket ärrvävnad från över mening som möjligt. Cover exponerade ryggmärgen med koksaltlösning och ny svamp vid behov.
OBS: Om någon blödning uppstår från den omgivande muskler, antingen ståndaktig med svamp eller bränna efter behov. Men se till att inte röra ryggmärgen med diatermi. Täck ryggmärgen med antingen en bit fuktad vävnad eller gelatin komprimerad svamp när etsande. - Skapa en well att hålla nedsänkning vätskan genom att först täta hud och vävnad med Vetbond, och sedan använda dentala akryl för att bygga upp en bra mellan de två klämmorna i ryggmärgen hållaren och sidorna av djuret. Vänta tills akryl härdar.
- Fyll bra med artificiell cerebrospinalvätska (aCSF) och kontrollera igen för någon blödning runt operationsstället.
- Eventuellt på denna punkt, injicera fluorescerande fartygs färgämnen intravenöst av svansvenen injektion för att lyfta fram de blodkärl under avbildning.
OBS: Fluorescerande dextran över 70 kDa används ofta, även om kvantprickar och fluorescerande lektiner tjänar också som användbara fartygs färgämnen. 50 pl 150.000 WM TRITC-dextran vanligtvis intravenöst. - För att erhålla fysiologiskt relevant immun cellmotilitet, måste temperaturen på musen hållas vid 37 ° C. Flytta musen till en temperatur kontrollerad miljö under mikroskop för avbildning och övervaka djuret för korrekta AnesThesia nivå genom andningsfrekvens och fot nypa. Övervaka djuret ofta under avbildning för att bestämma anestesidjup, som syftar till att uppnå en andningsfrekvens på 60 till 100 andetag per minut.
- Leta reda på bild platsen genom mikroskopet okularet.
- Justera 2-fotonen laserskanning mikroskop för att ta ett z-stack bild varje 30-60 sek för att få dynamiska bilddata.
- När avbildning session är avslutad avlägsna djuret från den uppvärmda lådan.
- Lossa spinal klämmor och ta bort musen från klämmorna. Dra akryl långt borta från huden när du tar bort klämmorna.
- Om musen ska avbildas igen placerar saltlösning indränkt gelatin komprimerad svamp över ryggmärgen. Stäng muskeln och huden över operationsstället. Lämna inte djuret utan uppsikt eller i närvaro av andra djur för att tillfriskna från anestesi. Om djuret visar några tecken på neurologisk underskott efter återhämtning, bör djuret avlivas. Annars euthanizemusen i en CO 2 kammare innan det tappas ur anestesi enligt IACUC-godkänd dödshjälp protokoll.
- Analysera fluorescerande bilder med hjälp av bildanalys programvara genom att följa tillverkarens anvisningar.
Representative Results
Ett schematiskt diagram som visar den dorsala kolonnen krossa lesion visas i figur 1A. Efter lesionen, är djuret ställdes och stabiliserad för intravital mikroskopi med användning av spinal klämmor (Figur 1B). En bild tagen direkt efter ryggens kolumnen krosskada visar en klart synlig rektangulär lesion med pincett pinninsättningspunkter som är klart identifierbar. Axoner vid skada plats är avskurna över spännvidden av hela dorsala kolumnen (Figur 1C). Integriteten av blodkärl förblir intakt, och inga tecken på fartygets färgläckage detekterades genom fluorescens. För att utföra seriell avbildning av samma lesionen under veckor, kan musklerna och huden sutureras över laminektomi för efterföljande återexponering. Liknande lesion morfologi ses vid senare tidpunkter (fig 1D, E). 5 dagar efter skada, tången insättningsställen är fortfarande synliga men lesionen har börjat öka i storlek due sekundär skada orsakad av inflammation. De axoner vid den kaudala änden av lesionen har tillbakadragna från den ursprungliga platsen för skadan via en process som kallas "axonal dieback". De axoner vid rostralt slutet av lesionen uppvisade Wallerian liknande degeneration (Figur 1D, E). Mellan dagarna 5 och 22 efter skada, har storleken av lesionen stabiliserats. Samtidigt kan en stor tillströmning av CX3CR1 + celler ses infiltrera i och runt krossa lesion under dessa tidpunkter, även om identiteten av dessa celler (mikroglia kontra makrofager) inte kan urskiljas i beredningen som visas i figur 1.
För att särskilja beteende mikroglia och makrofager inom krossa lesionen mikromiljö, har en strålnings chimär modell som används (skisserat i fig 2A). Först är de benmärgen progenitorceller i en CX3CR1 + / GFP mus ersätts med icke-fluorescerande donator cells, alltså bara GFP + CNS-bosatt mikroglia är synliga genom fluorescerande avbildning. Effektiviteten av märg rekonstituering kan bekräftas genom flödescytometri undersökning av det perifera blodet 8 veckor efter benmärgstransplantation (Figur 2B, C). I figur 2B, F4 / 80 och GFP positiva makrofager, markeras i blått, upptäcks i en CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 chimär mus, där vissa GFP negativa men F4 / 80 positiva monocyter är också närvarande. I figur 2C, ingen dubbel positiva F4 / 80 och GFP positiva celler kvar efter byte av CX3CR1 + / GFP mottagarens benmärg med vildtyp benmärg. Innan skadan, är mikroglia jämnt i ryggmärgen, visar en vila, förgrenad morfologi (Figur 2D). 8 dagar efter skada, kan endast ett fåtal mikroglia detekteras i och runt lesionen. Dessa mikroglia visar en amoeboid morfologi (Figur 2E). För det andra, benmärgstamfaderceller i en icke-fluorescerande mus ersätts av märgceller från en CX3CR1 + / GFP mus, därför rendering benmärg härledd CX3CR1 + monocyter / makrofager synliga genom GFP-fluorescens (figur 2A). Före skadan, det enda GFP + celler upptäcks är i stort sett perivaskulärt, som har rapporterats vara benmärg härledda och ständigt vända regelbundet 28 (Figur 2F). Efter en krosskada, kan CX3CR1 + / GFP-celler ses längs insidan av blodkärlen som omger lesionen (Figur 2H-J), och lesionen centrum är fylld med infiltrerande CX3CR1 + / GFP makrofager (fig 2G).
Tids lapse avbildning av dorsala kolonnerna kan utföras i upp till 6 timmar. I figur 3 visar vi en icke-chimär CX3CR1 + / GFP musen direkt efter skada i vilka celler från cirkulationen kan sen flyttar ut från blodkärlet mot lesionen kärna och flyttar inom skadestället (Figur 3A, B, Supple Movie 1). Bildanalys utnyttjar fluorescensintensiteten för att identifiera celler kan spåra de vägar som tagits av makrofager (Figur 3A, B, Supple Movie 1). Statistiken från bildanalys visar den genomsnittliga motilitet av makrofager i lesionen är 3,6 nm / min (Figur 3D). Slutligen är stabil under långa tidsperioder (Kompletterande Movie 2) på 22 dagar efter skada, axoner, mikroglia och makrofager kan fortfarande detekteras inom lesionen visar området bildbehandling.
