Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vírus Oncolíticos (OV) replicar selectivamente em células tumorais, explorando as diferenças bioquímicas entre células normais e tumorais 1,2. Existem dois tipos de VOs: aqueles que não necessitam de uma mutação para alcançar oncólise selectiva, referido como ocorrendo naturalmente vírus do tipo selvagem e as que devem ser modificadas para alcançar oncólise selectiva. A recolha de mutações dentro de um determinado tipo de tumor que determina a natureza da vantagem de crescimento selectivo sobre as células normais de um OV 2. A segurança e benefício de utilizar VOs foi demonstrada em ensaios clínicos 3-7. Apesar dos avanços no campo da virotherapy oncolytic existem lacunas entre os resultados pré-clínicos e clínicos, o que sugere que os melhores modelos são necessários para avaliar a eficácia antitumoral de VOs.

Herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) é um membro da família Herpesviridae, e Alphaherpesviridae subfamília. BHV-1 initiates bovina complexo de doença respiratória em bovinos, manifestando-se em uma ampla variedade de sintomas semelhante a um resfriado 8,9. BHV-1 liga-se receptores de ligação de entrada e utilizados pelo HSV-1, tais como o sulfato de heparano e Nectin-1 10. No entanto, se liga CD155 no lugar de Nectin-2 10. BHV-1 tem uma gama de hospedeiros muito estreito de tal modo que ele não é capaz de entrar e iniciar a replicação em células de murinos normais e transformadas 3,4,10 eficientemente. Isso faz com que a utilização de modelos murinos convencionais problemático. A capacidade oncolitica do BHV-1 tem sido demonstrada in vitro 11,12. BHV-1 tem sido mostrado para iniciar a replicação e matar células de tumor humano a partir de uma variedade de origens histológicos, incluindo células de cancro da mama e cancro da mama iniciar células 11,12. No entanto, a capacidade antitumoral do BHV-1 deve ser avaliada in vivo no contexto de um hospedeiro imunocompetente.

Adenovirus humano (Ad), para os quaishá 57 sorotipos identificados, mais comumente causa doenças respiratórias em humanos. Vectores Ad Oncolíticos foram avaliados quanto à sua eficácia antitumoral com vários avançar para ensaios clínicos 13-15. Apesar dos dados pré-clínicos promissores, os resultados clínicos têm ficado aquém das expectativas. Modelos de xenoenxerto de tumor humano são tipicamente usadas para estudar a eficácia antitumoral de vectores Ad, embora eles exibem atenua as respostas imunes ao vírus 16,17. Além disso, os modelos de murino singeneicas são não-permissiva para infecção ad, tornando a avaliação de respostas imunitárias do hospedeiro, utilizando estes modelos impraticáveis ​​17,18.

O sistema imunitário do hospedeiro tem sido identificada como o mecanismo pelo qual mais influente VOs provocar a morte das células tumorais 19. Respostas antitumorais entre tornados tolerantes e antigénio associado a um tumor não tornados tolerantes modelos (TAA) diferem entre si e podem ter grande impacto no sucesso da terapia OV. O HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 em 1814 20) 20,21 provocou regressão do tumor em 80% dos murganhos portadores de tumor em um modelo de cancro mamário antigénio Polioma Médio T murinas 22. No entanto, em HER-2 modelos / neu, a eficácia antitumoral do KM100 variou entre 20% a regressão completa em camundongos sing�icos e estase tumor em transgênico, os ratos HER2-tolerantes. Juntos, esses dados destacam a importância de se avaliar plenamente VOs utilizando modelos animais que melhor recapitulam a paisagem imunológico humano para entender completamente o que caracteriza determinar o sucesso terapêutico.

O rato de algodão (Sigmodon hispidus), indígena do Norte e América do Sul, é mais comumente usado como um modelo de infecção pelo vírus sincicial respiratório (como revistas em 5). Ratos do algodão, também são utilizados em-BHV-1 anti pesquisa de vacinação uma vez que recapitulam a patologia associada à doença respiratória bovina complexo 6,23. Além disso, o BHV-1 infecção de ratazanas do algodãoé imunogénica, induzindo mucosa sustentada e respostas imunitárias sistémicas 6,23-25. As linhas de células foram derivadas de fibrossarcoma espontânea e osteosarcomas da glândula mamária (LCRT) e osso (CCRT e VCRT), respectivamente 26. Ratos de algodão têm sido usados ​​para avaliar a eficácia in vivo de vectores Ad oncolíticos como eles são susceptíveis à infecção por Ad e exibem uma patologia semelhante à dos humanos 27-29. A utilização de modelos imunocomprometidos para a avaliação pré-clínica de VOs não são apenas menos indicativo de respostas clínicas para a terapia, mas eles não conseguem ter em conta o papel do sistema imunológico no viroterapia oncolítico 30,31. Portanto, o singeneicos e modelos de ratos tornados tolerantes algodão-tumorais de carcinoma da mama e osteossarcoma são modelos relevantes em que para avaliar a eficácia pré-clínica de VOs, tais como o BHV-1 e Ad que não pode ser estudado usando modelos murinos convencionais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOTA: Os protocolos utilizados foram aprovados pelo nosso Conselho de Ética de Pesquisa animal institucional da Universidade McMaster, de acordo com a Canadian Council on orientações de cuidados Animal. Os experimentos foram realizados nas instalações de McMaster University animal Central.

1. A cultura LCRT Cells

  1. Cultura de células LCRT em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. Manter as células em frascos T-150 de cultura de tecidos a 37 ° C e 5% de CO 2. Células de passagem quando eles formam uma monocamada confluente a 90% (a cada 2-3 dias, a Figura 1).
  2. 1x fosfato de pré-aquecer solução salina tamponada (PBS), 1x tripsina e meio num banho de água a 37 C ° durante 10 min antes da divisão das células.
  3. Aspirar o meio do balão e lavar as células com 5 ml de PBS 1x.
  4. Depois de enxaguar, aspirar PBS e incubaras células com 2 ml de 1x tripsina até células dissociar-se do frasco (~ 2 min).
  5. Ressuspender as células em 8 ml de meio (para um total de suspensão de células 10 mL) e suavemente pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células.
  6. Manter as células em um frasco T-150 semeando 1 ml de suspensão de células para 24 ml de meio (para um total de 25 ml por T-150) e um balão de rocha suavemente de lado a lado. Manter as células a 37 ° C e 5% de CO 2 até separação seguinte.

2. Avaliação de replicação do vírus e citotoxicidade nas células LCRT

  1. Replicação do vírus
    NOTA: as construções de vírus que expressam um marcador fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), sob o controlo de promotores virais endógenos facilitar a visualização da infecção pelo vírus e espalhado utilizando leitores de placas de fluorescência.
    1. Células LCRT semeado em placas de cultura, deixando um poço para contagem. Semear as células de modo a que eles vão ser de 80-90% de confluência no dia seguinte. Usar uma concentração de 10 5 cells / ml (100 ul por poço) para produzir o desejado confluência um dia mais tarde em placas de 96 poços de fundo plano.
    2. No dia seguinte, pré-aquecer 1x PBS, 1x tripsina, meio completo e isento de soro em um banho de água a 37 C ° durante 10 min antes de se iniciar o experimento.
    3. Aspirar o meio da contagem das células bem e lavar com 5 ml de PBS 1x por balançar-o sobre a superfície do poço.
    4. Após lavagem, as células aspirado PBS e incubar com 2 ml de tripsina 1x até células dissociar-se do frasco (~ 2 min).
    5. Ressuspender as células em um volume apropriado de meio completo para se obter uma densidade de células na gama contáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para garantir uma contagem de células preciso, misture bem a suspensão de células antes da inoculação do hemocitômetro por pipetagem cima e para baixo.
    6. Determinar o volume de caldo de vírus necessária para a infecção na desejada multiplicidade de infecção (MOI).
      Necessário Paque Unidades Formadoras (pfu) = número de células plaqueadas * MOI(Ufp / célula)
      Volume de estoque de vírus required = necessária UFP / virus estoque título (ufc / ml)
    7. Prepare inoculo de vírus em meio isento de soro em tubos. Misture bem em vórtice ou pipeta antes de adicionar inóculo para as células.
    8. Infectar as células durante 1 hora a 37 ° C, após o que se aplica uma sobreposição de manutenção de DMEM + FBS a 1%.
    9. Placas de digitalização um e dois dias após a infecção (pi) para visualizar fluorescência da GFP.
  2. Virus Cytotoxicity
    NOTA: Realize o ensaio resazurina citotoxicidade sob condições de pouca luz como o composto é fotossensível. A forma das cavidades contendo só deve ser incluído para corrigir para a fluorescência de fundo.
    1. Prepara-se uma solução a 5% (v / v) de resazurina em PBS 1x. Misture a solução por pipetagem.
    2. Aspirar o meio das células e aplicar a solução de 5% de resazurina. Incluir um médio bem contendo apenas para corrigir a fluorescência de fundo.
    3. Incubar as células durante 30 min a 37 ° C, depoisque ler a fluorescência utilizando um leitor de placas de fluorescência (excitação 530 nm, emissão 595 nm).
    4. Analisar dados em relação aos controles não infectados corrigindo para fluorescência de fundo.

3. Habitação e Manuseio

  1. Habitação e Diet
    1. Ratos Casa de algodão individualmente para diminuir no combate em gaiolas de ratos de policarbonato contendo cama de roedores (1/8 "cama sabugo de milho), uma seção de tubo de PVC não mais de 8 polegadas e nestlets como enriquecimento (Figura 2).
    2. Use um cesto de aço securable para sentar overtop da gaiola e conter alimentos de roedores e uma garrafa de água.
      NOTA: Esta configuração permitirá gaiola para captura segura e fácil de os animais, com a colocação do tubo de enriquecimento contra a extremidade da gaiola ser da maior importância.
  2. Manipulação
    1. Lidar com ratos de algodão na parte da manhã, antes de rodadas por técnicos das instalações dos animais para evitar emocionante-los antesum procedimento.
    2. Durante todos os procedimentos, usar luvas de couro grosso para proteção.
    3. Como os animais permanecem principalmente nos tubos de enriquecimento, utilizá-los para transferir os ratos a uma nova gaiola durante a limpeza de rotina. Como alternativa, abrir a gaiola um pouco para permitir que o manipulador para chegar ao seu lado dentro, o animal pode ser contido por scruffing a pele um pouco acima dos ombros e empurrando para baixo. Cuidados prática para não usar força excessiva quando o animal pode morder a língua.
    4. Seja paciente e use uma mão firme como os animais têm uma forte resposta de fuga ou luta e vai tentar evitar a captura por correr e saltar para fora da gaiola. É importante ressaltar que não lidar com os animais pelo rabo como degloving irá ocorrer.
    5. Armadilha os animais em seus enriquecimentos câmaras de ar sobre manipulação directa. Isso diminui drasticamente os ferimentos e escapar.

4. Capturar e Anestesia

  1. Captura
    1. Usar luvas de couro grosso para proteçãoião positivo durante todos os procedimentos.
    2. Utilizar um grande recipiente de plástico transparente com furos para o ar e uma tampa, uma câmara de indução anestésica suficientemente grande para se encaixar no recipiente e um cone de nariz montado no tubo de saída de gás (Figura 3).
    3. Trabalhar em pares para tornar o processo mais eficiente e para diminuir o tempo de exposição dos animais ao isoflurano, um anestésico por inalação. Certifique-se de um pesquisador é responsável pela abertura e recolocar a tampa de aço sobre a gaiola e a tampa da câmara de indução (manipulador # 1) e seu associado é responsável pela captura do animal no tubo e transporte para a câmara de indução (manipulador # 2).
    4. Coloque a gaiola sobre uma superfície plana e remover a tampa exterior. Levantar o tabuleiro de alimentação de aço ligeiramente e manobrar-se lentamente o tubo de enriquecimento por isso é paralelo com os lados da caixa e contra as costas. Se necessário, utilizar um objecto para manobrar o tubo de enriquecimento sem abrir a gaiola para evitar que o animal se agita (manusearr # 1).
    5. Se o animal torna-se agitado e deixa o tubo, dá tempo suficiente para que o animal relaxar e, mais uma vez se estabelecer no tubo (manipulador # 1).
    6. Lentamente e deliberadamente levantar a aresta da tampa de aço do tubo de enriquecimento, mantendo a outra extremidade em contacto com a gaiola. Faça um espaço grande o suficiente para o recipiente de plástico (manipulador # 2).
    7. Em um movimento rápido e suave, empurre o recipiente de plástico overtop do tubo de enriquecimento. Manter o recipiente de contacto com o lado da gaiola, prendendo o animal no tubo. Realize os passos 4.1.6 e 4.1.7, o mais rapidamente possível (manipulador # 2).
    8. Retire a bandeja de alimentação de aço e dar a tampa do recipiente de plástico para manipulador # 2 (manipulador # 1). Deslize a tampa de plástico entre o lado da gaiola e do recipiente, sendo conscientes de apêndices do animal preso no processo. Não selar o recipiente, pois isso fará com que o próximo passo mais difícil (manipulador # 2).
  2. AnesthesIA
    1. Certifique-se o recipiente permanece fechado e transportar o animal à câmara de indução. Rapidamente colocar o animal na câmara e remover a tampa do recipiente com um movimento fluido (manipulador # 2). Abra e substitua imediatamente a tampa da câmara de indução (manipulador # 1).
    2. Ligue o fluxo de isoflurano para a câmara de indução (5 L / min) e monitorizar o animal quanto a sinais de letargia, altura em que deslizam rapidamente o animal a partir do tubo e o recipiente, tanto a remoção da câmara de indução para facilitar a circulação do gás.
    3. Quando o rato é completamente anestesiados, movê-la para a superfície de trabalho e colocar o nariz e boca para o cone de nariz (Figura 3). O rato é totalmente anestesiado quando ele não responde a uma pitada toe forte.
    4. Coloque vet vaselina pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secura e escoriações. Este é um passo essencial como ratos do algodão têm olhos grandes que podem ser propenso a infecção se ocorrer lesão.
    5. <li> monitorizar cuidadosamente e manter uma taxa de respiração constante e garantir que o nariz do animal permanece no cone do nariz ao longo do procedimento de montagem. Ajustar o caudal de isoflurano apropriadamente. A quantidade de isoflurano necessária para anestesiar cada animal irá variar.
    6. Pós-procedimento, devolver o animal para sua gaiola e garantir que ele recupere a mobilidade total e decúbito esternal.

5. Preparação de Células LCRT para a Formação de Tumores subcutânea

NOTA: Um balão T-150 de LCRT (90% de confluência) rende aproximadamente 2 x 10 7 células. Baseie o número de T-150 frascos necessários sobre o número total de células necessárias. Semente frascos adicionais para assegurar o número total de células necessárias é obtido e para acomodar células perdidas durante a preparação e os necessários para injecções extras. Mantenha as células no gelo sempre que possível para prolongar a viabilidade celular.

  1. Para colher as células, o meio aspirado a partir de um frascod células Lavar com 5 ml de 1x PBS.
  2. Aspirar PBS e incubar as células com 2 ml de 1x tripsina até que as células dissociar-se do frasco (~ 2 min).
  3. Ressuspender as células em 8 ml de meio (para um total de suspensão de células 10 mL) e suavemente pipetar para cima e para baixo para quebrar aglomerados de células. Continuar a colheita de células de frascos adicionais.
  4. Piscina todos suspensões de células em um tubo cônico, cerca de 4 T-150s por tubo de 50 ml.
  5. Centrifugar o tubo a 160 x g durante 10 min a 4 ° C.
  6. Aspirar o meio e ressuspender o sedimento de células no volume apropriado de PBS (10 ml de PBS por T-150) para se obter uma densidade de células na gama contáveis ​​utilizando um hemocitómetro. Para garantir uma contagem de células preciso, misture bem a suspensão de células antes de carregar o hemocitômetro por pipetagem cima e para baixo.
  7. Calcula-se o número total de células:
    Número total de células colhidas = contagem de células (células / ml) x volume de ressuspensão (ml)
  8. Determinaro volume de suspensão de células necessário para todas as injecções. Faça 2-3 doses extras por experimento. Um total de 5 x 10 5 células LCRT injectados subcutaneamente irá formar tumores palpáveis ​​dentro de 3-4 dias.
    Número total de células necessárias = 5 x 10 x 5 células número total de doses
    Suspensão de células volume requerido (ml) = (número total de células necessárias * soma dos volumes de injecção) / (número total de células colhidas)
  9. Pipete o volume pretendido de suspensão de células para um tubo cónico contendo PBS e homogeneizar. Alíquotas individuais injecções (100 ul) em tubos Eppendorf. Manter tubos em gelo durante o procedimento de injeção.

6. Injeções

Observação: executar procedimentos com dois pesquisadores, um para executar as injeções, enquanto os outros monitores taxa de respiração do animal e condição geral e sob anestesia. Use seringas de insulina (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) para todas as injeções e uma nova agulha paracada animal.

  1. As injecções subcutâneas
    1. Capturar e anestesiar o animal (secção 4).
    2. Raspar o local da injecção usando cortadores. Pele de rato Cotton é grosso e requer um aparador afiada para obter uma superfície lisa para injectáveis. Limpar o local de injecção com etanol a 70% usando um cotonete de algodão e permitir que ela se evapore completamente antes de prosseguir.
    3. Seringas de carga (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) com as células por elaboração lenta e progressivamente. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo do êmbolo de pressão até que o líquido está no topo da agulha.
    4. Levantar a pele no local da injecção (referido como pele de acampamento) e inserir a agulha de bisel virado para cima. Certifique-se de que a agulha se move livremente sob a pele para evitar a injeção intramuscular.
    5. Expelir o conteúdo da seringa lentamente e uniformemente. Retirar lado bisel da agulha para baixo.
  2. Injeções intratumoral
    1. Captura de umd anestesiar o animal (secção 4).
    2. Limpar o local de injecção com etanol a 70% usando um cotonete de algodão e permitir que ela se evapore completamente antes de prosseguir.
    3. Seringas de carga (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) com o inóculo do vírus através da elaboração lenta e progressivamente, mantendo a agulha na posição vertical. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo, em seguida, premir o êmbolo até que o líquido está no topo da agulha.
    4. Inserir a agulha lado bisel para cima para dentro do tumor e expelir o conteúdo da seringa de maneira uniforme e lentamente, enquanto move a agulha num padrão de tipo ventilador, retirar parcialmente a agulha antes de cada movimento para evitar laceração do tumor. Retirar lado bisel da agulha para baixo.
      NOTA: Os tumores LCRT subcutâneas são, atingindo aproximadamente 100 mm3 em 5-7 dias de rápido crescimento. Para além disso, centros necróticos e hemorrágicos frequentemente se formam na superfície do tumor no prazo de vários dias e requerem cAmonitorização REFUL (Figura 4).
  3. As injecções intraperitoneais
    1. Capturar e anestesiar o animal (secção 4).
    2. Limpe o local da injecção com 70% de etanol usando cotonetes e deixe-o evaporar completamente antes de prosseguir.
    3. Seringas de carga (29 G x 1/2 ', 0,3 ml) com a droga através da elaboração lenta e progressivamente. Se as bolhas são súbito evidente a seringa com um pouco de força. Uma vez que as bolhas estão no topo, em seguida, premir o êmbolo até que o líquido está no topo da agulha.
    4. Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen. Puxe o êmbolo para garantir que o sangue ou fezes não são aspirados, isso indica a colocação incorreta da agulha. Se isso ocorrer, retire a agulha e preparar uma nova seringa. Quando a agulha é colocada corretamente, expulsar conteúdo da seringa de forma uniforme e lentamente.

7. Tumor Excisão e Necropsia

  1. Reunir e limpar alferramentas l com etanol 70% antes da eutanásia do animal.
  2. Eutanásia o animal pelo método desejado, inalação de CO 2 (2 L / min, durante 5-10 min) é recomendado. Examine o animal para qualquer anormalidade na condição.
  3. Colocar o animal em decúbito dorsal numa prancha de dissecação e limpar o animal com etanol a 70%.
  4. Use uma pinça para levantar a pele na parte inferior do abdômen. Cortar através da pele e do músculo utilizando tesouras e fazer uma incisão média a todo o comprimento do animal (ânus para o queixo).
  5. Cortar a caixa torácica, fazendo dois cortes, uma lateralmente para cima o lado da caixa torácica e um em frente ao esterno para expor o coração e os pulmões. Examine os lobos do pulmão por quaisquer metástases 27,29.
  6. Examine todos os órgãos de anormalidades e registrar quaisquer mudanças na cor, tamanho e consistência. Se necessário, os órgãos incisão com um bisturi para examinar os tecidos internos. Especificamente, examinar o fígado, rins, baço e do trato gastrointestinal.
  7. Inspecione os linfonodos para metástases e alargamento 27,29.
  8. Para recolher o tumor, fazer incisões flanco acima e abaixo do tumor de tal modo que a pele pode ser puxada para fora do corpo, com uma pinça. Enquanto segura firmemente a pele com pinças, usar um bisturi para remover cuidadosamente o tumor por corte entre o tumor e derme (Figura 5).
  9. Colocar imediatamente o tumor em um recipiente rotulado de 10% de formalina tamponada neutra.
  10. Dependendo do tamanho do tumor, permitir 1-2 dias (≤ 2 mm, pequenos) ou 5-6 dias (> 2 mm, grande) para a fixação, antes de se prepararem secções para análise histológica (Figura 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Devido à natureza extremamente excitável de ratos do algodão, sendo familiarizados com e utilizando processos optimizados para reduzir a tensão dos animais vai facilitar a sua utilização como um modelo animal de pré-clínico. O uso de técnicas de manejo adequadas também vai minimizar os riscos para o pesquisador.

Ao usar ratos do algodão é imperativo para manter a calma. Os ratos são altamente excitáveis ​​e tentará escapar de sua gaiola. A utilização de um tubo de enriquecimento e nestlets minimizem tentativas de fuga. A Figura 2 mostra a configuração óptima gaiola para auxiliar na captura de ratos do algodão, incluindo a colocação do tubo de enriquecimento. Além disso, trabalhar em uma pequena sala, se possível, para ajudar na recaptura. Se ocorrer fuga, esperar que o animal a se acalmar e ficar parado, em seguida, cubra-o com o recipiente de captura clara ou cobrir com as mãos enluvadas, tomando cuidado para não usar força excessiva.

Em contraste com um rato, o rato do algodão tem um focinho alongado which requer um nariz diferente encaixe para entregar o gás anestésico. A Figura 3 mostra um cone de nariz projetado para caber corretamente um rato de algodão e maximizar a entrega de isoflurano. Usando uma membrana de borracha como um encaixe pode resultar em trauma para o nariz do rato.

Se possível obter animais de descarte (aqueles que não precisava por outros pesquisadores, ratos de algodão ou outros) para a prática de técnicas de injeção antes de tentar-los sobre os ratos. Isso permitirá que o pesquisador a ganhar familiaridade com agulhas e como lidar com eles de forma segura. Seringas de insulina são sugeridos para injeções em ratos de algodão como sua pele é grossa e dura, em comparação com um mouse. No entanto, uma agulha maior (21 G x 1 ') pode ser usada para a injecção de células tumorais para evitar a perda de viabilidade celular, devido ao corte da célula durante a injecção. Precauções de segurança devem ser seguidas, como não reencapar agulhas e descarte adequado em um recipiente apropriado.

O INJECção de células tumorais viáveis ​​é importante para a formação de tumores adequada. A Figura 1A mostra uma monocamada de células saudáveis ​​LCRT que podem ser preparados para injecção em ratos do algodão. Em comparação Figura 1B mostra células LCRT que têm baixa viabilidade e não devem ser usados ​​para preparações injectáveis. É importante para verificar a viabilidade de células tumorais utilizando um método tal como a coloração com azul de Tripano, quando a contagem de células para injecções.

Os tumores formados a partir de células LCRT são de crescimento rápido e centros necróticos formam frequentemente (Figura 4A). Como tal, a formação do tumor deve ser monitorado cuidadosamente para evitar a ulceração (Figura 4B). Se ocorrer ulceração o animal deve ser sacrificado para evitar a infecção e possível morte por sepse.

Os efeitos dos tratamentos anti-tumorais são muitas vezes melhor examinadas através de análise histológica. Isso requer a excisão do tumor pós mortem. Manter a integridade do tecido do tumor vai result de uma amostra que é uma representação mais precisa do tumor in vivo. A Figura 5 mostra uma técnica através da qual a excisão do tumor é cuidadosamente separado do tecido circundante, utilizando um bisturi e pinça. Removendo o tumor, puxando-o pela força do tecido circundante, usando uma pinça pode romper o tumor ou interromper a integridade do tecido tumoral, impactando análise histológica adequada. A estrutura densa e altamente vascularizada do tumor, como pode ser visto na Figura 6, é mantida por esta técnica de excisão. Isto é importante na análise dos tratamentos que afectam a vasculatura tumoral, como é o caso com muitas VOs.

Figura 1
Figura 1:. Imagem de microscopia de campo claro de Células LCRT (A) Fenótipo de saudável (~ 90%), as células viáveis ​​LCRT prontos para a preparação para a injeção em ratos de algodão. (B) fenótipo indesejável de células LCRT não apto para injeção. Células arredondadas estão mortos ou morrendo (indicado por uma seta). As imagens foram capturadas em aumento de 10x; barra de escala = 1 mm.

Figura 2
Figura 2: Exemplo de configuração gaiola para facilitar a captura de ratos do algodão colocação óptima de tubo de enriquecimento contra a extremidade da gaiola e a inclusão de auxiliares de nestlets na captura de animais..

Figura 3
Figura 3:. Anesthesia cone do nariz apropriado para entrega de isoflurano em ratos de algodão anestesiados Fabricado nariz cone encaixa focinho alongado de rato do algodão para garantir a entrega correta de gás isoflurano sem trauma no nariz.

"Figura Figura 4:. O tecido necrosado em um tumor LCRT subcutânea (A) Os estágios iniciais da necrose do tecido tumoral. O animal deve ser cuidadosamente monitorado para evitar a progressão para (B) ulceração totalmente aberta. O animal deve ser sacrificados se ulcera tumorais como infecções e sépsis pode resultar.

Figura 5
Figura 5:. A excisão de um tumor subcutâneo LCRT para histologia O tumor subcutânea no flanco de um rato do algodão é cuidadosamente removida da pele usando um bisturi para manter a integridade do tecido do tumor, proporcionando assim uma melhor representação da arquitectura do tumor para análise histológica.

Figura 6 Figura 6:. Corte de tecido histológico de um tumor subcutâneo LCRT A morfologia do tecido tumoral LCRT examinada usando seções embebidos em parafina corados com HE (H & E). A imagem foi capturada com ampliação de 20x; barra de escala = 1 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7, (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254, (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78, (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63, (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11, (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8, (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26, (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66, (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20, (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88, (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14, (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62, (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12, (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110, (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30, (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74, (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76, (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12, (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78, (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17, (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222, (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13, (1), 123 (2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16, (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369, (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22, (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19, (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).
Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter