Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Het hanteren van de Cotton Rat in Studies voor de Pre-klinische evaluatie van Oncolytic Virussen

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Oncolytische virus (OV) selectief repliceren in tumorcellen door gebruik biochemische verschillen tussen normale en tumorcellen 1,2. Er zijn twee soorten OVS; die geen mutatie vereisen selectieve oncolyse bereiken, genoemd natuurlijk voorkomende wildtype virussen en die welke moeten worden gemanipuleerd om selectieve oncolyse bereiken. De collectie van mutaties binnen een bepaald tumortype bepaalt de aard van de selectieve groei voordeel boven normale cellen voor OV 2. De veiligheid en voordeel van OVS is aangetoond in klinische proeven 3-7. Ondanks vooruitgang op het gebied van oncolytische virotherapy bestaan ​​spleten tussen preklinische en klinische resultaten suggereren dat betere modellen nodig zijn om de antitumor werkzaamheid van OVS evalueren.

Boviene herpesvirus type 1 (BHV-1) is een lid van de familie Herpesviridae en Alphaherpesviridae onderfamilie. BHV-1 initiates runder respiratoire ziekte bij runderen complex, manifesteren in een grote verscheidenheid van symptomen die lijken verkouden 8,9. BHV-1 bindt hechting en binnenkomst receptoren door HSV-1, zoals heparan sulfaat en nectin-1 10. Echter, het bindt CD155 in de plaats van nectin-2 10. BHV-1 is een zeer smalle gastheerbereik zodanig dat het niet efficiënt voeren en replicatie initiëren in normale en getransformeerde muizencellen 3,4,10. Dit maakt het gebruik van conventionele muizenmodellen problematisch. De oncolytische vermogen van BHV-1 is aangetoond in vitro 11,12. BHV-1 is aangetoond dat replicatie in te leiden en te doden humane tumorcellen van verschillende histologische oorsprongen, zoals borstkankercellen en borstkanker initiërende cellen 11,12. Echter, de antitumor capaciteit van BHV-1 in vivo worden beoordeeld in het kader van een immunocompetente gastheer.

Humaan adenovirus (Ad), waarvoorzijn er 57 geïdentificeerd serotypen, meestal veroorzaakt ziekte van de luchtwegen bij de mens. Oncolytisch Ad vectoren zijn geëvalueerd op hun antitumoreffectiviteit met diverse oprukkende in klinische studies 13-15. Ondanks de veelbelovende pre-klinische gegevens, hebben klinische resultaten de verwachtingen niet ingelost. Humane tumor xenograft modellen worden gewoonlijk gebruikt om de antitumor werkzaamheid van Ad vectoren bestuderen, hoewel ze vertonen verzwakte immuunrespons op het virus 16,17. Bovendien syngene muismodellen zijn niet tolerant Ad infectie, wat het beoordelen van immuunreacties van de gastheer met deze modellen onpraktisch 17,18.

De gastheer immuunsysteem is geïdentificeerd als de meest invloedrijke mechanisme waarmee OVS opwekken tumorceldood 19. Antitumor-responsen tussen tolerant en niet- tolerant tumor- geassocieerde antigen (TAA) modellen verschillen en een grote invloed heeft het succes van OV therapie. De HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 in 1814 20) 20,21 opgewekt tumorregressie in 80% van tumordragende muizen in een muizen Polyoma Midden T antigen borstcarcinoom model 22. In HER-2 / neu-modellen, de antitumor werkzaamheid van KM100 varieerde tussen 20% volledige regressie in syngene muizen tumor stasis in transgene, HER2-tolerant muizen. Samen vormen deze gegevens benadrukken het belang van de volledige evaluatie van OVS gebruik van dierlijke modellen die het beste samen te vatten het menselijk immuunsysteem landschap om volledig te begrijpen welke functies bepalen therapeutisch succes.

Het katoen rat (Sigmodon hispidus), inheems in Noord-en Zuid-Amerika, wordt het meest gebruikt als een model van respiratoir syncytieel virus infectie (zoals beoordeeld in 5). Cotton ratten worden ook gebruikt in anti-BHV-1 vaccinonderzoek zij recapituleren de pathologie geassocieerd met bovine respiratoire aandoeningen complex 6,23. Bovendien BHV-1 infectie van katoenrattenimmunogeen induceren duurzame mucosale en systemische immuunresponsen 6,23-25. Cellijnen werden afgeleid van spontane fibrosarcoma en osteosarcoom van de borstklier (LCRT) en bot (CCRT en VCRT), respectievelijk 26. Cotton ratten zijn gebruikt om de in vivo effectiviteit van oncolytische Ad vectoren evalueren zij gevoelig Ad infectie en vertonen soortgelijke pathologie mens 27-29. Het gebruik van immuun modellen voor de pre-klinische evaluatie van OVS zijn niet alleen minder indicatief voor klinische respons op de behandeling, maar ze geen rekening met de rol van het immuunsysteem bij oncolytische virotherapy 30,31. Daarom is de syngene en tumor tolerant katoen ratmodellen mammacarcinoom en osteosarcoom relevant modellen om de preklinische effectiviteit van OVS, zoals BHV-1 en Ad die niet kunnen worden onderzocht met conventionele muizenmodellen evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OPMERKING: De gebruikte protocollen zijn door onze institutionele Animal Research Ethics van Commissarissen goedgekeurd bij McMaster University volgens de Canadese Raad over Animal Care richtlijnen. Experimenten werden uitgevoerd aan de McMaster University Central Animal Facility.