Figur 1: Skapa och sekventiell avbildning av dorsala kolumnen krosskada. (A) Den dorsalakolumn krosskada utförs genom att ta bort ryggprocess kotan på nivån. Tång är införda i den dorsala kolonnen av ryggmärgen 1 mm från varandra och stängs sedan tre gånger för att producera den lesion som visas i purpur. (B) Djuret placeras sedan med ryggmärgen klämmor för att erhålla stabilitet för intravital avbildning. (C) Omedelbart efter skada, kan tången insättningsställen (röd oval) och den rektangulära krosskada volym (grå ruta) tydligt anges. Axoner i de dorsala rötter kan ses (vita pilar), såväl som de skadade ändarna av axoner på kaudala sidan av lesionen (fyllda pilhuvuden). (D) 5 dagar efter skada, tången insättningsställen (röd oval ), och omfattningen av lesionen (grå ruta) kan fortfarande enkelt visualiseras. Lesionen har ökat i storlek sedan den första förolämpning. Axoner genomgår Wallerian liknande degenerering kan ses rostralt lesionen (öppen pilspetsar) i additividare till axoner i de dorsala rötter (vita pilar) och ändarna av skadade axoner (vita pilspetsar). (E) 22 dagar efter skadan, är lesionsstället fortfarande identifierbar med liknande dimensioner till skadan efter 5 dagar. Notera det stora antalet CX3CR1 + celler i och runt det skadade stället. Funktioner märkta är samma som i (D). Alla skal barer = 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Konstruktion av chimära möss för att spåra CX3CR1 + / GFP uttrycker CNS-bosatta mikroglia eller benmärgsmakrofager i rygg kolumnen krossa lesion. (A) En schematisk bild av chimär möss generation med antingen CX3CR1 + / GFP uttrycka microglia eller makrofager. Först är Thy-1 YFP H möss bestrålas och benmärgen rekonstitueras med benmärgsceller som isolerats från en CX3CR1 + / GFP mus, vilket resulterar i en chimär mus vars makrofager är GFP +. För det andra, är Thy-1-YFP H / CX3CR1 + / GFP möss bestrålas och benmärgen rekonstitueras med benmärgsceller som isolerats från en icke-fluorescerande mus, som producerar en chimär mus vars mikroglia är GFP +. (B) Exempel på flödescytometri uppgifter med F4 / 80 + och CX3CR1 GFP + celler i blodet från en chimär djur med en CX3CR1 + / GFP märg donator transplanteras in i en bestrålad C57BL / 6 mottagare. Celler härledda från CX3CR1 positiva donatorer som är positiva för både GFP och F4 / 80 visas i det blå markerade området. (C) Exempel på flödescytometri data med F4 / 80 + och CX3CR1 GFP + celler i en chimär djur med en C57BL6 donatormärg transplanteras in i en IRStrålningen CX3CR1 + / GFP mottagare. Notera avsaknaden av dubbla positiva CX3CR1 + / GFP och F4 / 80 celler i det blå markerade området. (D) En intravital två-foton mikroskopisk bild av en mus från första chimär systemet, visar GFP + mikroglia med förgrenad morfologi inom rygg kolumn (pilspets). Dessa celler varvas bland axoner (gul) i dorsala och rygg kolumnen. Skalstreck = 100 | im. (E) Intravital avbildning av samma mus i (B) 8 dagar efter dorsala kolonnen skada avslöjar några CX3CR1 + mikroglia med stora och amoeboid formade cellkroppar som saknas processer (pilspets). Skala bar = 100 nm. (F) Ögonblicksbild av en mus från andra chimär systemet (A), som visar knappa GFP + makrofager, i CNS parenkymet. Skalstreck = 100 | im. (G) Intravital avbildning av samma mus i (F) 8 dagar efter dorsala kolonnen skada avslöjar alarge tillströmning av makrofager i och runt lesionen. Skala bar = 100 nm. (H) En högre förstoring bild av CX3CR1 + blod härledda celler i kontakt med fartygen i den oskadade djur. Skalstreck = 30 | im. (I) En rekonstruktion av CX3CR1 celler i kontakt med kärlet, sett från insidan av kärlet. Skalstreck = 30 | im. (J) En rekonstruktion av CX3CR1 celler i kontakt med kärlet, sett från utsidan av kärlet. Skala bar = 20 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 :. Representativa spårning cell data i en icke-chimär CX3CR1 + / GFP musen direkt efter ryggkolonn krossaskada. (A) En ögonblicksbild av CX3CR1 + mikroglia och makrofager runt skadade axoner (gul) från Kompletterande Movie 1 omedelbart efter en dorsal kolonn krosskada. (B) De banor (grå) fattas av CX3CR1 + celler i (A) under en 110 min intravital avbildning session. (C) En tidskodade representationen av spåren i (B). Spår är färgade baserat på deras tid inom hela 110 minuters film, som visas i tidsfältet. (D) Histogram av övergripande motilitet av CX3CR1 + celler. Alla skal barer är 30 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Film 1: Representant intravital filmen omedelbart efter dorsal kolonn krosskada i dubbel heterozygot Thy-1 YFP / +
Kompletterande Movie 2:. Representant intravital film på 22 dagar efter ryggkolumn krossa skada i dubbel heterozygot Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + mus Visas här är en representativ film tagen i en mus 22 dagar efter den första dorsala kolumnen krossa skada på spinal nivå T11. Den injury ligger i det övre högra hörnet på ramen. Axoner (gul) stigande rostrally visas längst ner till höger. De dorsala ven och blodkärl är märkta med TRITC-dextran (röd). CX3CR1 + celler inom lesionen flytten med en lägre hastighet jämfört med dem omedelbart efter skadan. Skalstreck = 50 | im. Total tid: 90 min. Uppspelningshastighet: 600x.
