Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Håndtering af bomuld Rat i Undersøgelser for præklinisk evaluering af onkolytiske Vira

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Onkolytisk vira (OV) selektivt replikerer i tumorceller ved at udnytte biokemiske forskelle mellem normale og tumorceller 1,2. Der er to typer af OvS: dem, der ikke kræver en mutation til at opnå selektiv onkolyse, benævnt naturligt forekommende vildtype-virus, og de, der skal manipuleres til at opnå selektiv onkolyse. Indsamlingen af mutationer inden for en given tumortype bestemmer arten af den selektive vækst fordel over normale celler til en OV 2. Sikkerheden og fordel ved at bruge OVS er påvist i kliniske forsøg 3-7. Trods fremskridt inden for onkolytiske virotherapy der findes mellemrum mellem præ-kliniske og kliniske resultater, tyder på, at der er behov for bedre modeller til at evaluere antitumor effekt af OvS.

Bovin herpesvirus type 1 (BHV-1) er et medlem af Herpesviridae-familien, og Alphaherpesviridae underfamilien. BHV-1 initiates bovint respiratorisk sygdom kompleks i kvæg, manifesterer sig i en lang række symptomer, der ligner en forkølet 8,9. BHV-1 binder vedhæftede og indrejse receptorer, der anvendes af HSV-1, såsom heparansulfat og nectin-1 10. Det binder imidlertid CD155 i stedet for nectin-2 10. BHV-1 har en meget smal værtsområde, således at det er i stand til effektivt at komme ind og initiere replikation i normale og transformerede murine celler 3,4,10. Dette gør anvendelsen af ​​konventionelle murine modeller problematisk. Onkolytisk kapacitet BHV-1 er blevet påvist in vitro 11,12. BHV-1 er blevet vist at initiere replikation i og dræbe humane tumorceller fra en række histologiske oprindelse, herunder brystcancerceller og brystkræft indledning celler 11,12. Dog skal antitumor kapacitet BHV-1 vurderes in vivo i forbindelse med en immunkompetent vært.

Humant adenovirus (Ad), hvorDer er 57 identificerede serotyper, mest almindeligt forårsager respiratorisk sygdom hos mennesker. Onkolytisk Ad vektorer er blevet evalueret for deres antitumorvirkning med flere fremrykkende i kliniske forsøg 13-15. Trods lovende prækliniske data har kliniske resultater levet op til forventningerne. Human tumor xenograftmodeller typisk anvendt til at undersøge antitumorvirkningen af Ad-vektorer, selvom de udviser svækket immunrespons til virus 16,17. Endvidere syngene murine modeller er ikke-permissiv for Ad-infektion, hvorved evalueringen af værten immunresponser ved hjælp af disse modeller upraktiske 17,18.

Værten immunsystem er blevet identificeret som den mest indflydelsesrige mekanisme, hvormed OVS fremkalde tumorcelledød 19. Antitumor reaktioner mellem tolerante og ikke-tolerante tumor-associeret antigen (TAA) modeller er forskellige og kan i høj grad påvirke succes OV terapi. HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 i 1814 20) 20,21 fremkaldte tumorregression i 80% af tumorbærende mus i en murin Polyoma Middle T antigen brystcancer model 22. Men i HER-2 / neu modeller antitumorvirkningen af ​​KM100 varierede mellem 20% fuldstændig regression i syngene mus og tumorstase i transgene HER2-tolerante mus. Sammen disse data fremhæver betydningen af ​​fuldt ud at evaluere OVS hjælp dyremodeller, der bedst rekapitulere menneskelige immunsystem landskab til fuldt ud at forstå, hvilke funktioner bestemme terapeutisk succes.

Bomulden rotte (Sigmodon hispidus), indfødte til Nord- og Sydamerika, er mest almindeligt anvendt som en model af respiratorisk syncytialvirus infektion (som revideret i 5). Bomuldsrotter bruges også i anti-BHV-1 vaccination forskning som de rekapitulere patologien forbundet med bovint respiratorisk sygdom kompleks 6,23. Endvidere BHV-1-infektion af bomuldsrotterer immunogen, inducere langvarig mucosal og systemiske immunresponser 6,23-25. Cellelinjer er udledt fra spontane fibrosarkom og osteosarkomer af mælkekirtlen (LCRT) og knogle (CCRT og VCRT), henholdsvis 26. Bomuldsrotter er blevet anvendt til at vurdere in vivo-effektivitet af onkolytiske Ad-vektorer, som de er modtagelige for Ad-infektion og udviser lignende patologi for mennesker 27-29. Anvendelsen af immunkompromitterede modeller for præklinisk evaluering af OvS er ikke kun mindre indikerer klinisk respons på behandlingen, men de undlader at tage hensyn til den rolle af immunsystemet i onkolytisk virotherapy 30,31. Derfor syngene og tumor-tolerante bomuld rottemodeller af brystcarcinom og osteosarkom er relevante modeller til at vurdere den præ-kliniske effekt af OvS, såsom BHV-1 og Ad, som ikke kan studeres ved anvendelse af traditionelle murine modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS! Protokoller, der anvendes er blevet godkendt af vores institutionelle Animal Research Ethics Board ved McMaster University i henhold til canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer. Eksperimenter blev udført ved McMaster University Central Animal Facility.

1. Dyrkning LCRT Cells

  1. Kultur LCRT celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Oprethold celler i T-150 vævskulturkolber ved 37 ° C og 5% CO2. Passage celler, når de danner en 90% konfluent monolag (hver 2-3 dage, figur 1).
  2. Pre-varm 1x phosphatpufret saltvand (PBS), 1x trypsin og medium i et 37 ° C vandbad i 10 min forud for at opdele cellerne.
  3. Aspirer medium fra kolben og skyl celler med 5 ml 1X PBS.
  4. Efter skylning aspireres PBS og inkuberesceller med 2 ml 1x trypsin indtil celler dissociere fra kolben (~ 2 min).
  5. Resuspender celler i 8 ml medium (i alt 10 ml cellesuspension) og forsigtigt pipetteres op og ned for at opbryde klumper af celler.
  6. Oprethold celler i en T-150 kolbe ved podning 1 ml cellesuspension i 24 ml medium (i alt 25 ml per T-150) og rock kolbe forsigtigt fra side til side. Oprethold celler ved 37 ° C og 5% CO 2, indtil næste split.

2. Vurdering virusreplikation og cytotoksicitet i LCRT Cells

  1. Virusreplikation
    BEMÆRK: Virus konstrukter udtrykker et fluorescerende mærke, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) under kontrol af endogene viruspromotorer lette visualisering af virus infektion og spredes under anvendelse af fluorescens pladelæsere.
    1. Seed LCRT celler i kultur plader, der forlader et godt til tælling. Seed celler, således at de vil være 80-90% sammenflydende en dag senere. Brug en koncentration på 10 5 cells / ml (100 pi per brønd) for at frembringe den ønskede sammenflydning én dag senere i 96-brønds fladbundede plader.
    2. Den næste dag, pre-varm 1x PBS, 1x trypsin, fuldstændige og serum-frit medium i et 37 ° C vandbad i 10 min før start af forsøget.
    3. Aspirer medium fra optællingen godt og skyl celler med 5 ml 1X PBS ved at vippe den over overfladen af ​​brønden.
    4. Efter skylning aspireres PBS og inkuberes celler med 2 ml 1x trypsin indtil celler dissociere fra kolben (~ 2 min).
    5. Resuspender cellerne i det passende volumen af ​​komplet medium til opnåelse af en celledensitet inden for tælleligt interval ved hjælp af et hæmocytometer. For at sikre en nøjagtig celletælling, blandes grundigt cellesuspensionen forud for inokulering af hæmocytometer ved pipettering op og ned.
    6. Bestem mængden af ​​virus stock kræves for infektion ved den ønskede infektionsmultiplicitet (MOI).
      Nødvendig Paque Forming Units (PFU) = antal belagte celler * MOI(Pfu / celle)
      Volumen af ​​virus bestand kræves = krævede pfu / virus lager titer (PFU / ml)
    7. Forbered virus inokulum i serum-frit medium i rør. Bland grundigt ved vortex eller pipettering før tilsætning inokulum til cellerne.
    8. Inficere celler i 1 time ved 37 ° C, hvorefter der anvender en vedligeholdelse overlay DMEM + 1% FBS.
    9. Scan plader en og to dage efter infektion (pi) for at visualisere GFP-fluorescens.
  2. Virus cytotoksicitet
    BEMÆRK: Udfør resazurin cytotoksicitetsassayet under dårlige lysforhold som forbindelsen er lysfølsomme. Kun en brønd indeholdende medium bør medtages for at korrigere for baggrundsfluorescens.
    1. Der fremstilles en 5% (v / v) opløsning af resazurin i 1x PBS. Bland opløsningen ved pipettering.
    2. Aspirer medium fra celler og anvende 5% resazurin løsning. Omfatter en brønd indeholdende medium alene for at korrigere for baggrundsfluorescens.
    3. Cellerne inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C, eftersom læse fluorescens under anvendelse af en fluorescenspladelæser (excitation 530 nm, emission 595 nm).
    4. Analyser af data i forhold til ikke-inficerede kontroller korrigere for baggrundsfluorescens.

3. Boliger og Håndtering

  1. Bolig og Kost
    1. Hus bomuldsrotter individuelt at falde i-kampene i polycarbonat rotte bure indeholdende gnaver sengetøj (1/8 "majskolbe strøelse), en del af PVC-rør ikke længere end 8 inches og nestlets som berigelse (figur 2).
    2. Brug en fastgøres stålkurv at sidde ovenpå af buret og indeholder gnaver fødevarer og en vandflaske.
      BEMÆRK: Denne bur setup vil give mulighed for sikker og let opsamling af dyrene, med placeringen af ​​berigelse røret mod enden af ​​buret er af allerstørste betydning.
  2. Håndtering
    1. Håndtag bomuldsrotter om morgenen, før runder af dyr facilitet teknikere for at undgå spændende dem føren procedure.
    2. Under alle procedurer, slid tykke læderhandsker til beskyttelse.
    3. Da dyrene primært forbliver i rørene berigelse, så brug dem til at overføre rotterne i en ny bur under rutinemæssig rengøring. Alternativt kan du åbne buret lidt for at gøre det muligt for føreren at nå deres hånd i, kan dyret derefter fastholdes ved scruffing huden lige over skuldrene og trykke ned. Praksis sørge for ikke at bruge overdreven kraft, da dyret kan bide deres tunge.
    4. Vær tålmodig og bruge en rolig hånd som dyrene har en stærk fly-eller-kamp respons og vil forsøge at undgå indfangning ved at køre og hoppe ud af buret. Vigtigere er det, ikke håndterer dyr i halen som degloving vil forekomme.
    5. Trap dyrene i deres berigelser rør end direkte håndtering. Dette drastisk nedsætter skader og undslippe.

4. Capture og Anæstesi

  1. Capture
    1. Bær tykke læderhandsker til Protection under alle procedurer.
    2. Brug en stor klar plastbeholder med huller for luft og et låg, et bedøvelsesmiddel induktion kammer stor nok til at passe beholderen og en næse kegle monteret på gas output slange (figur 3).
    3. Arbejde i par for at gøre proceduren mere effektiv og for at mindske eksponeringstid på dyrene til isofluran, en indånding bedøvelsesmiddel. Kontroller en forsker er ansvarlig for åbning og erstatte låget stål på buret og låget af induktion kammer (handler 1 #) og deres associerede er ansvarlig for opsamling af dyret i røret og transport til induktion kammer (handler # 2).
    4. Placer buret på en flad overflade og fjern den ydre låg. Løft bakken stål foder lidt og langsomt manøvrere røret berigelse, så det er parallelt med siderne af buret og mod bagsiden. Brug om nødvendigt et objekt til at manøvrere slangen berigelse uden at åbne buret for at undgå omrøring af dyret (håndtagr # 1).
    5. Hvis dyret bliver ophidsede og forlader røret, tilstrækkelig tid til dyret at slappe af og igen slår sig ned i røret (handleren 1 #).
    6. Langsomt og bevidst løfte kanten af ​​stål cover længst fra røret berigelse, holde den anden ende i kontakt med bur. Lav en plads stor nok til den plastbeholder (handleren 2 #).
    7. I en glat, hurtig bevægelse, skubbe plastikbeholder ovenpå af røret berigelse. Oprethold kontakt af beholderen med den side af buret, fange dyret i røret. Udfør trin 4.1.6 og 4.1.7 så hurtigt som muligt (handler 2 #).
    8. Fjern bakken stålet og give plastikbeholder låg til handleren # 2 (handler 1 #). Skub plastlåg mellem den side af buret og beholderen, være opmærksom på fanget dyrets vedhæng i processen. Du må ikke forsegle beholderen, da dette vil gøre det næste skridt vanskeligere (handler # 2).
  2. AnesthesIA
    1. Sørg for, at beholderen forbliver lukket og transportere dyret til induktion kammer. Hurtigt sende dyret i kammeret, og fjern beholderen låg i en flydende bevægelse (handleren 2 #). Åben og straks erstatte induktion kammer låg (handler # 1).
    2. Tænd strømmen af ​​isofluran til induktion kammer (5 L / min) og overvåge dyret for tegn på sløvhed, på hvilket tidspunkt hurtigt glide dyret fra røret og beholderen, fjerne både induktion kammer for at lette gascirkulation.
    3. Når rotten er fuldt bedøvet, flytte den til arbejde overflade og lægge næse og mund i næsen kegle (Figur 3). Rotten er fuldt bedøvet, når det ikke reagerer på en kraftig tå knivspids.
    4. Placer dyrlæge vaseline oftalmologiske salve på dyrets øjne til at forebygge tørhed og hudafskrabninger. Dette er et vigtigt skridt, da bomuld rotter har store øjne, der kan være udsat for infektion, hvis skaden opstår.
    5. <li> overvåge forsigtigt og opretholde en konstant respirationsfrekvens og sikre, at dyrets næse forbliver i næsekeglen montering under hele proceduren. Hastigheden af ​​isofluran passende. Mængden af ​​isofluran kræves for at bedøve hvert dyr vil variere.
    6. Post-procedure, sende dyret tilbage til sit bur og sikre, at det genvinder fuld mobilitet og brystleje.

5. Fremstilling af LCRT Celler til subkutan tumordannelse

BEMÆRK: En T-150 kolbe LCRT (90% konfluens) giver ca. 2 x 10 7 celler. Basere antallet af T-150 kolber kræves på det totale antal celler, der er nødvendige. Seed ekstra kolber for at sikre det samlede antal celler, der kræves er opnået, og for at imødekomme celler tabt under forberedelse og dem, der kræves for ekstra injektioner. Hold celler på is når det er muligt at forlænge cellelevedygtighed.

  1. For at høste celler, aspireres medium fra kolben enD Skyl celler med 5 ml 1x PBS.
  2. Aspirer PBS og inkuberes celler med 2 ml 1x trypsin indtil celler dissociere fra kolben (~ 2 min).
  3. Resuspender celler i 8 ml medium (i alt 10 ml cellesuspension) og forsigtigt pipetteres op og ned for at opbryde klumper af celler. Fortsæt med at høste celler fra flere kolber.
  4. Pool hele cellesuspensioner i en konisk rør, ca. 4 T-150'erne per 50 ml konisk rør.
  5. Centrifuger røret ved 160 x g i 10 minutter ved 4 ° C.
  6. Aspirer medium og resuspender cellepelleten i passende volumen af ​​PBS (10 ml PBS per T-150) til opnåelse af en celledensitet inden for tælleligt interval ved hjælp af et hæmocytometer. For at sikre en nøjagtig celletælling, blandes grundigt cellesuspensionen forud for lastning af hæmocytometer ved pipettering op og ned.
  7. Beregn det samlede antal celler:
    Totale antal celler høstet = blodlegemer (celler / ml) x resuspension volumen (ml)
  8. Bestemvolumen cellesuspension kræves for alle injektioner. Gør 2-3 ekstra doser pr eksperiment. I alt 5 x 10 5 LCRT celler injiceret subkutant vil danne palpable tumorer inden for 3-4 dage.
    Totale antal celler, der kræves = 5 x 10 5 celler x samlede antal doser
    Volume cellesuspension påkrævet (ml) = (totale celler kræves * summen af ​​injektionsvolumener) / (totale antal celler høstet)
  9. Pipet den nødvendige mængde cellesuspension i en konisk rør indeholdende PBS og blandes. Alikvote individuelle injektioner (100 pi) i Eppendorf rør. Vedligehold rør på is under injektion procedure.

6. Injektioner

BEMÆRK: Udfør procedurer med to forskere, til at udføre de injektioner, mens de andre skærme dyrets respirationshastighed og generelle tilstand, mens under anæstesi. Udnytte insulin sprøjter (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) for alle injektioner og en ny nål tilhvert dyr.

  1. Subkutane injektioner
    1. Optag og bedøver dyret (afsnit 4).
    2. Barber injektionsstedet hjælp klippere. Bomuld rotte pels er tyk og kræver en skarp trimmer for at få en glat overflade til injektioner. Rens injektionsstedet med 70% ethanol ved hjælp af en vatpind og lad det fordampe helt, før du fortsætter.
    3. Load sprøjter (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med cellerne ved udarbejdelsen langsomt og støt. Hvis bobler er indlysende svirp sprøjten med en vis styrke. Når boblerne er øverst skubbe stemplet indtil væsken er på toppen af ​​nålen.
    4. Løft huden på injektionsstedet (kaldet hud udspiling) og indfør nålen facet opad. Sørg for, at nålen bevæger sig frit under huden for at undgå at injicere intramuskulært.
    5. Udstøde indholdet af sprøjten jævnt og langsomt. Træk nålen facet nedad.
  2. Intratumorale injektioner
    1. Capture end bedøver dyret (afsnit 4).
    2. Rens injektionsstedet med 70% ethanol ved hjælp af en vatpind og lad det fordampe helt, før du fortsætter.
    3. Load sprøjter (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med virus inokulum ved at udarbejde langsomt og støt, mens du holder nålen i lodret position. Hvis bobler er indlysende svirp sprøjten med en vis styrke. Når boblerne er øverst tryk derefter stemplet, indtil væsken er på toppen af ​​nålen.
    4. Sæt nåleaffasningen opad ind i tumoren og uddrive indholdet af sprøjten jævnt og langsomt, mens bevæge nålen i et vifteformet mønster, delvis tilbagetrækning af nålen før hver bevægelse for at forhindre sønderrivning af tumoren. Træk nålen facet nedad.
      BEMÆRK: Subkutan LCRT tumorer er hurtigt voksende og nåede ca. 100 mm 3 i 5-7 dage. Endvidere nekrotiske og hæmoragiske centre ofte dannes på overfladen af ​​tumoren inden for flere dage og kræver caReful overvågning (figur 4).
  3. Intraperitoneale injektioner
    1. Optag og bedøver dyret (afsnit 4).
    2. Rens injektionsstedet med 70% ethanol ved hjælp af vatpinde og lad det fordampe helt, før du fortsætter.
    3. Load sprøjter (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med lægemidlet ved at udarbejde langsomt og støt. Hvis bobler er indlysende svirp sprøjten med en vis styrke. Når boblerne er øverst tryk derefter stemplet, indtil væsken er på toppen af ​​nålen.
    4. Stik nålen ind i den højre nedre kvadrant af maven. Træk tilbage i stemplet for at sikre, at blod eller afføring ikke opsuges, angiver, at det forkert placering af nålen. Hvis det sker, trækker kanylen og forberede en ny sprøjte. Når nålen er korrekt placeret, uddrive indholdet i sprøjten jævnt og langsomt.

7. tumorexcision og nekropsi

  1. Saml og rengør all værktøjer med 70% ethanol før aflivning af dyret.
  2. Aflive dyret ved den ønskede metode CO 2 inhalation (2 L / min til 5-10 min) anbefales. Undersøg dyret for eventuelle afvigelser i huld.
  3. Placer dyret liggende på ryggen på en dissektion bord og rengør dyret med 70% ethanol.
  4. Brug en pincet til at løfte huden på maven. Skær gennem huden og musklen med en saks og gøre en medial indsnit kører længden af ​​dyret (anus til hage).
  5. Skær brystkassen ved at to snit, en sideværts op på siden af ​​brystkassen og én på tværs af brystbenet for at blotlægge hjertet og lungerne. Undersøg kamre af lungerne for eventuelle metastaser 27,29.
  6. Undersøg alle organer til abnormiteter og registrere enhver ændring i farve, størrelse og konsistens. Hvis det er nødvendigt, incise organerne med en skalpel til at undersøge de interne væv. Specifikt undersøge lever, nyrer, milt og mavetarmkanal.
  7. Undersøg lymfeknuder for metastaser og udvidelsen 27,29.
  8. At indsamle tumor, gør flank indsnit over og under tumoren, således at huden kan trækkes væk fra kroppen med en pincet. Mens fast holder huden med en pincet, så brug en skalpel til forsigtigt at fjerne tumoren ved at skære mellem tumor og dermis (figur 5).
  9. Umiddelbart placere tumor i en mærket beholder med 10% neutral bufret formalin.
  10. Afhængig af størrelsen af tumoren, tillader 1-2 dage (≤ 2 mm, mindre) eller 5-6 dage (> 2 mm, stor) til fastgørelse før fremstilling sektioner til histologisk analyse (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På grund af den ekstremt overgearet karakter bomuld rotter, at de kender til og anvendelse af fremgangsmåder, der er optimeret til at reducere stress af dyrene vil aftage i deres anvendelse som et præklinisk dyremodel. Anvendelse af korrekt håndtering teknikker vil også minimere risikoen for forskeren.

Når du bruger bomuld rotter er det bydende nødvendigt at bevare roen. Rotterne er meget nervøse og vil forsøge at undslippe deres bur. Anvendelse af en berigelse rør og nestlets minimerer flugtforsøg. Figur 2 viser optimal bur setup for at hjælpe med indfangning af bomuld rotter, herunder placering af røret berigelse. Desuden arbejder i et lille rum, hvis muligt at støtte i genbeskatning. Hvis flugt sker, vente for dyret at falde til ro og forblive stationær, så dækker det med den klare capture beholder eller dække med behandskede hænder, og pas på ikke at bruge for mange kræfter.

I modsætning til en mus, cotton rat har en aflang snude which kræver en anden næse montering at levere den bedøvende gas. Figur 3 viser en næse kegle manipuleret til korrekt at passe en bomuld rotte og maksimere leveringen af isofluran. Ved hjælp af en gummimembran, som en fitting kan resultere i traumer til næsen af ​​rotten.

Hvis det er muligt få udsmid dyr (dem, der ikke brug for andre forskere, bomuld rotter eller andet) til at praktisere injektionsteknik inden du forsøger dem på rotterne. Dette vil gøre det muligt for forskeren at få kendskab til nåle og hvordan man sikkert håndterer dem. Insulinsprøjter er foreslået til injektionsvæsker i bomuldsrotter som deres hud er tyk og hårde i sammenligning med en mus. Imidlertid kan en større nål (21 G x 1 ") anvendes til injektion af tumorceller for at undgå tab af cellelevedygtighed grund celle klipning under indsprøjtning. Sikkerhedsforanstaltninger bør følges, som ikke slidbanepålægning nåle og korrekt bortskaffelse i en affaldsbeholder.

Den injection af levedygtige tumorceller er vigtigt for korrekt tumordannelse. Figur 1A viser et sundt monolag af LCRT celler, som kan fremstilles til injektion i bomuldsrotter. I sammenligning Figur 1B viser LCRT celler, som har lav levedygtighed og ikke bør anvendes til injektion. Det er vigtigt at kontrollere tumor cellelevedygtighed under anvendelse af en fremgangsmåde, såsom Trypan blåfarvning, når tælle celler til injektioner.

Tumorerne dannes fra LCRT celler er hurtigt voksende og nekrotiske centre danner ofte (figur 4A). Som sådan bør tumordannelse overvåges omhyggeligt for at undgå sårdannelse (figur 4B). Hvis ulceration opstår dyret skal ofres for at undgå infektion og mulig død fra sepsis.

Virkningerne af anti-tumor-behandlinger er ofte bedst undersøgt gennem histologisk analyse. Dette kræver excision af tumoren efter slagtning. Fastholdelse tumorvæv integritet vil resULT i en prøve, der er en mere nøjagtig repræsentation af tumoren in vivo. Figur 5 viser en excision teknik, ved hvilken tumoren er omhyggeligt adskilt fra omgivende væv ved hjælp af en skalpel og pincetter. Fjernelse af tumor ved at trække den med magt fra det omgivende væv med en pincet kan sprænges tumoren eller forstyrre tumorvæv integritet, påvirker ordentlig histologisk analyse. Den tætte og stærkt vaskulariserede struktur af tumoren, som det ses i figur 6, opretholdes ved denne excision teknik. Dette er vigtigt i forbindelse med analyse af behandlinger, som påvirker tumorvaskulatur, som det er tilfældet med mange OvS.

Figur 1
Figur 1:. Bright-field mikroskopi billede af LCRT Cells (A) fænotype af sunde (~ 90% levedygtige) LCRT celler klar til forberedelse til injektion i bomuldsrotter. (B) Uønsket fænotype af LCRT celler ikke egnet til injektion. Afrundede celler er døde eller døende (angivet med en pil). Billeder blev taget til fange ved 10X forstørrelse; skala bar = 1 mm.

Figur 2
Figur 2: Eksempel på bur setup for at lette indfangning af bomuld rotter Optimal placering af berigelse rør mod enden af buret og inddragelse af nestlets hjælpemidler i dyr fange..

Figur 3
Figur 3:. Anæstesi næse kegle montering til levering af isofluran til bedøvede bomuldsrotter Fremstillet næse kegle passer langstrakt snude bomuld rotte for at sikre præcis levering af isofluran gas uden traumer til næsen.

"Figur Figur 4:. Nekrotisk væv på en subkutan LCRT tumor (A) tidlige stadier af nekrose af tumorvæv. Dyret bør overvåges nøje for at undgå progression til (B) helt åben ulceration. Dyret skal ofres, hvis tumor ulcerates som infektion og sepsis kan resultere.

Figur 5
Figur 5:. Excision af en subkutan LCRT tumor til histologi Den subkutane tumor på flanken af en bomuld rotte fjernes omhyggeligt fra huden ved hjælp af en skalpel for at opretholde tumorvæv integritet, hvilket giver en bedre repræsentation af tumor arkitektur for histologisk analyse.

Figur 6 Figur 6:. Histologisk vævssnit fra en subkutan LCRT tumor morfologi LCRT tumorvæv undersøges ved anvendelse af paraffin-indlejrede snit farvet med hematoxylin og eosin (H & E). Billedet blev taget ved 20X forstørrelse; skala bar = 1 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7, (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254, (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78, (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63, (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11, (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8, (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26, (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66, (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20, (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88, (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14, (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62, (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12, (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110, (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30, (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74, (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76, (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12, (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78, (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17, (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222, (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13, (1), 123 (2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16, (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369, (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22, (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19, (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).
Håndtering af bomuld Rat i Undersøgelser for præklinisk evaluering af onkolytiske Vira
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter