Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

التعامل مع الفأر القطن في الدراسات لتقييم ما قبل السريرية من حال الورم الفيروسات

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

الفيروسات حال الورم (OV) تكرار انتقائي في الخلايا السرطانية من خلال استغلال الاختلافات البيوكيميائية بين الخلايا الطبيعية والسرطانية 1،2. هناك نوعان من OVS: تلك التي لا تحتاج إلى طفرة لتحقيق انحلال الورم انتقائية، ويشار إلى الفيروسات التي تحدث بشكل طبيعي من النوع البري وتلك التي يجب أن هندستها لتحقيق انحلال الورم انتقائي. جمع الطفرات ضمن نوع الورم نظرا يحدد طبيعة ميزة النمو انتقائية على الخلايا الطبيعية لOV 2. وقد تجلى سلامة والاستفادة من استخدام OVS في التجارب السريرية 3-7. وعلى الرغم من التقدم في مجال علاج بالفيروسات حال الورم توجد الفجوات بين النتائج ما قبل السريرية والسريرية، مما يوحي بأن هناك حاجة إلى نماذج أفضل لتقييم فعالية مضادة للورم من OVS.

البقري نوع هربس 1 (BHV-1) هو عضو في عائلة فيروسات هربسية، وAlphaherpesviridae فصيلة. BHV-1 initiآتش البقري مجمع أمراض الجهاز التنفسي في الماشية، ويظهر في مجموعة متنوعة واسعة من أعراض تشبه نزلة برد 8،9. BHV-1 يربط مرفق ودخول مستقبلات يستخدمها HSV-1، مثل كبريتات heparan وnectin-1 10. ومع ذلك، فإنه يربط CD155 في مكان nectin-2 10. BHV-1 لديها مجموعة والمضيف ضيق جدا بحيث أنه غير قادر على الدخول بكفاءة وبدء النسخ المتماثل في الخلايا الطبيعية وتحويلها الفئران 3،4،10. وهذا يجعل من استخدام نماذج الفئران التقليدية إشكالية. وقد تجلى القدرة حال الورم من BHV-1 في المختبر 11،12. وقد تبين BHV-1 لبدء النسخ المتماثل في وقتل الخلايا السرطانية البشرية من مجموعة متنوعة من أصول النسيجية، بما في ذلك خلايا سرطان الثدي وسرطان الثدي الشروع في الخلايا 11،12. ومع ذلك، يجب تقييم القدرة انتيتومور من BHV-1 في الجسم الحي في سياق مضيف مناعيا.

اتش الإنسان (الإعلان)، والتيهناك 57 الأنماط المصلية التي تم تحديدها، تتسبب الأكثر شيوعا أمراض الجهاز التنفسي لدى البشر. تم تقييم ناقلات الإعلان حال الورم لفعالية مضادة للورم مع العديد التقدم في التجارب السريرية 13-15. وعلى الرغم من بيانات ما قبل السريرية واعدة، وتراجعت النتائج السريرية قصيرة من التوقعات. وعادة ما يتم استخدام نماذج طعم أجنبي الورم البشري لدراسة فعالية مضادة للورم من ناقلات الإعلان، على الرغم من أنها تظهر الموهن الاستجابات المناعية للفيروس 16،17. وعلاوة على ذلك، ونماذج الفئران مسانج غير قابلة للمتساهلة للإصابة الإعلان، مما يجعل تقييم المضيف الاستجابات المناعية باستخدام هذه النماذج غير عملي 17،18.

تم التعرف على الجهاز المناعي المضيف كآلية الأكثر تأثيرا التي OVS يثير ورم الخلايا الموت 19. ردود انتيتومور بين tolerized وغير tolerized مستضد المرتبطة الورم (TAA) نماذج تختلف ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على نجاح العلاج OV. وHSV-1 OV KM100 (ICP0 n212VP16 في عام 1814 20) 20،21 أثار الورم الانحدار في 80٪ من الفئران الحاملة للورم في الفئران التورام الأوسط T مستضد نموذج سرطان الثدي 22. ومع ذلك، في HER-2 نماذج / NEU، وفعالية مضادة للورم من KM100 تنوعت بين الانحدار الكامل 20٪ في الفئران مسانج وورم في ركود المعدلة وراثيا والفئران HER2 tolerized. معا هذه البيانات تبرز أهمية تقييم كامل OVS باستخدام نماذج حيوانية أن ألخص أفضل المشهد المناعة البشري أن نفهم تماما ما هي الميزات تحديد النجاح العلاجي.