Discussion
Imaging interaktioner av olika celltyper i sitt eget teoretiska vävnader under efterföljande patologi i realtid har genererat stort intresse. Inom tätt nätverk av CNS, kontakt cell-cell och signalering med angränsande celler är viktiga för normal funktion och för att förstå CNS patologi. Här beskrev vi användning av 2-foton laser scanning mikroskopi för observation av cellulära rörelse inom en mekanisk skada i ryggmärgen. Förutom kvaliteten på kirurgi och vävnadspreparat, är mekanisk stabilitet av vävnaden av största vikt för framgångsrik tidsförlopp mikroskopi, särskilt isoleringen av ryggmärgen från att andas rörelseartefakt. Stabilitet kan bedömas genom att leta efter förflyttning av ryggmärgen under ett dissektionsmikroskop som motsvarar hjärtfrekvensen eller andning hos djuret. Stabilitet bör bedömas både under utförandet av operationen och även omedelbart innan avbildning. Om animal är inte stabil, justeringar bör göras för att placeringen och täthet av ryggmärgen klämmor. Celltypsspecifik fluorescerande reporter musmodeller kombination med benmärgs chimera tillvägagångssätt har tillåtit identifiering av monocytiska celler kontra mikroglia och axoner. Tidigare studier har visat att blod härrör monocyter och inte mikroglia är ansvariga för sekundär axonal skada efter trauma med hjälp av den metod som beskrivs här 43. Dextran konjugerade kärl färgämne möjliggör kärlidentifiering både att ge landmärken och att brott i kärlintegritet. Valet av den lämpliga fluorescerande reporter musmodell är kritisk för att möjliggöra en korrekt identifiering av de önskade celltyper, som skall avbildas.
Utveckling av modeller fluorescerande mus som är lämpliga för de studier som utförs är också kritisk till framgång för experiment. Skilja mellan de två fagocytiska populationer av CX3CR1 + / GFP 52. Här har vi observerat att antalet celler som infiltrerar in i CNS vid steady state på grund av chimär generation är obetydlig i motsats till number av celler in lesionen. Andra alternativa modeller att överväga inkluderar läkemedelsinducerade chimärer 52 eller parabiotic musmodeller 53.
Här har vi lagt fram en specifik, enkel och reproducerbar liten skada modell som resulterar i en skada på ryggens vita substansen i ryggmärgen som är lätt att bilden med 2-foton mikroskopi. Denna metod ger också en kvantifierbar skada att analysera graden av axonal skogsskador i rygg kolumner som i litteraturen har tillsammans med kompletterande fast vävnadsanalys 16,18,43,48,54. I denna modell djur visar endast minimala underskott och kräver ingen särskild vård efter skada. Framtida studier där man använt de dorsala kolumnen krosskada och avbildningstekniker som beskrivs här kan vara kraftfulla screening verktyg för att bedöma effekten av behandling för ryggmärgsskada. Dessa behandlingar kan innefatta småmolekylinhibitorer, droger, cellprodukter, vävnadstransplantat och kombinato behandlings. Samspelet mellan makrofager, mikroglia och nervceller är också sannolikt att spela en roll i andra sjukdomsmodeller i ryggmärgen, inklusive multipel skleros, tumörer, meningit och amyotrofisk lateral skleros, och denna teknik kan vara användbar i studiet av dessa sjukdomar samt .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CX3CR1 GFP mice | Jackson laboratories | 5582 | |
| Thy-1 YFP H mice | Jackson laboratories | 3782 | |
| Mouse pie cage | Braintree Scientific | MPC 2 set | |
| 60 mm2 Petri dish | Corning | 430166 | For bone marrow isolation |
| Falcon 40 μm cell filter | Fisher Scientific | 08-771-1 | For bone marrow isolation |
| 1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube | Fisher Scientific | For bone marrow isolation | |
| 21 gauge needle | BD | 305177 | For bone marrow isolation |
| 1 ml syringe | BD | 309628 | For bone marrow isolation |
| ACK lysis buffer | Gibco | A10492-01 | For bone marrow isolation |
| HBSS | Corning Cellgro | 21-022-CV | For bone marrow isolation |
| RPMI media | Sigma | R8758 | For bone marrow isolation |
| F4/80 antibody | Ebioscience | 12-4801 PE | For FACS verification of chimeras |
| 30 gauge insulin syringe | BD | 328280 | For tail vein injection |
| Spinal Cord Clamps | Narshinge | STS-A | For imaging |
| Ortho-Jet Dental Acrylic powder | Lang Dental | REF1320 | For imaging |
| Ortho-Jet Dental Acrylic liquid | Lang Dental | REF1404 | For imaging |
| Gelfoam gelatin sponges | Pfizer | 9034201 | For imaging |
| 4-0 Ethilon sutures | Ethilon | 1667G | For surgery |
| Reflex Clips, 7 mm | Kent Scientific | INS750344 | For surgery. Sterilize before use |
| Iris Scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | For surgery |
| 45/5 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-35 | For surgery |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | For surgery |
| 30 gauge needle | BD | 305106 | For making access holes in dura |
| Forceps Dumont #4 Biology tips | Dumont | 11242-40 | For surgery |
| Needle Drivers | Fine Science Tools | 12002-12 | For surgery |
| Michel Wound Clip Forceps | Kent Scientific | INS700753 | For surgery |
| Wound clip remover | Fine Science Tools | 12033-00 | For surgery |
| O-rings for Forceps | Fine Science Tools | 11200-00 | For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately |
| Cordless Rechargable Animal trimmer | Wahl | Series 8900 | for surgery |
| Vetbond | 3M | 1469SB | For surgery |
| Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 | For surgery |
| Nair Hair remover lotion | Church & Dwight Co., Inc. | NRSL-22329-05 | For surgery |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | Drugs – for surgery |
| Marcaine | Henry Schein | NDC 0409-1587-50 | Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously |
| Bupernex | Henry Schein | 121-7793 | Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg |
| aCSF | Chemicals from Sigma | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
For surgery From Cold Spring Harbor Protocols |
| TRITC-dextran 150,000 MW | Sigma | T1287 | For intravenous administration to label vasculature |
References
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11 (5), 572-577 (2005).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8 (3), 58081 (2013).
- Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (12), (2012).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18 (1), 166-171 (2012).
- Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591 (19), 4895-4902 (2013).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590 (16), 3665-3675 (2012).
- Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9459-9464 (2009).
- Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24 (1), 13-17 (2003).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28 (38), 9330-9341 (2008).
- Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
- Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29 (2), 9967-9976 (2009).
- Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182 (2), 275-287 (2003).
- Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158 (2), 351-365 (1999).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29 (43), 13435-13444 (2009).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
- Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6 (7), 1000113 (2009).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (7), 676-685 (2001).
- Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14 (9), 1098-1100 (2011).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (1152).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53 (4), 382-391 (2006).
- Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5 (10), 13693 (2010).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
- Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4 (4.6), (2008).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 11-22 (2009).
- Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. , 4208 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
- Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89 (2012).
- Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
- Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
- Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030 (2013).
- Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326 (5952), 592-596 (1126).
- Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5 (8), e12021 (2010).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8 (3), e58544 (2013).
- Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. , Abstracts. San Diego. (2013).
