Summary
在这里，我们提出了一个协议分析RNA /蛋白质相互作用。电泳迁移实验（EMSA）是基于RNA的/蛋白复合物和游离RNA在天然凝胶电泳迁移差异上。通过使用放射性标记的RNA探针，RNA /蛋白质复合物可以通过放射自显影进行显现。
Abstract
RNA /蛋白质相互作用是转录后调控途径的关键。间的最佳表征的胞质RNA结合蛋白是铁调节蛋白 ，IRP1和IRP2。它们结合到铁几个靶mRNA的非翻译区（UTR）内响应元件（IRES），从而控制的mRNA翻译或稳定性。 IRE / IRP的相互作用已被广泛研究了EMSA。在这里，我们描述了EMSA协议用于分析IRP1和IRP2的IRE结合活性，这可以推广到其他评估RNA结合蛋白的活性。含有一种RNA结合蛋白，或纯化此蛋白质的制备的粗蛋白裂解物，孵育用过量的32 P标记的RNA探针，从而允许形成复合物。肝素加入到排除非特异性蛋白探查结合。随后，将混合物通过在聚丙烯酰胺凝胶非变性电泳分析。免费探头迁移速度快，而所述RNA /蛋白质复合物表现出延迟的流动性;因此，该过程也被称为“凝胶阻滞”或“条带迁移”测定法。电泳结束后，将凝胶干燥和RNA /蛋白质复合物，以及游离的探针，通过放射自显影检测。该协议的总体目标是检测和量化的IRE / IRP和其它RNA /蛋白质相互作用。此外，EMSA也可用于确定特异性所研究的RNA /蛋白质相互作用，结合亲和力和化学计量。
Introduction
在EMSA最初被开发，研究DNA结合蛋白与靶DNA序列1,2的关联。其原理是类似的RNA /蛋白质相互作用3，这是本文的重点。简言之，RNA被带负电荷并朝向阳极期间非变性电泳聚丙烯酰胺（或琼脂糖）凝胶将迁移。凝胶内的迁移取决于核糖核酸，其正比于它的电荷的大小。相比于自由RNA特异性的蛋白质的RNA的结合改变其流动性，且复杂的迁移变慢。这主要是由于增加的分子量，而且要在电荷和可能的构象的改变。利用RNA标记为探针，可以方便地监控了“凝胶阻滞”或“条带迁移”的。的32 P标记的RNA探针的使用是很常见的，并提供高灵敏度。被检测的RNA /蛋白质复合物和游离RNA的迁移通过放射自显影。缺点是：32 P（14.29天），探针的质量由于辐逐渐恶化的半衰期短，一个放射性许可证和基础设施为放射性工作，以及潜在的生物安全的担忧的要求。因此，已经开发了替代非同位素方法用于标记的RNA探针，例如用荧光团或生物素，其能够检测由荧光或化学发光成像4,5。这些方法的局限性是成本较高并且经常敏感性降低相比同位素标记和非同位素标记物的潜在干扰的RNA /蛋白质相互作用。非变性聚丙烯酰胺凝胶适用于大多数应用EMSA和常用。有时，琼脂糖凝胶可能造成的大型复合物的分析，另一种选择。
EMSA的主要优点在于，它结合了简单，灵敏度和鲁棒性4 </ SUP>。该测定可以在几个小时内完成，并且不需要复杂的仪器。 RNA /蛋白质相互作用可通过EMSA在浓度低至0.1纳米或更小进行检测，并广泛的结合条件内（pH为4.0 - 9.5，单价盐浓度1 - 300毫米，而温度0 - 60℃）。
RNA /蛋白质复合物的形成，也可以由滤波器结合测定研究。这是基于对RNA /蛋白质复合物中的硝化纤维过滤器中的保留一个简单，快速，和便宜的程序，而自由RNA探针穿过6。相比EMSA，它的情况下将RNA探针含有多个结合位点，或粗提取物包含一个以上的RNA结合蛋白结合的探针在同一地点的限制。而多的RNA /蛋白质相互作用会逃过检测由滤波器结合测定中，它们可以容易地通过EMSA观察。在某些情况下，可视化前夕n个可能时两个RNA /蛋白质复合物共迁移（例如，人类IRP1 / IRE和IRP2 / IRE复合物）中，加入的抗体对RNA结合蛋白的EMSA反应之一，在凝胶上产生进一步的延迟（ “超迁移”）7。