يتم استخدام الفئران القطن (Sigmodon hispidus)، السكان الأصليين لأمريكا الشمالية والجنوبية، والأكثر شيوعا كنموذج للعدوى فيروس الجهاز التنفسي المخلوي (كما استعرض في 5). وتستخدم الفئران القطن أيضا في مجال البحوث لمكافحة BHV-1 التطعيم لأنها تلخيص علم الأمراض المرتبطة بأمراض الجهاز التنفسي البقري معقدة 6،23. وعلاوة على ذلك، BHV-1 إصابة الفئران القطنيولد مناعة، الأمر الذي أدى المخاطية المستدام والاستجابات المناعية الجهازية 6،23-25. وقد استمدت خطوط الخلايا من يفية عفوية وosteosarcomas من الغدة الثديية (LCRT) والعظام (CCRT وVCRT)، على التوالي 26. وقد استخدمت الفئران القطن لتقييم فعالية في الجسم الحي من ناقلات الإعلان حال الورم كما هي عرضة للإصابة الإعلان ويحمل علم أمراض مماثلة على البشر 27-29. استخدام نماذج المناعة لتقييم ما قبل السريرية من OVS ليسوا سوى أقل يدل على الردود السريرية للعلاج لكنها لا تأخذ في الاعتبار دور الجهاز المناعي في علاج بالفيروسات حال الورم 30،31. ولذلك، فإن مسانج ونماذج الفئران القطن tolerized ورم سرطان الثدي وعظمية والنماذج ذات الصلة التي لتقييم فعالية ما قبل السريرية من OVS، مثل BHV-1 والإعلان التي لا يمكن دراستها باستخدام نماذج الفئران التقليدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على البروتوكولات التي تستخدمها المؤسسات الحيوانية البحوث أخلاقيات مجلسنا في جامعة ماكماستر وفقا لمبادئ توجيهية المجلس الكندي للرعاية الحيوان: ملاحظة. وأجريت التجارب في مرفق المركزي جامعة ماكماستر الحيوانية.

1. خلايا التثقيف LCRT

  1. خلايا الثقافة LCRT في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco لفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. الحفاظ على الخلايا في T-150 قوارير زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. خلايا مرور عندما تشكيل أحادي الطبقة 90٪ متكدسة (كل 2-3 أيام، الشكل 1).
  2. قبل دافئ 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 1X التربسين والمتوسطة في 37 ° C حمام الماء لمدة 10 دقيقة قبل تقسيم الخلايا.
  3. نضح المتوسطة من القارورة وشطف الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  4. بعد الشطف، ونضح PBS واحتضانالخلايا مع 2 مل من 1X التربسين حتى تنفصل الخلايا من القارورة (~ 2 دقيقة).
  5. Resuspend الخلايا في 8 مل المتوسطة (أي ما مجموعه 10 مل تعليق خلية) وبلطف ماصة صعودا وهبوطا لتفريق كتل من الخلايا.
  6. الحفاظ على الخلايا في قارورة T-150 من قبل البذر 1 مل تعليق خلية في 24 مل المتوسطة (أي ما مجموعه 25 مل لكل T-150) وقارورة صخرة بلطف من جانب إلى آخر. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى انقسام المقبل.

2. تقييم تكاثر الفيروس والسمسة في خلايا LCRT

  1. فيروس النسخ المتماثل
    ملاحظة: يبني الفيروسات التعبير عن علامة فلوري، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، تحت سيطرة المروجين الفيروسي الذاتية تسهيل التصور من عدوى فيروس وانتشرت باستخدام القراء لوحة مضان.
    1. خلايا LCRT البذور في لوحات الثقافة، وترك جيدا لفرز الأصوات. خلايا البذور بحيث أنها سوف تكون 80-90٪ متكدسة في وقت لاحق يوم واحد. استخدام تركيز 10 5 سلليرة سورية / مل (100 ميكرولتر لكل بئر) لإنتاج confluency المطلوب في وقت لاحق يوم واحد في 96-جيدا لوحات مسطحة القاع.
    2. في اليوم التالي، قبل دافئ برنامج تلفزيوني 1X، 1X التربسين والمتوسطة كاملة وخالية من المصل في 37 ° C حمام الماء لمدة 10 دقيقة قبل بدء التجربة.
    3. نضح المتوسطة من عد جيدا وشطف الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X التي كتبها هزاز ذلك على سطح البئر.
    4. بعد الشطف، نضح PBS واحتضان الخلايا مع 2 مل من 1X التربسين حتى تنفصل الخلايا من القارورة (~ 2 دقيقة).
    5. resuspend الخلايا في حجم مناسب من المتوسط ​​كاملة لتسفر عن كثافة الخلايا في نطاق معدود باستخدام عدادة الكريات. لضمان وجود عدد خلايا دقيقة، وتخلط جيدا تعليق الخلية قبل تلقيح عدادة الكريات من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    6. تحديد حجم المخزون فيروس المطلوبة للعدوى في تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية).
      مطلوب Paque تشكيل وحدات (PFU) = عدد الخلايا مطلي * MOI(PFU / خلية)
      حجم المخزون فيروس المطلوبة = المطلوبة PFU / فيروس الأسهم عيار (PFU / مل)
    7. إعداد اللقاح فيروس في مصل خالية المتوسطة في أنابيب. مزيج دقيق من قبل vortexing أو pipetting لقيحة قبل إضافة إلى الخلايا.
    8. تصيب الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وبعد ذلك تطبيق تراكب صيانة DMEM + 1٪ FBS.
    9. لوحات مسح واحد ويومين العدوى بعد (باي) لتصور GFP مضان.
  2. فيروس السمسة
    ملاحظة: إجراء الفحص ريسازورين سمية الخلايا تحت ظروف الإضاءة المنخفضة مثل المركب هو حساس. وسيط تحتوي جيدا فقط ينبغي أن تدرج لتصحيح مضان الخلفية.
    1. إعداد 5٪ (ت / ت) حل ريسازورين في برنامج تلفزيوني 1X. مزيج الحل من قبل pipetting.
    2. نضح المتوسطة من الخلايا وتطبيق حل ريسازورين 5٪. تشمل المتوسطة التي تحتوي على بئر فقط لتصحيح مضان الخلفية.
    3. احتضان خلايا لمدة 30 دقيقة في 37 ° C، وبعدفيما يلي نصه مضان باستخدام قارئ لوحة مضان (530 الإثارة نانومتر، وانبعاث 595 نانومتر).
    4. تحليل البيانات المتعلقة الضوابط غير المصابة تصحيح لمضان الخلفية.

3. الإسكان والمناولة

  1. الإسكان والنظام الغذائي
    1. الفئران القطن منزل على حدة لتقليل في القتال في أقفاص الجرذ البولي تحتوي على الفراش القوارض (1/8 "الفراش كوز الذرة)، وقسم من PVC أنابيب لم يعد من 8 بوصات وnestlets كما تخصيب (الشكل 2).
    2. استخدام سلة الصلب القابلة للتأمين على الجلوس فاق من القفص واحتواء القوارض الطعام وزجاجة المياه.
      ملاحظة: هذا الإعداد قفص تسمح لالتقاط آمنة وسهلة للحيوانات، مع وضع أنبوب تخصيب ضد نهاية الوجود قفص ذات أهمية قصوى.
  2. معالجة
    1. التعامل مع الفئران القطن في الصباح، قبل جولات من قبل الفنيين منشأة الحيوانية لتجنب إثارة لهم قبلإجراء.
    2. خلال جميع الإجراءات، وارتداء قفازات جلدية سميكة للحماية.
    3. كما تبقى الحيوانات في المقام الأول في أنابيب تخصيب، واستخدامها لنقل الفئران في قفص جديد خلال التنظيف الروتيني. بدلا من ذلك، فتح القفص قليلا للسماح للمعالج لتصل إلى أيديهم في، الحيوان ومن ثم يمكن ضبط النفس من قبل scruffing الجلد فقط فوق الكتفين، ودفع إلى أسفل. الرعاية ممارسة بعدم استخدام القوة المفرطة كما الحيوان قد يعض لغتهم.
    4. التحلي بالصبر واستخدام يد ثابتة كما الحيوانات لديها قوية طيران أو المعركة الاستجابة وسوف محاولة لتجنب القبض عن طريق تشغيل والقفز من القفص. الأهم من ذلك، لا معالجة الحيوانات من ذيله كما لحب سيحدث.
    5. مصيدة الحيوانات في التخصيب الأنابيب على مدى التعامل المباشر. هذا يقلل بشكل كبير من الإصابات والهرب.

4. التقاط والتخدير

  1. أسر
    1. ارتداء قفازات جلدية سميكة لحمايةايون خلال جميع الإجراءات.
    2. استخدام وعاء من البلاستيك واضحة كبيرة مع فتحات للهواء والغطاء، لمحة تعريفية غرفة التخدير كبيرة بما يكفي لتناسب الحاوية ومخروط الأنف تركيبها على خرطوم انتاج الغاز (الشكل 3).
    3. العمل في أزواج لجعل الإجراء أكثر كفاءة وتقليل زمن التعرض للحيوانات لالأيزوفلورين، وهو مخدر الاستنشاق. التأكد من باحث واحد مسؤول عن افتتاح واستبدال غطاء من الفولاذ على القفص وغطاء غرفة الاستقراء (معالج 1 #) والزميلة التي هي المسؤولة عن القبض على الحيوان في أنبوب ونقلها إلى غرفة الاستقراء (معالج # 2).
    4. وضع القفص على سطح مستو وإزالة الغطاء الخارجي. رفع علبة تغذية الصلب قليلا والمناورة ببطء أنبوب التخصيب لذلك هو مواز مع الجانبين من القفص وضد الظهر. إذا لزم الأمر، استخدام كائن للمناورة أنبوب التخصيب دون فتح القفص لتجنب اثارة الحيوان (مقبضص # 1).
    5. إذا أصبح الحيوان المهتاج ويترك الأنبوب، إتاحة الوقت الكافي للحيوان للاسترخاء ويستقر مرة أخرى في الأنبوب (معالج 1 #).
    6. ببطء وروية رفع حافة أبعد الغطاء الصلب من الأنبوب تخصيب، والحفاظ على الطرف الآخر في اتصال مع القفص. جعل مساحة كبيرة بما يكفي للحاوية بلاستيكية (معالج 2 #).
    7. في واحدة على نحو سلس، الحركة السريعة، ودفع عاء من البلاستيك فاق من الأنبوب تخصيب اليورانيوم. البقاء على اتصال من الحاوية مع الجانب من القفص، محاصرة الحيوان في الأنبوب. تنفيذ الخطوات 4.1.6 و4.1.7 في أسرع وقت ممكن (معالج 2 #).
    8. إزالة علبة تغذية الصلب وإعطاء غطاء حاوية من البلاستيك لمعالج # 2 (معالج 1 #). حرك غطاء من البلاستيك بين الجانب من القفص والحاويات، لأنها تدرك من الزوائد الحيوان المحاصرين في هذه العملية. لا ختم الحاويات حيث سيؤدي ذلك إلى اتخاذ الخطوة المقبلة أكثر صعوبة (معالج رقم 2).
  2. AnesthesIA
    1. تأكد من تبقى حاوية مغلقة ونقل الحيوان إلى غرفة الاستقراء. وضع بسرعة الحيوان في غرفة وإزالة غطاء حاوية واحدة في حركة السوائل (معالج 2 #). فتح واستبدل على الفور غطاء غرفة الاستقراء (معالج رقم 1).
    2. بدوره على تدفق الأيزوفلورين إلى غرفة الاستقراء (5 لتر / دقيقة) ومراقبة الحيوانات لعلامات الخمول، وعند هذه النقطة بسرعة الانزلاق الحيوان من الأنبوب والحاويات، وإزالة كلا من غرفة التعريفي لتسهيل تداول الغاز.
    3. عندما يتم تخدير الفئران تماما، نقله إلى سطح العمل ووضع الأنف والفم في مخروط الأنف (الشكل 3). الفئران هو تخدير تماما عندما يكون غير قادر على الاستجابة إلى أخمص القدمين قرصة قوية.
    4. وضع التعليم والتدريب المهني الفازلين مرهم للعين على عيون الحيوان لمنع جفاف وسحجات. هذا هو خطوة أساسية عن الجرذان القطن لها عيون الكبيرة التي يمكن أن تكون عرضة للإصابة إذا حدثت الإصابة.
    5. <لى> مراقبة بعناية والحفاظ على معدل التنفس المستمر وضمان أن أنف الحيوان يبقى في مخروط الأنف المناسب في جميع أنحاء الداخلي. ضبط معدل تدفق الأيزوفلورين بشكل مناسب. كمية الأيزوفلورين حاجة إلى تخدير سوف تختلف كل حيوان.
    6. ما بعد الإجراء، يعود الحيوان إلى قفصه وضمان يستعيد التنقل الكامل والاستلقاء القصية.

5. إعداد الخلايا LCRT لورم تحت الجلد تشكيل

ملاحظة: واحد T-150 قارورة من LCRT (90٪ confluency) ينتج ما يقرب من 2 × 10 7 الخلايا. قاعدة عدد T-150 قوارير المطلوبة على العدد الكلي للخلايا اللازمة. البذور قوارير اضافية لضمان العدد الكلي للخلايا المطلوبة يتم الحصول عليها واستيعاب الخلايا المفقودة أثناء إعداد وتلك اللازمة لحقن إضافية. حفاظ على الخلايا على الجليد كلما أمكن ذلك لإطالة بقاء الخلية.

  1. حصاد الخلايا والمتوسطة نضح من قارورةخلايا شطف د مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  2. نضح PBS واحتضان الخلايا مع 2 مل من 1X التربسين حتى تنفصل الخلايا من القارورة (~ 2 دقيقة).
  3. Resuspend الخلايا في 8 مل المتوسطة (أي ما مجموعه 10 مل تعليق خلية) وبلطف ماصة صعودا وهبوطا لتفريق كتل من الخلايا. مواصلة حصاد الخلايا من قوارير إضافية.
  4. تجميع كل تعليق خلية في أنبوب مخروطي الشكل واحد، ما يقرب من 4 T-150S لكل 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 160 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. نضح المتوسطة و resuspend بيليه خلية في حجم مناسب من برنامج تلفزيوني (10 مل PBS في T-150) لانتاج كثافة الخلية في نطاق معدود باستخدام عدادة الكريات. لضمان وجود عدد خلايا دقيقة، وتخلط جيدا تعليق الخلية قبل تحميل عدادة الكريات من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
  7. حساب العدد الكلي للخلايا:
    إجمالي عدد الخلايا تحصد = عدد الخلايا (خلية / مل) س إعادة تعليق الحجم (مل)
  8. حددحجم التعليق الخلية المطلوبة لجميع الحقن. جعل 2-3 جرعات اضافية في التجربة. وهناك ما مجموعه 5 × 10 5 خلايا LCRT حقن تحت الجلد تشكل الأورام واضح في غضون 3-4 أيام.
    إجمالي عدد الخلايا المطلوبة = 5 × 10 5 خلايا × عدد الكلي للجرعات
    تعليق خلية الحجم المطلوب (مل) = (مجموع الخلايا المطلوبة * مجموع كميات حقن) / (العدد الكلي للخلايا المقطوع)
  9. الماصة للحجم المطلوب من تعليق الخلية في أنبوب مخروطي الشكل تحتوي على برنامج تلفزيوني وتخلط جيدا. حقن قسامة الفردية (100 ميكرولتر) في أنابيب إيبندورف. الحفاظ على أنابيب على الجليد أثناء إجراء الحقن.

6. الحقن

ملاحظة: تنفيذ الإجراءات مع اثنين من الباحثين، واحدة لأداء الحقن في حين أن المراقبين الآخرين معدل التنفس الحيوان والحالة العامة في حين تحت التخدير. استخدام المحاقن الأنسولين (29 G س 1/2 '، 0.3 مل) لجميع الحقن وإبرة جديدة لكل حيوان.

  1. حقن تحت الجلد
    1. التقاط وتخدير الحيوان (القسم 4).
    2. يحلق موقع الحقن باستخدام كليبرز. الفراء الفئران القطن سميكا ويتطلب الانتهازي حاد للحصول على سطح أملس لحقن. تنظيف موقع الحقن مع 70٪ من الإيثانول باستخدام قطعة من القطن والسماح لها تتبخر تماما قبل المتابعة.
    3. المحاقن الحمل (29 G س 1/2 "، 0.3 مل) مع الخلايا عن طريق وضع ببطء ولكن بثبات. إذا فقاعات نفض الغبار واضحا الحقنة مع بعض القوة. مرة واحدة فقاعات في بكبسة كبار المكبس حتى السائل هو في الجزء العلوي من الإبرة.
    4. رفع الجلد في موقع الحقن (ويشار إلى خيام الجلد) وإدراج الجانب شطبة إبرة يصل. تأكد من أن الإبرة تتحرك بحرية تحت الجلد لتجنب حقن العضل.
    5. طرد محتويات الحقنة بالتساوي وببطء. سحب الجانب شطبة إبرة أسفل.
  2. حقن Intratumoral
    1. التقاطد تخدير الحيوان (القسم 4).
    2. تنظيف موقع الحقن مع 70٪ من الإيثانول باستخدام قطعة من القطن والسماح لها تتبخر تماما قبل المتابعة.
    3. المحاقن الحمل (29 G س 1/2 '، 0.3 مل) مع اللقاح الفيروس عن طريق وضع ببطء ولكن بثبات في حين عقد الإبرة في وضع مستقيم. إذا فقاعات نفض الغبار واضحا الحقنة مع بعض القوة. مرة واحدة فقاعات في بكبسة العلوي ثم الغطاس حتى السائل هو في الجزء العلوي من الإبرة.
    4. إدراج الجانب شطبة إبرة يصل الى الورم وطرد محتويات الحقنة بالتساوي وببطء، بينما تتحرك الإبرة في نمط يشبه المروحة، سحب جزئيا الإبرة قبل كل حركة لمنع تمزق للورم. سحب الجانب شطبة إبرة أسفل.
      ملاحظة: الأورام LCRT تحت الجلد هي، ليصل إلى حوالي 100 مم 3 في 5-7 أيام سريعة النمو. وعلاوة على ذلك، ومراكز نخرية النزفية وغالبا ما تشكل على سطح الورم في غضون عدة أيام ويتطلب كاليفورنيامراقبة reful (الشكل 4).
  3. الحقن داخل الصفاق
    1. التقاط وتخدير الحيوان (القسم 4).
    2. تنظيف موقع الحقن مع 70٪ من الإيثانول باستخدام قطعة قطن والسماح لها تتبخر تماما قبل المتابعة.
    3. المحاقن الحمل (29 G س 1/2 '، 0.3 مل) مع المخدرات عن طريق رسم ببطء ولكن بثبات. إذا فقاعات نفض الغبار واضحا الحقنة مع بعض القوة. مرة واحدة فقاعات في بكبسة العلوي ثم الغطاس حتى السائل هو في الجزء العلوي من الإبرة.
    4. ادخال الإبرة في الربع السفلي الأيمن من البطن. سحب على المكبس لضمان أن الدم أو البراز لا يستنشق، وهذا يدل على وضع غير صحيح من الإبرة. إذا حدث هذا، سحب الإبرة وإعداد حقنة جديدة. عندما يتم وضع الإبرة بشكل صحيح، وطرد محتويات الحقنة بالتساوي وببطء.

7. ورم الختان والتشريح

  1. جمع وتنظيف آلأدوات لتر مع 70٪ من الإيثانول قبل القتل الرحيم للحيوان.
  2. الموت ببطء الحيوان من خلال طريقة المطلوب، ويوصى CO 2 الاستنشاق (2 لتر / دقيقة لمدة 5-10 دقيقة). فحص الحيوان لأي شذوذ في حالة الجسم.
  3. وضع الحيوان في الاستلقاء على ظهري مجلس تشريح وتنظيف الحيوان مع الايثانول 70٪.
  4. استخدام ملاقط لرفع الجلد في أسفل البطن. قطع طريق الجلد والعضلات باستخدام مقص وجعل شق وسطي يمتد على طول الحيوان (فتحة الشرج إلى الذقن).
  5. قطع القفص الصدري من خلال جعل اثنين من التخفيضات، واحد أفقيا حتى من جانب القفص الصدري واحدة عبر القص لفضح القلب والرئتين. دراسة فصوص الرئة لأي الانبثاث 27،29.
  6. فحص جميع الأجهزة للشذوذ وتسجيل أي تغييرات في اللون والحجم، والاتساق. إذا لزم الأمر، شق الأجهزة مع مشرط لفحص الأنسجة الداخلية. على وجه التحديد، ودراسة الكبد والكلى والطحال والجهاز الهضمي.
  7. تفقد الغدد الليمفاوية لالانبثاث والتوسيع 27،29.
  8. لجمع الورم، وجعل شقوق الجناح فوق وتحت الورم بحيث الجلد يمكن أن يتم سحبها بعيدا عن الجسم مع ملاقط. في حين عقد بحزم الجلد مع ملاقط، واستخدام مشرط لإزالة بعناية الورم عن طريق قطع بين الورم والأدمة (الشكل 5).
  9. وضع على الفور الورم في وعاء وصفت من 10٪ من الفورمالين مخزنة محايد.
  10. اعتمادا على حجم الورم، السماح 1-2 أيام (≤ 2 مم، صغيرة) أو 5-6 أيام (> 2 مم، كبير) لتحديد قبل إعداد أقسام للتحليل النسيجي (الشكل 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ونظرا لطبيعة منفعل للغاية من الفئران القطن، ويجري على دراية والاستفادة من إجراءات الأمثل للحد من وطأة هذه الحيوانات سوف سهولة في استخدامها كنموذج حيوان ما قبل السريرية. واستخدام التقنيات السليمة للتعامل معها تقليل خطر أيضا للباحث.

عند استخدام الفئران القطن لا بد من الهدوء. الفئران هي منفعل للغاية وسوف تحاول الهرب قفص بهم. استخدام أنبوب التخصيب وnestlets سيقلل محاولات الهروب الشكل 2 يوضح الأمثل الإعداد قفص للمساعدة في القبض على الفئران القطن، بما في ذلك وضع أنبوب تخصيب اليورانيوم. وعلاوة على ذلك، والعمل في غرفة صغيرة إن أمكن للمساعدة في استعادة. إذا حدث هروب، انتظر الحيوانية لتهدئة والبقاء ثابتة، ثم تغطية ذلك مع القبض على حاوية واضحة أو تغطية يديه مع القفاز، والحرص على عدم استخدام القوة المفرطة.

على النقيض من الماوس، والفئران القطن لديه الخطم ممدود ثhich يتطلب الأنف مختلف المناسب لتوصيل الغاز مخدر الشكل 3 يصور مخروط الأنف هندستها لتناسب بشكل صحيح جرذ القطن وتعظيم تسليم الأيزوفلورين. باستخدام الغشاء المطاطي الذي من المناسب قد يؤدي إلى الصدمة إلى الأنف من الفئران.

إذا أمكن الحصول على الحيوانات التخلص منها (تلك التي لا يحتاج إليها باحثون آخرون، الفئران القطن أو غير ذلك) لممارسة تقنيات الحقن قبل محاولة منهم على الفئران. وهذا سوف يسمح للباحث للحصول الألفة مع الإبر وكيفية التعامل معها بأمان. واقترح الحقن لحقن الأنسولين في الفئران القطن كما بشرتهم سميكا وصعبة بالمقارنة مع الماوس. ومع ذلك، إبرة أكبر (21 G × 1 ') يمكن أن تستخدم لحقن الخلايا السرطانية لتجنب فقدان بقاء الخلية بسبب القص الخلية أثناء الحقن. وينبغي اتباع احتياطات السلامة، مثل عدم إعادة السد الإبر والتخلص السليم في وعاء الحادة.

وinjecنشوئها من الخلايا السرطانية قابلة للحياة مهم لتشكيل الورم السليم. ويبين الشكل 1A أحادي الطبقة صحية للخلايا LCRT التي يمكن أن تكون على استعداد لحقن الفئران القطن. في المقارنة يبين الشكل 1B خلايا LCRT التي لها قابلية منخفضة، وينبغي ألا تستخدم لحقن. فمن المهم للتحقق من الورم بقاء الخلية باستخدام طريقة مثل التريبان تلطيخ الأزرق عند عد الخلايا لحقن.

الأورام التي تشكلت من خلايا LCRT هي سريعة النمو ومراكز نخرية غالبا ما تشكل (الشكل 4A). على هذا النحو، ينبغي رصد تشكيل الورم بعناية لتجنب تقرح (الشكل 4B). في حال حدوث تقرح يجب التضحية الحيوان لتجنب العدوى واحتمال الوفاة من الإنتان.

وغالبا ما أفضل فحص آثار العلاجات المضادة للورم عن طريق التحليل النسيجي. وهذا يتطلب استئصال ورم تشريح الجثة. والحفاظ على وحدة نسيج الورم الدقةULT في عينة الذي هو تمثيل أكثر دقة من الورم في الجسم الحي. الشكل 5 يظهر أسلوب الاستئصال التي يتم من خلالها فصل الورم بعناية من الأنسجة المحيطة باستخدام مشرط وملاقط. إزالة الورم عن طريق سحبها بالقوة من الأنسجة المحيطة بها باستخدام الملقط قد تمزق الورم أو تعطيل سلامة أنسجة الورم، مما يؤثر التحليل النسيجي الصحيح. بنية كثيفة وأوعية دموية للغاية من الورم، كما رأينا في الشكل (6)، والتي تحتفظ بها هذه التقنية الختان. وهذا أمر مهم في تحليل العلاجات التي تؤثر ورم الأوعية الدموية، كما هو الحال مع العديد من OVS.

الشكل (1)
الشكل 1: مشرق الميدان صورة مجهرية من خلايا LCRT (A) من النمط الظاهري صحية (~ 90٪ قابلة للحياة) خلايا LCRT جاهزة للإعداد للحقن في الفئران القطن. (ب) النمط الظاهري غير المرغوب فيها للخلايا LCRT لا يصلح للحقن. خلايا مدورة هي ميتة أو تموت (المشار إليها سهم). تم القبض على الصور في 10X التكبير. شريط نطاق = 1 مم.

الشكل 2
الشكل 2: مثال على إعداد قفص لسهولة القبض على الفئران القطن التنسيب الأمثل لأنبوب التخصيب ضد نهاية القفص وإدراج nestlets يساعد في القبض على الحيوان.

الشكل (3)
الرقم 3: مخروط الأنف تخدير المناسب لتسليم الأيزوفلورين للفئران القطن تخدير المصنعة مخروط الأنف يناسب الخطم ممدود من الفئران القطن لضمان تسليم دقيقة من الغاز الأيزوفلورين دون الصدمة إلى الأنف.

الرقم 4: الأنسجة نخرية على وجود ورم تحت الجلد LCRT (A) في المراحل المبكرة من نخر من نسيج الورم. ينبغي رصد الحيوان بعناية لتجنب تطور الى (B) تقرح مفتوحة بالكامل. يجب التضحية الحيوان إذا تتقرح الورم كما العدوى والإنتان يمكن أن يؤدي.

الرقم 5
الشكل 5: استئصال ورم LCRT تحت الجلد لإزالة الأنسجة الورم تحت الجلد على الجناح من الفئران القطن بعناية من الجلد باستخدام مشرط للحفاظ على سلامة أنسجة الورم، وبالتالي توفير تمثيل أفضل للعمارة الورم للتحليل النسيجي.

الشكل (6) الشكل 6: قسم الأنسجة النسيجي من ورم تحت الجلد LCRT فحص مورفولوجية LCRT نسيج الورم باستخدام المقاطع جزءا لا يتجزأ من البارافين ملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E). تم القبض الصورة في 20X التكبير. شريط نطاق = 1 مم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7, (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254, (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78, (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63, (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11, (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8, (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26, (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66, (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20, (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88, (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14, (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62, (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12, (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110, (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30, (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74, (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76, (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12, (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78, (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17, (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222, (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13, (1), 123 (2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16, (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369, (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22, (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19, (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).
التعامل مع الفأر القطن في الدراسات لتقييم ما قبل السريرية من حال الورم الفيروسات
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter