Introduction
온 콜리 틱 바이러스 (OV)는 선택적으로 정상 및 종양 세포 생화학 1,2- 간의 차이를 이용함으로써 종양 세포에서 복제. 자연적으로 발생하는 야생형 바이러스 지칭 선택적 oncolysis을 달성하기 돌연변이를 요구하지 않는 것들, 및 선택적 oncolysis을 달성하도록 설계되어야하는 것들 : OVS 두 가지 유형이있다. 특정 종양 유형 내 돌연변이의 수집은 OV이 정상 세포 위에 선택 성장의 이점의 특성을 결정한다. 사용 OVS의 안전성과 효과 임상 시험 3-7에서 증명되었다. 온 콜리 틱 바이러스 치료법의 분야에서의 진보에도 불구하고 더 나은 모델 OVS의 항 종양 효능을 평가하는 데 필요하다는 것을 시사 전임상 및 임상 결과 사이의 갭이 존재한다.
소 헤르페스 바이러스 타입 1 (BHV-1) 헤르페스 가족의 구성원, 그리고 Alphaherpesviridae 아과이다. BHV-1 initi오버라이드가 심한 감기 증상 -8,9- 닮은 다양한 낸, 소 호흡기 질환 착체를 소. BHV-1은 헤파 란 황산 nectin-1 10 HSV-1에 의해 사용되는 첨부 파일 및 항목 수용체를 결합한다. 그러나 nectin-2 (10)의 위치에 결합 CD155. BHV-1은 효과적으로 선택하고 정상 세포와 형질 전환 생쥐에서 3,4,10 복제를 개시 할 수없는되도록 매우 좁은 숙주 범위를 갖는다. 이것은 종래의 뮤린 모델의 사용이 문제가 만든다. BHV-1의 종양 살상 능력은 시험 관내 (11, 12)에서 입증되었다. BHV-1은 유방암 세포 및 유방암 세포 (11, 12)를 포함하여 개시 학적 기원의 다양한 인간 종양 세포에서 복제를 개시하고 죽이는 것으로 밝혀졌다. 그러나, BHV-1의 용량은 항 종양 면역 적격 숙주의 컨텍스트 내에서 생체 내에서 평가되어야한다.
인간의 아데노 바이러스 (AD)하는 용식별 된 혈청 (57)은 가장 일반적으로 인간의 호흡기 질환을 유발있다. 콜리 틱 광고 벡터는 여러 임상 시험 13-15 진출 자신의 항 종양 효과에 대해 평가되고있다. 유망한 전임상 데이터에도 불구하고, 임상 결과는 기대에 못 떨어졌다. 그들이 16,17 바이러스에 대한 면역 반응을 감쇠 나타나지만 인간 종양 이종 이식 모델은 통상적으로, 광고 벡터의 항 종양 효능을 연구하는 데 사용된다. 게다가, 동계 뮤린 모델은, 광고 감염 비 허용하는 경우에는 비현실적 17,18 이러한 모델을 사용하여 숙주 면역 반응을 평가.
숙주 면역계 OVS 종양 세포 사멸을 유도한다 (19)에 의해 가장 유력한 메커니즘으로 확인되었다. tolerized 비 tolerized 종양 - 관련 항원과 항 종양 반응 (TAA) 모델과 상당히 다를 OV 치료의 성공에 영향을 미칠 수있다. HSV-1 OV KM100 (ICP0 n21220) (20, 21)은 1814에서 VP16 뮤린 폴리오 중간 T 항원 유방암 모델 (22)에 담암 마우스의 80 %에서 종양의 퇴행을 유도. 그러나, HER-2 / neu의 모델에서, KM100의 항 종양 효능이 형질 전환에 동계 마우스 20 % 완료 회귀 종양 정체 사이에서 변화, 마우스를 HER2는-tolerized. 이들 데이터는 함께 완전히 가장 완전히 치료 성공을 결정하는 기능을 이해하는 인간 면역 프리 요점을 되풀이 동물 모델을 사용하여 평가를 OVS의 중요성을 강조.
(5 검토 등)는 북미 및 남미 지역에 토착면 쥐 (Sigmodon의 hispidus)는, 가장 일반적으로 호흡기 세포 융합 바이러스 감염의 모델로 사용됩니다. 그들은 6,23 복잡한 소 호흡기 질환과 관련된 병리학 요점을 되풀이으로면 쥐도 방지 BHV-1 백신 연구에 사용됩니다. 코튼 랫 또한, BHV-1 감염, 면역원 지속 점막 및 전신성 면역 반응을 유도 6,23-25. 셀 라인은 자연 섬유 육종 및 유선 (LCRT)과 뼈 (CCRT와 VCRT), 각각 26 골육종에서 유래되었다. 코튼 래트들은 광고 감염에 취약으로 콜리 틱 광고 벡터의 생체 내 효능을 평가하고 인간 27-29 유사한 병리 현상을 나타내도록 사용되었다. OVS의 전임상 평가 면역 모델의 사용뿐만 아니라, 치료에 대한 임상 적 반응을 덜 나타낸다 있지만 콜리 틱 바이러스 치료법 (30, 31)에서 고려 면역 시스템의 역할을하지 못한다. 따라서, 동계 및 유방 암과 골육종의 종양 tolerized면 쥐 모델은 기존의 생쥐 모델을 이용하여 연구 할 수없는 등 BHV-1과 OVS, 및 광고의 전임상 효능을 평가하기에 적절한 모델이다.
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Protocol
참고 : 사용되는 프로토콜은 동물 관리 지침에 캐나다 협의회에 따르면 맥 매스터 대학에서 우리의 기관 동물 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 실험은 맥 매스터 대학 중앙 동물 시설에서 수행 하였다.
1. 배양 LCRT 세포
- 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 배양 LCRT 세포는 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신이 보충. 37 ° C에서 T-150 조직 배양 플라스크에서 세포를 유지하고, 5 % CO 2. 패시지 세포들은 90 % 컨 플루 언트 단층 (2-3 일마다,도 1)을 형성 할 때.
- 사전 따뜻한 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS), 셀을 분할하기 전에 10 분 동안 37 ° C의 물 욕에서 1X 트립신 매체.
- 대기음 플라스크에서 중간 및 1X PBS의 5 ㎖로 세포를 씻어.
- 세척 후, PBS를 대기음 및 배양세포까지 1X 트립신 2 ㎖와 세포를 플라스크 (~ 2 분)에서 해리.
- 부드럽게 (10 ml의 세포 현탁액의 총) 8 ml의 배지에 재현 탁 세포는 세포의 덩어리를 깨고 아래로 피펫.
- 좌우로 부드럽게 측면에서 바위 플라스크 (T-150 당 25 ml의 총) 24 ml의 배지에 1 ml의 세포 현탁액을 파종하여 T-150 플라스크에 세포를 유지한다. 다음 분할 될 때까지 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 유지한다.
2. LCRT 세포에서 바이러스 복제 및 세포 독성 평가
- 바이러스 복제
참고 : 내인성 바이러스 프로모터의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형광 태그를 발현하는 바이러스의 구조는, 바이러스 감염의 시각화를 촉진하고 형광 플레이트 리더를 사용하여 확산.- 계수하는 웰을 떠나는 배양 플레이트에 시드 LCRT 세포. 종자 세포 등 그들이 언젠가 나중에 80~90% 합류 할 것이다. 10 5 CEL의 농도를 사용하여LS / ㎖ (웰 당 100 μL)를 96 웰 편평 바닥 플레이트에 하루 이상 포화 상태 소망 생성한다.
- 다음 날, 미리 따뜻한 1X PBS, 1X 트립신, 10 분 전에 실험을 시작하기 37 ° C의 물을 욕조에 완전하고 무 혈청 배지.
- 우물의 표면에 그것을 흔들어 1X PBS 5 ㎖와 잘 계산 린스 세포에서 대기음 매체.
- 세척 후, 세포까지 1X 트립신 2 ㎖와 대기음 PBS 및 배양 세포를 플라스크 (~ 2 분)에서 해리.
- 혈구를 사용하여 가산 범위 내에서 세포 밀도를 수득 완전 배지의 적당한 부피로 세포를 재현 탁. 정확한 세포 수를 확인하기 위해 철저하게 사전 피펫 팅 아래로하여 혈구 접종에 세포 현탁액을 섞는다.
- 감염의 원하는 다양성 (MOI)에서 감염에 필요한 바이러스 주식의 볼륨을 결정합니다.
단위를 형성하는 필수 페이크 (PFU) = 도금 세포의 수 * MOI(PFU / 셀)
바이러스 주식의 볼륨 = 필수 요구 PFU / 바이러스 재고 역가 (PFU / ㎖) - 튜브에서 무 혈청 배지에서 바이러스 접종을 준비합니다. 세포에 접종을 추가하기 전에 와동 또는 피펫 팅에 의해 철저하게 섞는다.
- 그 후 DMEM + 1 % FBS의 유지 오버레이를 적용한 37 ° C에서 1 시간 동안 세포를 감염.
- 스캔 판 하나, 둘, 일 포스트 감염 (PI)는 GFP의 형광을 시각화합니다.
- 바이러스의 세포 독성
참고 : 화합물이 감광성으로 낮은 조명 조건에서 레사 주린 세포 독성 분석을 수행합니다. 잘 함유 배지는 배경 형광을 보정하기 위해 포함되어야한다.- 1X PBS에 레사 주린의 5 % (v / v) 용액을 준비합니다. 피펫으로 솔루션을 섞는다.
- 세포에서 대기음 매체와는 5 % 레사 주린 솔루션을 적용 할 수 있습니다. 잘 들어있는 매체는 배경 형광을 보정하기 위해 포함됩니다.
- 37에서 30 분 동안 세포를 품어 ° C, 후이는 형광 플레이트 리더 (여기 530 nm의, 방출 595 nm의)를 사용하여 형광을 읽어보십시오.
- 배경 형광을 보정 감염되지 않은 컨트롤에 관련된 데이터를 분석 할 수 있습니다.
3. 주택 및 취급
- 주택과 다이어트
- 하우스면 쥐 개별적으로 설치류 침구 (1/8 "옥수수 속대 침구), 더 이상 농축 등 8인치 및 nestlets보다 PVC 튜브 (그림 2)의 일부를 포함하는 폴리 카보네이트 쥐 케이지에서의 대처 감소시킵니다.
- 솟다 새장 앉아 설치류 음식과 물 한 병을 포함하는 보안 개체 스틸 바구니를 사용합니다.
참고 :이 케이지 설치가 가장 중요 케이지 존재의 끝 부분에 대해 농축 관의 배치로, 동물의 안전하고 쉽게 캡쳐 할 수 있습니다.
- 취급
- 동물 시설 기술자가 발사하기 전에 전 흥미로운에게이를 피하기 위해, 아침 코튼 래트 핸들절차.
- 모든 절차 동안 보호를 위해 두꺼운 가죽 장갑을 착용하십시오.
- 동물이 주로 농축 관에 남아으로, 일상적인 청소하는 동안 새 케이지에 쥐를 전송하는 데 사용할. 또한, 핸들러가 자신의 손에 도달 할 수 있도록 약간의 새장을 열고, 동물은 단지 어깨 위의 피부를 scruffing 아래로 밀어 억제 할 수있다. 동물이 자신의 혀를 물지 수 있으므로 연습주의 과도한 힘을 사용하지.
- 인내심과 동물이 강한 비행 또는 싸움 반응을 실행 케이지 밖으로 뛰어 캡처를 방지하기 위해 노력할 것 같이 지속적으로 손을 사용합니다. degloving가 발생으로 중요한 것은, 꼬리 동물을 처리하지 않습니다.
- 트랩 직접 처리를 통해 자신의 부화 튜브의 동물. 이것은 크게 부상과 탈출을 감소시킨다.
4. 캡처 및 마취
- 포착
- 보호를위한 두꺼운 가죽 장갑을 착용모든 과정에서 이온.
- 공기와 뚜껑, 용기와 가스 출력 호스 (그림 3)에 장착 코 콘 맞게 충분히 큰 마취 유도 챔버 구멍이있는 대형 투명 플라스틱 용기를 사용합니다.
- 절차를보다 효율적으로하기 위해 이소 플루 란, 흡입 마취제에 동물의 노출 시간을 감소 쌍으로 작동. 확인 한 연구원을 만드십시오 (핸들러 # 열고 케이지 스틸 커버를 교체하고 유도 챔버의 뚜껑 (1 핸들러 #)에 대한 책임과 그 동료는 유도 챔버로 튜브와 운송 동물의 캡처에 대한 책임 2).
- 평평한 표면에 케이지를 놓고 외부 덮개를 제거합니다. 약간 철강 공급 트레이를 들어 올리고는 케이지의 양쪽과 뒷면에 대하여 평행 천천히 농축 관으로 이동합니다. 필요한 경우, 교반 동물 피하기 케이지를 열지 않고 농축 튜브를 기동 객체를 사용하여 (처리R # 1).
- 동물이 동요되고 튜브를 벗어나면, 동물이 휴식과 다시 한번 튜브 (핸들러 # 1)에 정착 할 충분한 시간이 필요합니다.
- 천천히 그리고 신중하게 케이지와 접촉하는 다른 쪽 끝을 유지, 농축 관에서 스틸 커버 먼의 가장자리를 들어 올립니다. 플라스틱 용기 (2 핸들러 #)를위한 충분한 공간이 큰합니다.
- 하나 부드럽고 빠른 움직임에서 농축 관의 솟다 플라스틱 컨테이너를 밀어 넣습니다. 튜브에 동물을 포획, 케이지의 측면과 용기의 접촉을 유지한다. 가능 (핸들러 # 2) 빨리 단계 4.1.6과 4.1.7를 수행합니다.
- 철강 공급 트레이를 제거하고 # 2 (핸들러 # 1) 핸들러에 플라스틱 용기 뚜껑을 제공합니다. 그 과정에서 포획 된 동물의 부속도 중시하여, 케이지 용기의 측면 사이에 플라스틱 뚜껑을 밀어 넣습니다. 이것은 다음 단계를 더욱 어렵게하는 바와 같이 용기를 밀봉하지 않음 (처리기 # 2).
- Anesthes아이오와
- 확인 컨테이너가 닫혀 확인하고 유도 챔버에 동물을 운반 할 것. 신속 챔버 내의 동물을 배치하고 하나의 유체 운동 (처리기 # 2)에 용기 뚜껑을 제거한다. 열고 즉시 유도 실 덮개를 교체 (핸들러 # 1).
- 유도 챔버 (/ 분 5 L)에 이소 플루 란의 흐름을 켜고 신속하게 가스 순환을 촉진 유도 실에서 모두 제거 튜브와 컨테이너에서 동물을 밀어 점하는 혼수의 징후에 대한 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 쥐가 완전히 마취 할 때, 작업 표면으로 이동하고 코 콘 (그림 3)로 코와 입을 놓습니다. 쥐가 완전히는 강력한 발가락 핀치에 응답하지 않는 경우 마취.
- 건조 및 찰과상을 방지하기 위해 동물의 눈에 수의사 바셀린 안과 연고를 놓습니다. 이면 쥐가 부상이 발생하면 감염에 발생하기 쉬운 큰 눈을 가지고 필수적인 단계이다. <리>주의 깊게 모니터하고 일정한 호흡 속도를 유지하고 동물의 코 절차 내내 피팅 노즈콘 유지되도록. 적절 이소 플루 란의 유량을 조정한다. 이소 플루 란의 양은 각각의 동물이 달라집니다 마취해야합니다.
- 이후 절차는 새장에 동물을 반환하고 완전한 이동성과 흉골 드러 누움을 회복 확인합니다.
피하 종양 형성을위한 LCRT 세포의 5. 준비
참고 : LCRT의 한 T-150 플라스크 (90 % 컨 플루)는 약 2 × 10 7 세포를 얻을 수 있습니다. 필요한 세포의 총 수에 필요한 T-150 플라스크 참조하시오. 수득 필요한 세포의 총 수를 보장하기 위해 별도의 플라스크 시드 및 제조 및 추가 주입에 필요한 그 세포 중에 손실을 수용하도록. 세포 생존을 연장 가능하면 얼음에 세포를 보관하십시오.
- 플라스크에서 세포를 흡인 매체를 수확1X PBS 5ml를 가진 D 린스 세포.
- 대기음 PBS와 세포가 플라스크 (~ 2 분)에서 해리 될 때까지 1X 트립신 2 ㎖에 세포를 배양한다.
- 부드럽게 (10 ml의 세포 현탁액의 총) 8 ml의 배지에 재현 탁 세포는 세포의 덩어리를 깨고 아래로 피펫. 추가 플라스크에서 세포를 수확하기 위해 계속합니다.
- 한 원뿔 튜브 50 ML 원뿔 튜브 당 약 4 T-150S에 모든 세포 현탁액을 풀.
- 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 160 × g에서 튜브.
- 대기음 매체를 이용하여 혈구 계산 가능 범위 내에서 세포 밀도를 수득 PBS의 적절한 음량 (T-150 당 10 ml의 PBS)에서 세포 펠렛을 재현 탁. 정확한 세포 수를 확인하기 위해 철저하게 사전 피펫 팅 아래로하여 혈구를로드에 세포 현탁액을 섞는다.
- 세포의 총 수를 계산한다 :
세포의 총 수 = 세포 수 (세포 / ㎖)에 재현 탁 수확 X 부피 (mL) 중 - 결정모든 주사에 필요한 세포 현탁액의 부피. 실험 2-3 여분의 용량을 확인합니다. 피하 주사 5 × 5 LCRT 세포의 총 3-4 일 이내에 종양 만져서을 형성 할 것이다.
필요한 세포의 총 수 = 5 × 10 5 세포의 X 용량의 총 수를
볼륨 세포 현탁액 요구 (ML) = (* 합계 주입량에 요구되는 전체 셀) / (수확 된 세포의 총 수) - 피펫 필요한 PBS를 함유하는 원뿔형 튜브에 세포 현탁액 부피 철저히 혼합한다. 에펜 도르프 튜브로 나누어 각각의 주사 (100 μL). 주입 과정에서 얼음에 튜브를 유지한다.
6. 주사
참고 : 한 동안 다른 모니터 동물의 호흡 속도와 일반 조건 동안 마취 주사를 수행하기 위해, 두 연구자들과 절차를 수행합니다. 모든 주사하고 새로운 바늘에 대한 인슐린 주사기 (29 G가 0.3 ml의 '1/2 X)를 사용하여각 동물.
- 피하 주사
- 캡처 동물 (섹션 4) 마취.
- 가위를 사용하여 주사 부위를 면도. 코튼 쥐 모피는 두께와 주사의 매끄러운 표면을 얻기 위해 날카로운 트리머가 필요합니다. 면봉을 사용하여 70 % 에탄올로 주사 부위를 청소하고 진행하기 전에 완전히 증발 할 수 있습니다.
- 천천히 그리고 꾸준히 그림으로써 세포와로드 주사기 (29 G의 X 1/2 ', 0.3 mL)를 첨가 하였다. 거품은 약간의 힘으로 주사기 분명 영화 경우. 기포가 상부로 푸시 일단 액체까지 플런저 바늘의 상부에있다.
- (피부 텐팅 (tenting)라고 함) 주사 부위 피부를 올리고 바늘 베벨면을 위로 삽입한다. 확인 바늘이 근육 주입 방지하기 위해 피부 아래에 자유롭게 이동합니다.
- 균등 천천히 주사기의 내용물 추방. 아래 바늘 베벨 측면을 철회.
- 종양 내 주사
- 캡처동물 (섹션 4) 마취 거라고.
- 면봉을 사용하여 70 % 에탄올로 주사 부위를 청소하고 진행하기 전에 완전히 증발 할 수 있습니다.
- 수직으로 바늘을 잡고 천천히, 그리고 꾸준히 그려서 바이러스 접종과로드 주사기 (29 G가 0.3 ml의 '1/2 X). 거품은 약간의 힘으로 주사기 분명 영화 경우. 기포가 상부로 푸시 일단 액체가 바늘의 상단이 아닐 때까지, 플런저.
- 종양 내로 바늘 경사 측면을 삽입하고 부분적 종양 열상을 방지하기 위해 각각 이동 전에 바늘을 인출, 부채꼴 패턴으로 바늘을 이동시키면서 고르게 천천히 주사기의 내용물을 배출. 아래 바늘 베벨 측면을 철회.
참고 : 피하 LCRT 종양이 빠르게 성장 5~7일 약 100mm 3 도달입니다. 또한, 괴사 성 출혈성 센터들은 종종 며칠 이내에 종양의 표면에 형성하고, 위성을 필요reful 모니터링 (그림 4).
- 복강 내 주사
- 캡처 동물 (섹션 4) 마취.
- 면봉을 사용하여 70 % 에탄올로 주사 부위를 청소하고 진행하기 전에 완전히 증발 할 수 있습니다.
- 천천히 그리고 꾸준히 그리기에 의해 약물과로드 주사기 (29 G가 0.3 ml의 '1/2 X). 거품은 약간의 힘으로 주사기 분명 영화 경우. 기포가 상부로 푸시 일단 액체가 바늘의 상단이 아닐 때까지, 플런저.
- 복부의 오른쪽 하복부에 바늘을 삽입합니다. 혈액이나 대변이 흡입되지 않도록 다시 플런저에 당겨,이 바늘의 잘못된 위치를 나타냅니다. 이 경우, 바늘을 인출하고 새로운 주사기를 준비한다. 바늘이 정확하게 배치 될 때, 균등하게 천천히 주사기의 내용물을 배출.
7. 종양 절제술 및 부검
- 수집과 알을 청소70 % 에탄올 이전에 동물의 안락사에와 리터 도구.
- 원하는 방법으로 동물을 안락사, CO 2 흡입 (5 ~ 10 분 동안 2 리터 / 분)을 권장합니다. 몸 상태가 비정상 동물을 검사합니다.
- 해부 보드에 지느러미 드러 누움의 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 동물을 청소합니다.
- 하복부의 피부를 들어 올려 핀셋을 사용합니다. 가위를 사용하여 피부와 근육을 잘라 동물의 길이 (턱 항문)를 실행하는 중간 절개를합니다.
- 두 컷, 측면 흉곽의 측면을 하나는 심장과 폐를 노출하는 흉골에 걸쳐 하나를하여 갈비뼈를 잘라. 어떤 전이 27, 29에 대한 폐의 로브를 검사합니다.
- 이상에 대한 모든 장기를 검사하고 색상, 크기 및 일관성의 모든 변경 사항을 기록합니다. 필요한 경우, 내부 조직을 조사 메스 기관 절개. 구체적으로는, 간, 신장, 비장 및 위장관 검사.
- 전이의 림프절을 검사하고 27, 29 증축.
- 종양을 수집하기 위해, 측면 절개 위와 피부 핀셋 본체로부터 멀리 당겨질 수 있도록 아래 종양 만든다. 단단히 핀셋으로 피부를 누른 상태에서 조심스럽게 종양과 진피 (그림 5) 사이를 절단하여 종양을 제거하기 위해 메스를 사용합니다.
- 즉시 10 % 중성 포르말린의 레이블이 용기에 종양을 배치합니다.
- 종양의 크기에 따라 수 1~2일 (≤ 2mm, 작은) 또는 5~6일 조직 학적 분석 (그림 6)에 대한 섹션을 준비하기 전에 고정 (> 2mm, 대형).
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Representative Results
인해 코튼 래트 극히 자연 흥분성, 숙지해야 및 전임상 동물 모델로서의 용도에 완화 될 동물의 스트레스를 완화하는 최적화 절차를 이용하는 것이다. 적절한 처리 기술의 사용은 또한 연구원에 위험을 최소화합니다.
면 쥐를 사용하는 경우는 침착 필수적이다. 쥐 매우 흥분하고 자신의 새장을 탈출을 시도합니다. 농축 관과 탈출 시도를 최소화 할 수 nestlets의 사용. 그림 2는 농축 관의 배치를 포함하는면 쥐의 캡처에 도움이되는 최적의 케이지 설정을 보여줍니다. 탈환을 돕기 위해 가능하면 또한, 작은 방에서 작동합니다. 탈출이 발생하는 경우, 다음 맑은 캡처 컨테이너로 덮거나 과도한 힘을 사용하지 않도록주의, 장갑을 낀 손으로 커버, 진정하고 고정 남아 동물 기다립니다.
마우스와 대조적으로, 코튼 래트는 긴 주둥이 w를 갖는다HICH는 마취 가스를 제공하는 피팅 다른 코가 필요합니다. (3)이 제대로면 쥐에 맞게 이소 플루 란의 전달을 극대화하기 위해 설계된 코 콘을 보여줍니다. 피팅으로 고무 멤브레인을 사용하면 쥐의 코에 외상이 발생할 수 있습니다.
버려진 동물을 얻을 수있는 경우 쥐에 그들을 시도하기 전에 주입 기술을 연습 (그 그렇지 않으면 다른 연구자, 면화, 쥐 또는 필요하지). 이 연구원은 바늘과 방법을 안전하게 처리하는 방법에 대한 이해를 높이는데 일조를 할 수 있습니다. 피부가 마우스에 비해 두껍고 거칠다로 인슐린 주사기면 쥐에 주사를 제안한다. 그러나, 더 큰 바늘 (21 G X 1 ')으로 인한 세포 주입시에 전단 세포 생존 능력의 손실을 피하기 위해 종양 세포의 주입을 위해 사용될 수있다. 안전주의 사항 등 날카로운 물건 용기에 바늘과 적절한 처분을 재현하면서 않은 것으로, 따라야한다.
injec생존 가능한 종양 세포의 적절한 기 종양 형성에 중요하다.도 1a는 코튼 래트에 주입을 위해 준비 될 수 LCRT 셀 건강한 단층을 도시한다. 비교도 1b는 낮은 가능성을 가질 주사제 사용하지 않아야 LCRT 세포를 나타낸다. 이 주사를 세포를 카운트 할 때 이러한 트리 판 블루로 염색 방법을 이용하여 종양 세포 생존을 확인하는 것이 중요하다.
LCRT 세포에서 형성된 종양은 빠르게 성장하고 괴사 센터는 자주 (그림 4A)을 형성한다. 따라서, 종양 형성 궤양 (그림 4B)을 방지하기 위해주의 깊게 모니터링해야한다. 궤양이 발생하면 동물은 패혈증 감염 및 사망 가능성을 방지하기 위해 희생해야한다.
항암 치료의 효과는 종종 가장 조직 학적 분석을 통해 조사된다. 이 종양 사후의 절제가 필요합니다. 유지 종양 조직 무결성 입술됩니다생체 내 종양에 대한보다 정확한 표현 샘플 ULT.도 5는 종양 신중 메스와 핀셋을 사용하여 주변 조직으로부터 분리하는 절단 기법을 나타낸 것이다. 적절한 조직 학적 분석에 영향을 미치는, 종양 파열 또는 종양 조직의 무결성을 방해 할 수 핀셋을 사용하여 주변 조직으로부터 힘에 의해 당겨 종양 제거. 도 6에 도시 된 바와 같이 종양 치밀하고 고도의 혈관 구조는,이 절단 기술에 의해 유지된다. 많은 OVS의 경우에서와 같이 이는 종양 혈관계에 영향을주는 치료의 분석에서 중요하다.
그림 1 :. 건강의 LCRT 세포의 밝은 필드 현미경 이미지 (A) 표현형 (~ 90 % 가능한)면 쥐에 주입을위한 준비를위한 준비 LCRT 세포. LCRT 세포의 (B) 바람직하지 않은 표현형 사출에 적합하지. 둥근 세포는 죽거나 (화살표로 표시) 죽어 가고 있습니다. 이미지는 10 배 배율로 촬영되었다; 스케일 바 = 1mm.
그림 2 :면 쥐의 캡처의 편의를 위해 케이지 설치의 예 케이지 동물 캡처 nestlets 에이즈의 포함의 말에 농축 관의 최적의 위치..
그림 3 :. 마취면 쥐에 이소 플루 란의 전달을위한 피팅 마취 코 콘 제조 코 콘 코에 외상없이 이소 플루 란 가스의 정확한 전달을 보장하는면 쥐의 가늘고 긴 주둥이를 맞는다.
그림 4 :. 피하 LCRT 종양의 괴사 조직 (A) 종양 조직의 괴사의 초기 단계. 동물은 신중하게 (B) 완전히 개방 궤양으로 진행을 방지하기 위해 모니터링해야합니다. 감염과 패혈증과 같은 종양 ulcerates가 발생할 수있는 경우 동물은 희생해야한다.
도 5 :. 조직학 피하 LCRT 종양 절제면 쥐의 옆구리에 피하 종양 신중 따라서 조직 학적 분석을 위해 종양 아키텍처의보다 나은 표현을 제공하고, 종양 조직의 무결성을 유지하기 위해 메스를 이용하여 피부로부터 제거된다.
그림 6 :. 피하 LCRT 종양에서 조직 학적 조직 섹션은 LCRT 종양 조직의 형태는 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색 파라핀 섹션을 사용하여 조사 하였다. 이미지는 20 배 배율로 촬영 한; 스케일 바 = 1mm.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965-092 | May use any brand |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Can prepare in lab, filter to sterilize | ||
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | May use any brand |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | May use any brand |
| Fetal bovine serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| T-150cm2 tissue culture flask | Fisher Scientific | 14-826-80 | May use any brand |
| 1X TypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| 12-well cell culture plate, flat bottom | Fisher Scientific | 08-772-29 | May use any brand, must be tissue culture treated |
| alamarBlue | Life Technologies | DAL1025 | May use an alternative reagent for determination of cell viability |
| 8640 Teklad 22/5 Rodent diet | Harlan | 8640 | |
| 1/8” corncob rodent bedding | Harlan | 7092 | |
| Nestlets | Ancare | - | Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable |
| 50 mL Conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | May use any brand, must be sterile |
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| 70% Ethanol | Can prepare in lab | ||
| 10 % Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | May use any brand |
| NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) | NAPCO | Model used not currently available | May use any brand |
| Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath | Fisher Scientific | Model used not currently available | May use any brand |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reichert Bright-line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | May use any brand |
| Typhoon Trio BioAnalyzer | GE Healthcare Life Sciences | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader | Tecan | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Allegra 6R benchtop centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| Table Top Anaesthesia machine | VetEquip | Model used not currently available | May use any brand, must be portable |
| Wahl Peanut Mini Clippers | Wahl | May use any brand of small clippers | |
| Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL | BD | 329464 | May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. |
| Cotton swabs | MedPro | 018-425 | May use any brand |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
References
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