Introduction
וירוסי Oncolytic (OV) לשכפל באופן סלקטיבי בתאי גידול על ידי ניצול הבדלים ביוכימיים בין תאים נורמלים וסרטניים 1,2. ישנם שני סוגים של OVS: אלה שאינם דורשים מוטציה להשיג oncolysis סלקטיבית, המכונים וירוסי wild-type כמתרחשים באופן טבעי ואלה אשר חייבים להיות מהונדסים כדי להשיג oncolysis סלקטיבית. האוסף של מוטציות בתוך סוג גידול נתון קובע את אופי יתרון הצמיחה סלקטיבית על פני תאים נורמלים לOV 2. הבטיחות והתועלת של OVS באמצעות הודגמה בניסויים קליניים 3-7. למרות התקדמות בתחום virotherapy oncolytic קיימים פערים בין תוצאות פרה-קליניות וקליניות, המצביע על כך יש צורך במודלים טובים יותר להעריך את היעילות אנטי-הסרטנית של OVS.
סוג הווירוס ההרפס שור 1 (BHV-1) הוא חבר של משפחת הרפס, ותת-משפחת Alphaherpesviridae. BHV-1 initiates השור מורכב מחלה בדרכי הנשימה בבקר, מפגין במגוון רחב של תסמינים דומים 8,9 קר רע. BHV-1 נקשר קולטנים התקשרות וכניסה בשימוש על ידי HSV-1, כגון סולפט וnectin-1 10 heparan. עם זאת, הוא נקשר CD155 במקום של nectin-2 10. יש BHV-1 טווח מארח צר מאוד כך שהוא אינו יכול להיכנס ביעילות ובליזום שכפול בתאים עכבריים רגילים והפכו את 3,4,10. זה הופך את השימוש במודלים עכבריים קונבנציונליים בעייתי. קיבולת oncolytic של BHV-1 כבר הוכיחה במבחנה 11,12. BHV-1 הוכח ליזום שכפול ובלהרוג תאים סרטניים אנושיים ממגוון רחב של מקורות היסטולוגית, כוללים תאי סרטן השד וסרטן שד ייזום תאים 11,12. עם זאת, היכולת אנטי-הסרטנית של BHV-1 חייבת להיות מוערכת in vivo בהקשר של מארח עם מערכת חיסון תקין.
האדם Adenovirus (Ad), שליש 57 זנים אל מזוהים, בדרך כלל גורם למחלה בדרכי הנשימה בבני אדם. וקטורי Ad Oncolytic נבדקו ליעילות אנטי-הסרטנית שלהם עם כמה קידום לניסויים קליניים 13-15. למרות נתונים פרה-קליניים מבטיחים, תוצאות קליניות נפלו קצרות של ציפיות. מודלים xenograft גידול אנושי משמשים בדרך כלל כדי לחקור את היעילות אנטי-הסרטנית של וקטורי מודעות, למרות שהם מפגינים נחלשו מערכת חיסונית לווירוס 16,17. יתר על כן, מודלים עכבריים syngeneic הם אוֹסְרָנִי לזיהום מודעות, מה שהופכים את ההערכה של תגובות חיסוני מארח תוך שימוש במודלים אלה מעשיים 17,18.
המערכת החיסונית המארח זוהתה כמנגנון המשפיע ביותר על ידי שOVS להוציא מוות של תאים סרטניים 19. תגובות אנטי-סרטניות בין tolerized ואנטיגן גידולים הקשורים אינו tolerized דגמים (TAA) שונים ויכולות להשפיע על ההצלחה של טיפול OV מאוד. OV KM100 HSV-1 (ICP0 n212VP16 בשנת 1814 20) 20,21 עורר נסיגה של גידול ב -80% מעכברי נושאי גידול במודל סרטן שד אנטיגן Polyoma התיכון T העכברי 22. עם זאת, בדגמים / neu HER-2, היעילות אנטי-הסרטנית של KM100 נעה בין 20% רגרסיה מלאה בעכברי syngeneic וקיפאון בגידול מהונדס, HER2-tolerized עכברים. יחד נתונים אלה מדגישים את החשיבות של הערכה מלאה OVS באמצעות מודלים של בעלי חיים בצורה הטובה ביותר לשחזר את נוף החיסון האנושי כדי להבין מה תכונות שתקבענה את ההצלחה טיפולית.
החולדה הכותנה (hispidus Sigmodon), ילידי צפון אמריקה והדרום, היא נפוצה ביותר כמודל של זיהום בנגיף syncytial נשימה (כפי שנסקר ב5). חולדות כותנה משמשות גם במחקר חיסון נגד BHV-1 כפי שהם לשחזר את הפתולוגיה הקשורים למחלות בדרכי הנשימה שור מורכבות 6,23. יתר על כן, זיהום BHV-1 של חולדות כותנההוא חיסוני, גרימה רירית מתמשכים ותגובות חיסוניים מערכתיות 6,23-25. שורות תאים כבר נגזרו fibrosarcoma וosteosarcomas של בלוטת החלב (LCRT) והעצם (CCRT וVCRT), בהתאמה 26 ספונטניים. חולדות כותנה היו בשימוש כדי להעריך את יעילות in vivo של וקטורי Ad oncolytic כפי שהם רגישים לזיהום מודעות ולהפגין פתולוגיה דומה לבני האדם 27-29. השימוש במודלי מדוכאי חיסון להערכה טרום הקלינית של OVS הם לא רק פחות מעיד על תגובה הקלינית לטיפול, אבל הם אינם לוקחים בחשבון את תפקידה של מערכת החיסון בvirotherapy oncolytic 30,31. לכן, syngeneic והמודלים של עכברים כותנה-tolerized גידול של סרטן השד וסרטן עצמות הם מודלים רלוונטיים שבו להעריך את היעילות פרה-הקלינית של OVS, כגון BHV-1 ומודעות שלא ניתן ללמוד באמצעות מודלים עכבריים קונבנציונליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקולים המשמשים אושרו על ידי בעלי החיים מחקר האתיקה המועצה המוסדית שלנו באוניברסיטת מקמאסטר פי מועצה קנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים. ניסויים בוצעו במתקן אוניברסיטת מקמאסטר המרכזי בבעלי חיים.
1. התאים culturing LCRT
- תאי LCRT התרבות במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), L-גלוטמין 2 מ"מ, 100 U / ml פניצילין ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. שמור על תאים בתרבית רקמת צלוחיות T-150 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תאי מעבר כאשר הם יוצרים 90% monolayer מחוברות (כל 2-3 ימים, איור 1).
- פוספט 1x טרום חם שנאגרו מלוח (PBS), 1x טריפסין ובינוני באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני פיצול התאים.
- בינוני לשאוב מהבקבוק ולשטוף תאים עם 5 מיליליטר של 1x PBS.
- לאחר השטיפה, לשאוב PBS ודגירהתאים עם 2 מיליליטר של 1x טריפסין עד תאי לנתק מהבקבוק (~ 2 דקות).
- תאי Resuspend ב 8 מיליליטר בינוני (עבור הסכום כולל של 10 מיליליטר השעיה תא) ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לשבור את הגושים של תאים.
- שמור על תאים בבקבוק T-150 על ידי זריעת 1 מיליליטר השעיה תא לתוך 24 מיליליטר בינוני (עבור סכום כולל של 25 מיליליטר לT-150) ובקבוק רוק בעדינות מצד לצד. שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד הפיצול הבא.
2. הערכת שכפול וירוס וCytotoxicity בתאי LCRT
- שכפול וירוס
הערה: מבני וירוס להביע תג ניאון, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), תחת שליטה של יזמים נגיפיים אנדוגני להקל להדמיה של זיהום בנגיף ולהפיץ באמצעות קוראי צלחת הקרינה.- תאי זרע LCRT לתוך צלחות תרבות, עוזבים גם לספירה. תאי זרע כך שהם יהיו% ומחוברות 80-90 יום אחד מאוחר יותר. השתמש בריכוז של 10 5 celמיליליטר / ls (מחיר גם 100 μl) כדי לייצר את confluency הרצוי יום אחד מאוחר יותר ב 96-גם צלחות תחתית שטוחות.
- למחרת, טרום חם 1x PBS, 1x טריפסין, בינוני מלאה וסרום ללא באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות לפני תחילת הניסוי.
- בינוני לשאוב מהתאים לספור היטב ולשטוף עם 5 מיליליטר של 1x PBS על ידי נדנדתו מעל פני השטח של הבאר.
- לאחר שטיפה, התאים לשאוב PBS ו דגירה עם 2 מיליליטר של טריפסין 1x עד תאי לנתק מהבקבוק (~ 2 דקות).
- Resuspend התאים בהיקף המתאים של מדיום שלם להניב צפיפות תאים בטווח ספיר באמצעות hemocytometer. כדי להבטיח ספירת תאים מדויקת, ומערבב היטב את ההשעיה התא לפני inoculating hemocytometer על ידי pipetting מעלה ומטה.
- לקבוע את עוצמת הקול של מניות וירוס הנדרשות לזיהום בריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים).
חובה Paque יצירת יחידות (pfu) = מספר התאים מצופים * משרד הפנים(Pfu / תא)
נפח של מניות וירוס הנדרש = כייל מניית pfu / וירוס הנדרש (pfu / מיליליטר) - הכן הבידוד נגיף במדיום סרום ללא בצינורות. מערבבים היטב על ידי vortexing או pipetting לפני הוספת הבידוד לתאים.
- להדביק תאים עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, לאחר שחל כיסוי תחזוקה של DMEM + 1% FBS.
- צלחות Scan אחד ושני ימים לאחר פגיעה (pi) כדי לחזות הקרינה GFP.
- Cytotoxicity וירוס
הערה: בצע את assay cytotoxicity resazurin בתנאי אור נמוכים כמתחם הוא רגיש לאור. מדיום המכיל גם רק צריך להיות כלול לתקן לקרינת רקע.- הכן פתרון של 5% (v / v) של resazurin ב1x PBS. מערבבים את הפתרון על ידי pipetting.
- בינוני לשאוב מהתאים ולהחיל את פתרון resazurin 5%. כולל גם בינוני מכיל רק כדי לתקן את הקרינה רקע.
- דגירה תאים למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לאחראשר קרא הקרינה באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי (ננומטר 530 עירור, פליטה 595 ננומטר).
- לנתח נתונים ביחס לקבוצת ביקורת שלא נדבקה תיקון לקרינת רקע.
3. שיכון וטיפול
- שיכון ותזונה
- חולדות כותנה הבית בנפרד לירידה בלחימה בכלובי עכברים פוליקרבונט המכילים מצעים מכרסמים (1/8 "מצעי קלח תירס), קטע של צינור PVC לא יותר מ 8 אינץ 'וnestlets כהעשרה (איור 2).
- השתמש בסל פלדה לאבטחה לשבת overtop של הכלוב ומכיל מזון מכרסם ובקבוק מים.
הערה: התקנת כלוב זה תאפשר ללכידה בטוחה וקלה של בעלי החיים, עם המיקום של צינור ההעשרה נגד סוף ההוויה הכלוב בעל החשיבות העליונה.
- טיפול
- ידית חולדות כותנה בבוקר, לפני סיבובים על ידי טכנאי מתקן בעלי חיים, כדי למנוע מרגש אותם לפני שהליך.
- במהלך כל ההליכים, ללבוש כפפות עור עבות להגנה.
- כמו החיות נשארות בעיקר בצינורות ההעשרה, להשתמש בם כדי להעביר את החולדות לכלוב חדש במהלך ניקוי שיגרתי. לחלופין, לפתוח את הכלוב מעט כדי לאפשר למטפל להגיע ידם ב, בעלי החיים אז יכולים להיות מרוסנים על ידי scruffing העור בדיוק מעל הכתפיים ודוחפים כלפי מטה. טיפול בפועל לא להשתמש בכוח מופרז כמו בעלי החיים עלולים לנשוך את לשונם.
- היה סבלני ולהשתמש יד יציבה כמו שיש לי בעלי החיים תגובת טיסה-או-קרב חזקה וינסו להימנע מלכידה על ידי ריצה וקפיצה מחוץ לכלוב. חשוב לציין, לא מטפל בבעלי חיים בזנב כdegloving יתרחש.
- מלכודת החיות בצינורות המוספים שלהם על טיפול ישיר. זה באופן דרסטי מפחית פציעות ונמלט.
4. לכידה והרדמה
- לכידה
- ללבוש כפפות עור עבות להגנה מפנייון בכל ההליכים.
- השתמש במכל פלסטיק שקוף גדול עם חורים לאוויר ומכסה, חדר אינדוקציה הרדמה גדול מספיק כדי להתאים את המכל ומצויד לצינור גז הפלט (איור 3) חרטום.
- עובד בזוגות כדי להפוך את ההליך יעיל יותר ולהקטין את זמן החשיפה של בעלי החיים לisoflurane, הרדמה משאיפת. הפוך חוקר אחד בטוח הוא אחראי לפתיחה והחלפת מכסה הפלדה בכלוב ואת המכסה של תא האינדוקציה (מטפל # 1) ולקשר שלהם הוא אחראי ללכידתו של בעל החיים בצינור והתחבורה לתא האינדוקציה (# מטפל 2).
- מניחים את הכלוב על משטח שטוח ולהסיר את המכסה החיצונית. הרם את מגש הזנת פלדה מעט ולתמרן לאט צינור ההעשרה ולכן הוא מקביל עם הצדדים של הכלוב ועל הגב. במידת צורך, להשתמש באובייקט לתמרן צינור ההעשרה מבלי לפתוח את הכלוב כדי למנוע התססה בעלי החיים (טיפול ב# R 1).
- אם בעל החיים הופך להיות נסערים ומשאיר את הצינור, לאפשר מספיק זמן לבעלי החיים להירגע ולהתיישב שוב בצינור (# המטפל 1).
- לאט ובזהירות להרים את הקצה של מכסה פלדה רחוק מצינור ההעשרה, שמירה על הקצה השני במגע עם הכלוב. הפוך מרחב גדול מספיק למכל הפלסטיק (מטפל # 2).
- בתנועה חלקה, מהירה אחד, לדחוף את מיכל פלסטיק overtop של צינור ההעשרה. לשמור על קשר של המכל עם הצד השני של הכלוב, לכידת בעלי החיים בצינור. בצע את השלבים 4.1.6 ו4.1.7 במהירות (מטפל # 2) אפשרי.
- הסר את מגש הזנת הפלדה ולתת את המכסה מיכל הפלסטיק למטפל # 2 (מטפל # 1). חלק את מכסה הפלסטיק בין הצד של הכלוב והמכל, להיות מודע לאיברים של בעלי החיים שנלכדו בתהליך. לא לאטום את המכל כמו זו תהפוך את הצעד הבא קשה יותר (# מטפל 2).
- AnesthesIA
- ודא שהמכל נותר סגור ולהעביר את בעלי החיים לתא האינדוקציה. במהירות למקם את החיה בחדר ולהסיר את המכסה מיכל בתנועה אחת נוזל (מטפל # 2). פתח ולהחליף את המכסה תא אינדוקציה מייד (# מטפל 1).
- הפעל את זרימת isoflurane לתא האינדוקציה (5 L / min) ולפקח על בעלי החיים לסימנים של עייפות, שבנקודה להחליק את בעלי החיים במהירות מהצינור והמכל, הסרת שניהם מתא האינדוקציה כדי להקל על זרימת גז.
- כאשר החולדה היא בהרדמה מלאה, להעביר אותה למשטח העבודה ולשים את האף והפה לחרטומו (איור 3). העכברוש הוא בהרדמה מלאה כאשר הוא מגיב לקמצוץ הבוהן כוחני.
- הנח משחת עיני וזלין הווטרינר בעיניו של בעל החיים כדי למנוע יובש ושפשופים. זהו צעד חיוני כמו חולדות כותנה עיניים גדולות שיכול להיות פגיעות לזיהומים אם פגיעה מתרחשת. <li> לפקח בזהירות ולשמור על קצב נשימה קבוע ולהבטיח כי האף של שרידי בעלי החיים בחרטום הולם לאורך כל ההליך. התאם את קצב הזרימה של isoflurane כראוי. כמות isoflurane נדרשה להרדים כל חיה תשתנה.
- פוסט הליך, להחזיר את בעל החיים לכלוב שלה ולהבטיח שהיא חוזרת לניידות מלאה וכיבו sternal.
5. הכנת תאי LCRT להיווצרות גידול תת עורי
הערה: בקבוק אחד T-150 של LCRT (confluency 90%) בתשואה של כ 2 x 10 7 תאים. לבסס את מספר T-150 צלוחיות הנדרשות על המספר הכולל של תאים דרושים. זרעי צלוחיות נוספות כדי להבטיח את המספר הכולל של תאים נדרשו מתקבל וכדי להכיל תאים שאבדו במהלך הכנה ואלה נזקקו לזריקות נוספות. שמור את התאים על קרח בכל ההזדמנות אפשרית כדי להאריך את כדאיות תא.
- לקצור תאים, בינוני לשאוב מהבקבוקתאי שטיפת ד עם 5 מיליליטר של 1x PBS.
- לשאוב PBS ו דגירה תאים עם 2 מיליליטר של 1x טריפסין עד תאי לנתק מהבקבוק (~ 2 דקות).
- תאי Resuspend ב 8 מיליליטר בינוני (עבור הסכום כולל של 10 מיליליטר השעיה תא) ופיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לשבור את הגושים של תאים. תמשיך לקצור תאים מצלוחיות נוספות.
- בריכה כל השעיות התא לתוך צינור חרוטי אחד, כ -4 T-150S לכל צינור חרוטי 50 מיליליטר.
- צנטריפוגה הצינור בg x 160 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
- לשאוב בינוני וresuspend התא גלולה בנפח המתאים של PBS (10 מיליליטר PBS לכל T-150) להניב צפיפות תאים בטווח ספיר באמצעות hemocytometer. כדי להבטיח ספירת תאים מדויקת, ומערבב היטב את ההשעיה התא לפני טעינת hemocytometer על ידי pipetting מעלה ומטה.
- לחשב את המספר הכולל של תאים:
מספר כולל של תאים נקצר = ספירת תאים (תאים / מיליליטר) x resuspension נפח (מיליליטר) - לקבועהיקף ההשעיה תא הנדרש לכל הזריקות. הפוך 2-3 מנות נוספות לניסוי. סך של 5 x 10 5 תאי LCRT מוזרקים תת עורי יהווה גידולים מוחשיים בתוך 3-4 ימים.
מספר כולל של תאים נדרשו = 5 x 10 x 5 תאים מספר כולל של מנות
נפח תא השעיה דרוש (מיליליטר) = (תאים כולל הנדרשים * סכום של כרכי הזרקה) / (מספר כולל של תאים שנקטפו) - Pipet הנפח הנדרש של השעיה תא לתוך צינור חרוטי המכיל PBS ומערבבים היטב. זריקות Aliquot בודדות (100 μl) לתוך צינורות Eppendorf. לשמור על צינורות על קרח במהלך הליך הזרקה.
6. זריקות
הערה: בצע את ההליכים עם שני חוקרים, אחד לבצע את הזריקות בזמן צגים האחרים קצב הנשימה של בעלי החיים ומצבו כללי ואילו בהרדמה. השתמש במזרקי אינסולין (29 G x 1/2 ", 0.3 מיליליטר) לכל הזריקות ומחט חדשה לכל חיה.
- זריקות תת עורית
- ללכוד ולהרדים את החיה (סעיף 4).
- לגלח את אזור ההזרקה באמצעות קוצץ. הפרווה חולדה כותנה עבה ודורשת גוזם חד כדי לקבל משטח חלק לזריקות. נקה את אזור ההזרקה עם אתנול 70% באמצעות מקלון צמר גפן ולאפשר לו להתאדות לחלוטין לפני שתמשיך.
- מזרקים עומס (x 29 G 1/2 ', 0.3 מיליליטר) עם התאים על ידי ציור לאט ובהתמדה. אם בועות הן קפיציים ניכר את המזרק עם כמה כוח. ברגע שהבועות הן בלחיצת העליונה הבוכנה עד שהנוזל היא בחלק העליון של המחט.
- הרם את העור באזור ההזרקה (המכונה האהלת עור) והכנס את הצד עד שפוע המחט. ודא שהמחט נעה בחופשיות מתחת לעור, כדי למנוע הזרקה לשריר.
- לגרש את תוכן המזרק באופן שווה ולאט לאט. למשוך את צד פוע מחט.
- זריקות intratumoral
- ללכודד להרדים את החיה (סעיף 4).
- נקה את אזור ההזרקה עם אתנול 70% באמצעות מקלון צמר גפן ולאפשר לו להתאדות לחלוטין לפני שתמשיך.
- מזרקים עומס (29 G x 1/2 ", 0.3 מיליליטר) עם הבידוד הנגיף על ידי ציור לאט ובהתמדה, תוך כדי החזקת המחט בתנוחה זקופה. אם בועות הן קפיציים ניכר את המזרק עם כמה כוח. ברגע שהבועות הן בלחיצת העליונה אז בוכנה עד שהנוזל הוא בחלק העליון של המחט.
- הכנס את צד פוע המחט לתוך הגידול ולגרש את תוכן המזרק באופן שווה ולאט לאט תוך כדי תנועת המחט בדפוס כמו מאוורר, באופן חלקי משיכת המחט לפני כל תנועה כדי למנוע קריעה של הגידול. למשוך את צד פוע מחט.
הערה: גידולי LCRT תת עורי הם, והגיע לכ 100 מ"מ 3 ב5-7 ימים בצמיחה מהירים. יתר על כן, מרכזי נימקי ומדממים לעתים קרובות יוצרים על פני השטח של הגידול תוך מספר ימים ודורשים caניטור reful (איור 4).
- זריקות Intraperitoneal
- ללכוד ולהרדים את החיה (סעיף 4).
- נקה את אזור ההזרקה עם אתנול 70% באמצעות צמר גפן ולאפשר לו להתאדות לחלוטין לפני שתמשיך.
- מזרקים עומס (29 G x 1/2 ", 0.3 מיליליטר) עם התרופה על ידי ציור לאט ובהתמדה. אם בועות הן קפיציים ניכר את המזרק עם כמה כוח. ברגע שהבועות הן בלחיצת העליונה אז בוכנה עד שהנוזל הוא בחלק העליון של המחט.
- הכנס את המחט לתוך רבע הימני התחתונה של הבטן. למשוך בחזרה על הבוכנה על מנת להבטיח כי דם או צואה אינו להישאף, זה מצביע על מיקום נכון של המחט. במקרה זה, למשוך את המחט ולהכין מזרק חדש. כאשר המחט מונחת בצורה נכונה, לגרש תוכן של המזרק באופן שווה ולאט לאט.
7. גידול כריתה וNecropsy
- לאסוף ולנקות אלכלים l עם אתנול 70% לפני המתת חסד של החיה.
- להרדים את החיה בשיטה הרצויה, CO 2 משאיפת (2 L / min למשך 5-10 דקות) מומלצת. לבחון את בעלי החיים להפרעות במצב כל גוף.
- מניחים את החיה שכיבה על גב קרש חיתוך ולנקות את החיה עם אתנול 70%.
- להשתמש בפינצטה כדי להרים את העור בבטן התחתונה. לחתוך את העור ושרירים באמצעות מספריים ולעשות חתך המדיאלי פועל אורכו של בעל החיים (פי הטבעת לסנטר).
- חותך את הצלעות על ידי ביצוע שני חתכים, אחד רוחבי את הצד של בית החזה ואחד על פני עצם החזה כדי לחשוף את הלב וריאות. לבחון את אונות הריאה לכל גרורות 27,29.
- בדוק את כל האיברים לחריגות ולהקליט כל שינוי בצבע, גודל, ועקביות. במידת צורך, לחתוך את האיברים עם אזמל לבחון רקמות פנימיות. באופן ספציפי, לבחון את הכבד, כליות, הטחול ומערכת עיכול.
- בדוק את בלוטות הלימפה לגרורות וגדלת 27,29.
- כדי לאסוף את הגידול, לעשות חתכים אגף מעל ומתחת לגידול כך שהעור יכול להיות התרחק מהגוף עם פינצטה. בעוד מחזיק בחוזקה את העור עם פינצטה, השתמש באזמל כדי להסיר את הגידול בזהירות על ידי חיתוך בין הגידול והדרמיס (איור 5).
- מייד למקם את הגידול במכל שכותרת של 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין.
- בהתאם לגודל של הגידול, לאפשר 1-2 ימים (≤ 2 מ"מ, קטן) או 5-6 ימים (> 2 מ"מ, גדול) לתיקון לפני הכנת חלקים לניתוח היסטולוגית (איור 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשל האופי מאוד הרגיש של חולדות כותנה, היכרות עם הנהלים וניצול מותאמים כדי להפחית את הלחץ של בעלי החיים יקל בשימוש בם כמודל חיה פרה-קליני. שימוש בטכניקות טיפול הולמים גם למזער את הסיכון לחוקר.
בעת שימוש בחולדות כותנה זה הכרחי כדי להישאר רגוע. החולדות הן להתרגש מאוד ותנסינה לברוח הכלוב שלהם. שימוש בצינור העשרה וnestlets יהיה למזער ניסיונות בריחה. איור 2 מראה התקנת כלוב אופטימלית כדי לסייע בלכידתו של חולדות כותנה, כולל מיקום של צינור ההעשרה. יתר על כן, עובד בחדר קטן במידת האפשר על מנת לסייע בכיבוש מחודש. אם בריחה מתרחשת, לחכות לבעלי החיים להירגע ולהישאר נייחים, ואז לכסות אותו עם מיכל הלכידה ברור או לכסות עם ידיים בכפפות, נזהר שלא להשתמש בכוח מופרז.
בניגוד לעכבר, יש לו את החולדה הכותנה חוטם מוארך which דורש האף שונה המתאים כדי לספק את גז ההרדמה. איור 3 מתארים חרטום המהונדס כדי להתאים כראוי חולדה כותנה ומקסם את המסירה של isoflurane. באמצעות קרום גומי כהולם עלול לגרום לטראומה לאף של העכברוש.
אם אפשר להשיג חיות שנזרקו (אלה שלא נדרשים על ידי חוקרים אחרים, חולדות כותנה או אחר) לתרגל טכניקות הזרקה לפני שתנסה אותם בחולדות. זה יאפשר לחוקר היכרות עם מחטים וכיצד לטפל בהם בצורה בטוחה. מזרקים אינסולין הציעו לזריקות בחולדות כותנה כמו העור שלהם הוא עבה וקשה בהשוואה לעכבר. עם זאת, מחט גדולה יותר (21 G x 1 ") יכולה לשמש להזרקה של תאים סרטניים כדי למנוע אובדן של כדאיות תא בשל גז תא במהלך הזרקה. יש לפעול לפי אמצעי זהירות, כגון לא recapping מחטים וסילוק נאות למכל חד.
Injection של תאים סרטניים קיימא הוא חשוב להיווצרות גידול נכונה. איור 1 א מציג monolayer בריא של תאי LCRT שיכול להיות מוכן להזרקה לעכברי כותנה. בהשוואה 1B איור מראה תאי LCRT שיש לי כדאיות נמוכה ולא אמור לשמש לזריקות. חשוב לוודא כדאיות תא סרטנית באמצעות שיטה כגון כתמי כחולי Trypan כאשר ספירת תאים לזריקות.
הגידולים שנוצרו מתאי LCRT הם מהירים גובר ולעתים קרובות מרכזי נימקי טופס (איור 4 א). ככזה, היווצרות גידול צריך להיות במעקב צמוד כדי למנוע כיבים (איור 4). אם כיב מתרחש בבעלי החיים צריכים להיות מוקרבים כדי למנוע זיהום ומוות אפשרי מאלח הדם.
ההשפעות של טיפולים אנטי-סרטניים לעתים קרובות בחנו הטובות ביותר באמצעות ניתוח היסטולוגית. זה דורש כריתה של גידול פוסט מורטם. שלמות רקמת גידול שמירה תהיה מילult במדגם שהוא ייצוג מדויק יותר של הגידול in vivo. איור 5 מראה טכניקת כריתה שבו הגידול מופרד בזהירות מרקמות באמצעות אזמל ופינצטה. הסרת הגידול על ידי משיכתו בכוח מהרקמה הסובבת באמצעות פינצטה עלול להיקרע הגידול או לשבש את שלמות רקמת גידול, המשפיע על ניתוח היסטולוגית נכון. המבנה הצפוף וכלי דם מאוד של הגידול, כפי שניתן לראות באיור 6, מנוהל על-ידי טכניקת כריתה זו. זה חשוב בניתוח של טיפולים המשפיעים על כלי דם של גידול, כמו במקרה עם OVS רב.
איור 1:. תמונת מיקרוסקופ שדה הבהיר של תאי LCRT () הפנוטיפ של בריא (~ 90% קיימא) תאי LCRT מוכנים להכנה להזרקה לחולדות כותנה. (ב) פנוטיפ לא רצוי של תאי LCRT לא מתאים להזרקה. תאים מעוגלים מתים או גוסס (מסומן בחץ). תמונות שנתפסו בהגדלה 10X; סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.
איור 2: דוגמא של התקנת כלוב, כדי להקל על לכידתו של חולדות כותנה מיקום אופטימלי של צינור העשרה כנגד הקצה של הכלוב וההכללה של עזרי nestlets בלכידת בעלי חיים..
איור 3:. חרטומו הרדמה המתאים למשלוח של isoflurane לחולדות מורדמים כותנה מיוצר חרטום מתאים חוטם מוארך של חולדה כותנה, כדי להבטיח אספקה מדויקת של גז isoflurane ללא טראומה לאף.
איור 5:. כריתה של גידול LCRT תת-עורי להיסטולוגיה הגידול תת עורי בכנף של חולדה כותנה הוא הסיר בזהירות מהעור באמצעות אזמל כדי לשמור על שלמות רקמת גידול, ובכך לספק ייצוג טוב יותר של ארכיטקטורת גידול לניתוח היסטולוגית.
איור 6:. סעיף רקמה היסטולוגית מגידול LCRT תת עורית המורפולוגיה של רקמת גידול LCRT נבחן באמצעות קטעים מוטבעים פרפין מוכתמים hematoxylin ו eosin (H & E). תמונה נתפסה בהגדלה 20X; סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965-092 | May use any brand |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Can prepare in lab, filter to sterilize | ||
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | May use any brand |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | May use any brand |
| Fetal bovine serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| T-150cm2 tissue culture flask | Fisher Scientific | 14-826-80 | May use any brand |
| 1X TypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| 12-well cell culture plate, flat bottom | Fisher Scientific | 08-772-29 | May use any brand, must be tissue culture treated |
| alamarBlue | Life Technologies | DAL1025 | May use an alternative reagent for determination of cell viability |
| 8640 Teklad 22/5 Rodent diet | Harlan | 8640 | |
| 1/8” corncob rodent bedding | Harlan | 7092 | |
| Nestlets | Ancare | - | Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable |
| 50 mL Conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | May use any brand, must be sterile |
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| 70% Ethanol | Can prepare in lab | ||
| 10 % Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | May use any brand |
| NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) | NAPCO | Model used not currently available | May use any brand |
| Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath | Fisher Scientific | Model used not currently available | May use any brand |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reichert Bright-line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | May use any brand |
| Typhoon Trio BioAnalyzer | GE Healthcare Life Sciences | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader | Tecan | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Allegra 6R benchtop centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| Table Top Anaesthesia machine | VetEquip | Model used not currently available | May use any brand, must be portable |
| Wahl Peanut Mini Clippers | Wahl | May use any brand of small clippers | |
| Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL | BD | 329464 | May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. |
| Cotton swabs | MedPro | 018-425 | May use any brand |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
References
- Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).
- Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).
- Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).
- Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).
- Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
- Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).
- Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
- Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).
- Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).
- Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).
- Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).
- Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).
- Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).
- Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).
- Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).
- Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
- Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).
- Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).
- Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).
- Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).
- Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).
- Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).
- Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).
- Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).
- Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222 (2), 299-309 (1996).
- Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).
- Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).
- Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
- Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369 (1), 131-142 (2007).
- Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).
- Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).
- Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).