在EMSA已广泛用于研究IRP1和IRP2，这是铁代谢8-10转录后调节器。它们的工作由几个11的mRNA的非编码区中结合IRES，系统发育保守的发夹结构。 IRE有时首先在编码铁蛋白12和转铁蛋白受体1（TFR1）13，铁贮存和吸收，分别为蛋白质的mRNA的发现。稍后，IRE有时被发现在红细胞特异性氨基乙酰丙酸合成酶 （ALAS2）14，线粒体乌头15，铁转运蛋白16， 二价金属转运蛋白1（DMT1）17，缺氧诱导因子2
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Protocol
小鼠实验程序批准了麦吉尔大学（协议4966）的动物护理委员会。
1.准备从培养细胞蛋白提取物
- 用10毫升冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗两次培养的细胞。
- 刮贴壁细胞与任一橡皮或塑料细胞刮棒在1ml冰冷的PBS，转印悬浮到1.5ml微量离心管中。
- 旋在微量离心5分钟，于700×g离心，于4℃。吸PBS。
- 加入100微升冰冷的细胞质裂解缓冲液（ 见表1）每10 7个细胞，并吸取向上和向下。
- 在冰上孵育20分钟。
- 旋，在4℃下以全速10分钟在微量。
- 丢弃沉淀。上清转移到新的1.5 ml离心管，并保持在冰上。
- DET使用Bradford法23 - （10微克/微升通常1）貂皮蛋白浓度。
- 等分试样并储存细胞提取物在-80℃下直到使用。
2.准备从小鼠肝脏和脾脏蛋白提取物
- 安乐死鼠标使用CO 2吸入。
- 奠定安乐死的动物在一块干净的纱布在解剖板。打开用剪刀腹部。
- 解剖肝脏和脾脏用剪刀和镊子，并冲洗在大约50毫升的冰冷的PBS各组织。
- 立即切割组织切成小块，用手术刀（例如：约1 - 2 立方毫米）。
- 无延迟，放在新鲜冻存管组织的片，然后捕捉冻结他们在液氮。商店管理单元冷冻组织等分在-80℃下直到使用。
- 在0.25 - （2 mm 3的大约1） - 0.5毫升匀化一片冷冻组织的冰冷细胞质裂解缓冲液（ 见表1）用组织匀浆10秒。
- 转移匀浆至1.5 ml离心管，并冰浴20分钟。
- 旋，在4℃下以全速10分钟在微量。
- 放弃颗粒和转移上清到新的1.5 ml离心管。保持在冰上。
- 测定蛋白浓度-使用Bradford测定法23（通常为1 10微克/微升）。
- 等分试样并储存细胞提取物在-80℃下直到使用。
3.准备放射性标记IRE-探头
- 通过在37℃下用限制性核酸内切酶XbaⅠ位（每质粒微克1 U）的IRE序列的下游其裂解温育1小时进行线性化的含有质粒IRE I-12.CAT 22。将线性化质粒将被用作模板的体外转录。
- 设置一个中的 n 体外在20微升的总体积的转录反应。使用表2中所示的储液，并添加1微升线性质粒模板，4微升的转录缓冲液1微升混合物中ATP / CTP / GTP混合，加入10μl[α-32 p] -UTP，2微升二硫苏糖醇，1微升RNA酶抑制剂和1μlT7 RNA聚合酶。通过上下吹打混匀。
- 孵育在40℃下1小时24。
4.净化放射性标记IRE-探头
- 加入1微升的0.5M EDTA，pH为8混音通过上下抽吸终止的体外转录反应。
- 添加10微升10毫克/毫升的tRNA，作为载体更好沉淀。通过上下吹打混匀。
- 添加82.5微升的3M乙酸铵。涡旋混合。
- 添加273微升乙醇。涡旋混合。
- 静置在室温5分钟。
- 在微型在RT旋转10分钟以全速。弃去上清液。
- 洗涤沉淀用100μl的70％乙醇。
- 在微型在RT旋转10分钟以全速。弃去上清液。
- 空气干燥沉淀10分钟。
- 在100μl双蒸重悬沉淀，预先高压灭菌的 H 2 O.
- 量化放射性用液体闪烁计数器，等分试样的放射性标记的探针的IRE并储存在-80℃直到使用。冷冻等分试样可用于长达3周。
5.准备EMSA原生聚丙烯酰胺凝胶
- 通过使用1.5毫米垫片和梳组装凝胶（16×16厘米）。
- 以制备6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，使用表3中所示的储备溶液混合7.5毫升40％的丙烯酰胺：双丙烯酰胺，加入5ml 5×TBE和37.5毫升双蒸H 2 O.
- 加入0.5毫升10％的新制备的过硫酸铵（APS）和25微升四甲基乙二胺（TEMED）。
- 立即倒入丙烯酰胺溶液的凝胶，并让它聚合。等待大约30分钟。
- 与凝胶组装电泳装置中，填充罐用0.5X TBE并连接电源。
6.凝胶电泳迁移分析
- 在10微升的总体积稀释25微克从细胞或组织与细胞质裂解缓冲液（ 表1）的蛋白提取物（低蛋白质浓度也可以使用）。保持在冰上。如果需要的话，加入1微升1：4稀释的2-巯基乙醇（2-ME），以激活休眠IRP1（终浓度：2％）25。
- 稀释放射性IRE探头双蒸H 2 O来200000 CPM /μL，热在95℃变性℃1分钟，并冷却在RT至少5分钟。
- 成立EMSA反应通过加入1微升放射性IRE探针与蛋白质提取物。
- 孵育20分钟，在RT。
- 加入1微升50毫克/毫升肝素的反应（以抑制非特异性蛋白相互作用与探针9），并继续孵育另外10分钟。分装肝素在-80℃下储备溶液（50毫克/毫升），并存储。
- 当使用放射性标记的长探针（> 60个核苷酸），加入1微升RNA酶T1（1U /微升），孵育10分钟，在室温，以减少非特异性蛋白结合到探针，并允许更好地分离的RNA /蛋白质的电泳过程中的复杂。
- 加入3微升加样缓冲液（80％甘油+溴酚蓝），混合和负载上的6％非变性聚丙烯酰胺凝胶。
- 运行凝胶在130 V（5伏/厘米）60分钟。
- 牛逼转输的凝胶到大滤纸和干燥。
- 暴露于膜和开发放射自显影。暴露时间的范围可以从1小时（或更少）至O / N。
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Representative Results
放射标记的IRE探针制备，如在第3和第4的协议的说明。所述探针的序列为5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGÇUUCAAÇAGUGC UUGGA CGGAUCCU-3';粗体的核苷酸代表一个未配对的C残基和环，这是至关重要的IRE特征。探针的比放射性为4.5×10 9的cpm / RNA微克。
评估铁扰动对IRE结合活性的影响，鼠的RAW264.7巨噬细胞不进行治疗，或者与血红素（铁源）或去铁胺（铁螯合剂）处理。制备和EMSA与IRE探头（8000 CPM /微克蛋白）分析裂解液。代表性数据显示于图1，用放射自显影对左右面板较短和较长的曝光，分别。鼠IRE / IRP1和IRE / IRP2复合物表现出不同的流动性和两个不同频段在泳道1可见，相应于未经处理的细胞。铁螯合深刻诱导既IRP1和IRP2（泳道2）的IRE-结合活性，而补铁减少他们（泳道3）。预处理用2％2-ME的完全激活IRP1（底部面板），即使是在铁处理的细胞的提取物。这表明，铁扰动不要IRP1的稳定性撞击并且还用作上样对照。相比之下，2-ME的预处理抑制IRP2的IRE结合活性。快速迁移的非特异性条带不受铁。
接下来，我们分析了在野生型的肝脏IRE结合活性，IRP1 - / -和IRP2 - / -小鼠，先前一周馈送具有标准或铁富集的饮食（ 图2）。该IRP1 - / - 和IRP2 - / - 小鼠好心兆瓦Hentze博士（EMBL，海德堡）提供。在野生型肝提取物，IRP1占IRE结合活性和IRE / IRP2复合物的主要部分是很难可见（泳道1,2），在协议与以前的观察结果26。 IRP2展出IRP1的肝脏中提取有效的IRE结合活性 - / - 小鼠（泳道3,4）。在这些条件下，没有IRE / IRP1络合物进行观察。同样，任何IRE / IRP2复合物形成在IRP2的肝脏提取物 - / - 小鼠（泳道5,6）。喂养的小鼠用高铁饮食降低两者IRP1和IRP2肝IRE-结合活性;这种影响是在IRP2（泳道7-12）更具戏剧性。需要注意的是处理的野生型或IRP2的后 - / - 肝脏提取物用2-ME，IRP1的IRE结合活性增强，以一个点，它移几乎所有的IRE探针（这是在放射自显影的较短曝光中清楚地观察到左侧面板上）。
最后，我们评估了在肝脏和野生型和HJV的脾脏的IRE结合活性- / -小鼠（ 图3）。该HJV - / - 小鼠好心NC安德鲁斯博士（杜克大学，NC）提供。这些动物代表了一个模型遗传性血色病27，对全身性铁超负荷，其中过量的铁蓄积在实质细胞，而网状内皮巨噬细胞保持铁的疾病缺陷型28。正如所料，HJV肝脏 - / - 小鼠表现出（与铁加载肝细胞）降低IRE结合活性相比野生型（泳道1-4）。相反地，IRE结合活性高于在HJV的脾脏 - / - 小鼠（含铁缺陷巨噬细胞;泳道5-8）。在这里再次，在2-ME处理促进肝提取物（见放射自显影的左侧面板上的短曝光）的IRE探头几乎完全转变。
表1.细胞质裂解液。
| 1％的Triton X100 |
| 25毫米的Tris-HCl，pH值7.4 |
| 40毫米氯化钾 |
- 该解决方案应该进行高压灭菌，并储存在室温。
- 蛋白酶抑制剂，例如10微克/ ml亮肽素和0.1mM苯甲磺酰氟（PMSF）可在使用前加入。
- 添加新鲜的1毫dithiotheritol被recomended检测IRP2活性。
用于体外转录反应表2储备溶液。
| 1微克/微升线性质粒模板 |
| 5X转录缓冲液（用T7 RNA聚合酶提供） |
| 的ATP，CTP和GTP 20mM的混合 |
| 3000次/毫摩尔〔α-32P] -UTP |
| 100毫米二硫苏糖醇 |
| 10 U /μl的核糖核酸酶抑制剂 |
| 20 U /μl的T7 RNA聚合酶 |
<对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳强>表3储备溶液。
| 40％的丙烯酰胺：双丙烯酰胺（37.5：1） |
| 5倍TBE（的Tris /硼酸盐/ EDTA） |
制备1升5×TBE的，使用54克Tris碱的27.5克硼酸，和20ml 0.5M EDTA（pH8.0）中。
图1.铁依赖性的巨噬细胞IRE结合活动的监管。10 7细胞要么不及时治疗或治疗的O / N与100μM血红素或去铁胺。制备细胞质溶解产物并分析由EMSA用32 P-标记的探针IRE在2％2-ME（底部不存在（上图）或存在）。 IRE / IRP1和IRE / IRP2络合物和游离IRE探针的位置用箭头表示。星形表示非特异性条带。放射自显影较短和较长的曝光显示在左侧和右侧面板，分别请点击此处查看该图的放大版本。
图2的分析在野生型（wt）的肝脏IRE结合活性，IRP1 - / -和IRP2 - / - 。小鼠 5周老小鼠（n = 2对于每个基因型），所有在C57BL / 6背景29被放置在一个标准的或高铁饮食（含有2％羰基铁）。一周后，将动物安乐死。制备肝蛋白提取物和分析通过EMSA用32 P标记的探针IRE在2％2-ME（底部）的情况下（顶部）或存在下进行。 IRE / IRP1和IRE / IRP2络合物和游离IRE探针的位置用箭头表示。星形表示非特异性条带。放射自显影较短和较长的曝光显示在左侧和右侧面板，分别请点击此处查看该图的放大版本。
/ - -的IRE结合在肝脏的活动和野生型（wt）和HJV的脾脏图3.分析小鼠 10周老小鼠（n = 2对于每个基因型），所有在C57BL / 6背景30，实施安乐死。肝和脾的蛋白提取物的制备和分析通过EMSA用32 P-标记的探针IRE在不存在（上图）或存在2％2-ME的（底部）。 IRE / IRP1和IRE / IRP2络合物和游离IRE探针的位置用箭头表示。星形表示非特异性条带。放射自显影较短和较长的曝光显示在左侧和右侧面板，分别请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在此，我们描述了已开发研究IRP1和IRP2的IRE结合活动的协议，并且我们显示代表性数据。通过使用不同的探针，该协议也可以被用于其它RNA结合蛋白的研究调整。一个关键步骤是探针的大小。用法长探针，这是共同的时，确切的结合位点是未知的，可能会导致的RNA /蛋白质复合物不不同迁移比游离的RNA。在这种情况下，最好是通过用RNA酶T1（ 步骤6.6）处理以去除未结合的RNA。探针的质量也很重要。最好的结果是用新鲜配制放射性标记的RNA获得。凝胶纯化10不是必要的，但可以提高EMSA的外观，如果用于探针制备在体外转录反应产生过早终止的产品（如果没有RNA酶T1消化步骤是包括在内）。运行天然凝胶电泳太快米AY导致过热，这可能导致的RNA /蛋白质复合物解离，从而导致模糊的频带。
定量的结果可以通过分析滞后条带磷光的强度而获得。量化值是唯一有效的，当RNA探针过量存在，并且不限制为RNA结合。将RNA /蛋白质相互作用的亲和力，通过链接到自由能ΔGÒ的解离常数K D时 ，可在平衡条件下滴定的RNA结合活性，降低放射性探针3的量进行评估。在IRE / IRP1的互动已经广泛表征物理化学把9.31。滴定EMSA实验用不同量的RNA结合蛋白的可被执行以计算化学计量3。特异性的结合，可以很容易地通过验证实验的竞争与过剩未标记的“冷”补偿etitor的RNA 3。只有特定的竞争对手应该减少智障放射性带的强度。特异性还可以通过包括对在EMSA反应的RNA结合蛋白的抗体，这将产生一个“超迁移”7监视。这也可以利用来确定该RNA结合蛋白的身份。没有“超迁移”应与非特异性抗体或免疫前血清中观察到。
总之，EMSA是一个功能强大的方法的RNA /蛋白质相互作用的分析。这是比较容易进行，并且需要最小的基础设施。它不是简单的过滤器结合试验，但会产生更多的信息，准确的数据，当多个RNA结合蛋白相互作用特异性地与探针（如IRP1和IRP2）。应该指出，不同于鼠，人类IRE / IRP1和IRE / IRP2络合物共迁移EMSA。然而，它们可以通过“supershifts̶分离1;用特异性抗体7。所述EMSA是不是为RNA /蛋白质相互作用的详细的映射有价值;其它技术，如RNA酶保护测定法，toeprinting或交联32顷更合适。尽管如此，EMSA是用于发现新的RNA /蛋白质相互作用的最佳选择，因为一直用的IRP 8的情况下，也为确证与计算或高通量的实验方法获得的数据。此外，EMSA优于用于分析的RNA /蛋白质相互作用的特异性和物理化学性质。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| leupeptin | SIGMA | L2884 | |
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 RNA polymerase | Thermoscientific | EPO111 | |
| RNase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 | |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | NEG507H | |
| Scintillation liquid | Beckman Coulter | 141349 | |
| heparin | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| Name of the Equipment | |||
| Tissue Ruptor | Qiagen | 9001271 | |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 | |
| 20 wells combs | BIORAD | 165-1868 | 1.5 mm thick |
| 1.5 mm spacers | BIORAD | 165-1849 | |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
References
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