1. Het kweken LCRT Cellen

  1. Cultuur LCRT cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Handhaaf cellen in T-150 weefselcultuur kolven bij 37 ° C en 5% CO2. Passage cellen, indien zij een 90% confluente monolaag (elke 2-3 dagen, figuur 1).
  2. Voorverwarmen 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 1x trypsine en medium in een 37 ° C waterbad gedurende 10 min voor het splitsen van de cellen.
  3. Zuig medium uit de kolf en spoel cellen met 5 ml 1x PBS.
  4. Na spoelen, zuigen PBS en incubeercellen met 2 ml van 1 x trypsine tot cellen distantiëren van de kolf (-2 min).
  5. Resuspendeer cellen in 8 ml medium (voor een totaal van 10 ml celsuspensie) en voorzichtig pipet op en neer te breken klonten van cellen.
  6. Behouden cellen in een T-150 kolf zaaien 1 ml celsuspensie in 24 ml medium (voor een totaal van 25 ml per T-150) en rock fles zachtjes van links naar rechts. Handhaaf cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 tot volgend split.

2. Het beoordelen van virusreplicatie en cytotoxiciteit in LCRT Cellen

  1. Virusreplicatie
    OPMERKING: Virus constructies uitdrukken van een tl-tag, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP), onder controle van endogene virale promotors vergemakkelijken visualisatie van virusinfectie en verspreiden met behulp van fluorescentie plaat lezers.
    1. Zaad LCRT cellen in cultuur platen, waardoor er een goed voor het tellen. Zaad cellen zodat ze 80-90% confluent één dag meer zal zijn. Gebruik een concentratie van 10 5 CELls / ml (100 ui per putje) de gewenste confluentie één dag meer produceren in 96-well platbodem platen.
    2. De volgende dag, voorverwarmen 1x PBS, 1x trypsine, volledige en serumvrij medium in een 37 ° C waterbad gedurende 10 minuten vóór de proef begon.
    3. Zuig medium van het tellen en spoel cellen met 5 ml 1x PBS door tuimelen deze over het oppervlak van de put.
    4. Na spoelen, aspireren PBS en incubeer cellen met 2 ml van 1x trypsine tot cellen distantiëren van de kolf (-2 min).
    5. Resuspendeer de cellen in het geschikte volume compleet medium tot een celdichtheid te leveren binnen de telbare bereik met een hemocytometer. Om een ​​nauwkeurige telling cellen waarborgen, grondig celsuspensie te mengen voorafgaand aan het inoculeren van de hemocytometer op en neer te pipetteren.
    6. Bepaal de hoeveelheid virus stock die voor infectie op de gewenste multipliciteit van infectie (MOI).
      Verplichte Paque Forming Units (pve) = aantal vergulde cellen * MOI(Pve / cel)
      Volume van het virus voorraad verplicht = verplicht pve / virus voorraad titer (pve / ml)
    7. Bereid virus inoculum in serumvrij medium in tubes. Meng goed door vortexen of pipetteren voor het toevoegen inoculum aan de cellen.
    8. Infect cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C, waarna pas een onderhoud overlay DMEM + 1% FBS.
    9. Scan platen één en twee dagen na infectie (pi) om GFP fluorescentie te visualiseren.
  2. Virus Cytotoxiciteit
    OPMERKING: Voer de resazurin cytotoxiciteitstest onder omstandigheden met weinig licht als de verbinding is lichtgevoelig. Een putje met medium alleen worden opgenomen om te corrigeren voor de achtergrond fluorescentie.
    1. Bereid een 5% (v / v) oplossing van Resazurin in 1x PBS. Meng de oplossing door pipetteren.
    2. Zuig medium van cellen en toepassing van de 5% resazurin oplossing. Neem een ​​putje met medium alleen corrigeren voor achtergrondfluorescentie.
    3. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C, nadie lezen fluorescentie met behulp van een fluorescentie-afleesapparaat (excitatie 530 nm, emissie 595 nm).
    4. Analyseer gegevens betreffende geïnfecteerde controles correctie voor achtergrondfluorescentie.

3. Huisvesting en Handling

  1. Huisvesting en Dieet
    1. Huis katoenratten individueel afnemen in brandbestrijding in polycarbonaat rat kooien met knaagdier beddengoed (1/8 "maïskolf bedden), een stuk pvc-buis niet meer dan 8 inches en Nestlets verrijking (figuur 2).
    2. Gebruik een beveiligbaar stalen korf te overtop van de kooi zitten en bevatten knaagdieren eten en een fles water.
      OPMERKING: Deze kooi setup zal zorgen voor veilig en gemakkelijk vangen van de dieren, met de plaatsing van de verrijking buis tegen het einde van de kooi wezen van het grootste belang.
  2. Behandeling
    1. Handgreep katoenratten in de ochtend vóór rondes van dierenverblijf technici voorkomen spannende voordateen procedure.
    2. Tijdens alle procedures, draag dikke lederen handschoenen voor bescherming.
    3. Aangezien de dieren voornamelijk blijven de verrijking buizen gebruiken om de ratten over in een nieuwe kooi tijdens normale reiniging. Als alternatief, open de kooi iets om de handler om hun hand op te komen, kan het dier vervolgens worden tegengehouden door scruffing de huid net boven de schouders en naar beneden te duwen. Huisartsenzorg niet te veel kracht te gebruiken als de dieren hun tong kunnen bijten.
    4. Wees geduldig en gebruik van een vaste hand als de dieren hebben een sterke vlucht-of-fight respons en zal proberen om het vastleggen te voorkomen door het uitvoeren en uit de kooi te springen. Belangrijker, geen dieren te behandelen door de staart als degloving zal optreden.
    5. Trap de dieren in hun verrijkingen buizen over directe afhandeling. Dit vermindert drastisch verwondingen en ontsnappen.

4. Capture en Anesthesie

  1. Vangen
    1. Draag dikke leren handschoenen voor protection tijdens alle procedures.
    2. Gebruik een grote plastic container met gaten voor lucht en een deksel, een verdovingsmiddel inductie kamer groot genoeg om de houder en een neuskegel die aan het gas afvoerslang (figuur 3) passen.
    3. Werken in tweetallen de procedure efficiënter te maken en de belichtingstijd van de dieren te verminderen tot isofluraan, een inhalatie verdoving. Controleer een onderzoeker is verantwoordelijk voor het openen en vervangen van het stalen deksel van de kooi en het deksel van de inductie kamer (handler 1 #) en hun geassocieerde is verantwoordelijk voor het vangen van de dieren in de buis en het transport naar de inductie kamer (handler # 2).
    4. Plaats de kooi op een vlakke ondergrond en verwijder de buitenste deksel. Til de stalen invoerlade enigszins langzaam manoeuvreren verrijking buis zodanig evenwijdig aan de zijkanten van de kooi en tegen de achterkant is. Gebruik indien nodig een object aan de verrijking buis manoeuvreren zonder het openen van de kooi om te voorkomen dat schudden van het dier (handvatr # 1).
    5. Als het dier onrustig en verlaat de buis, zodat voldoende tijd voor het dier om te ontspannen en opnieuw te vestigen in de buis (handler 1 #).
    6. Langzaam en doelbewust til de rand van de stalen deksel verst van de verrijking buis, waarbij het andere uiteinde in contact met de kooi. Maak een ruimte groot genoeg is voor de plastic container (handler 2 #).
    7. In een soepele, snelle beweging, duw de plastic container overtop van de verrijking buis. Contact houden van de houder met de zijkant van de kooi, het vangen van de dieren in de buis. Voer de stappen 4.1.6 en 4.1.7 zo snel mogelijk (handler 2 #).
    8. Verwijder de stalen invoerlade en geef het plastic deksel van de geleider komen # 2 (handler 1 #). Schuif de plastic deksel tussen de zijkant van de kooi en de houder, indachtig aanhangsels de gevangen dieren in het proces. Laat de container niet te dichten, omdat dit de volgende stap moeilijker zal maken (handler # 2).
  2. Verdoia
    1. Zorg ervoor dat de container gesloten blijft en vervoeren het dier naar de inductie kamer. Plaats snel het dier in de kamer en verwijder het deksel in één vloeiende beweging (handler 2 #). Openen en onmiddellijk vervangen de inductie kamer deksel (handler # 1).
    2. Schakel de stroom van isofluraan de inductie kamer (5 l / min) en controleren de dieren op tekenen van lusteloosheid, waarna snel glijden het dier uit de buis en houder verwijderen zowel de inductie kamer om gascirculatie vergemakkelijken.
    3. Wanneer de rat volledig onder narcose is, verplaatsen naar het werkoppervlak en leg de neus en mond in de neuskegel (figuur 3). De rat is volledig verdoofd als het niet reageert op een krachtige teen knijpen.
    4. Plaats dierenarts vaseline oogzalf op de ogen van het dier tot droog en schaafwonden te voorkomen. Dit is een essentiële stap katoen ratten grote ogen die gevoelig kan zijn voor infectie of letsel optreedt.
    5. <li> Zorgvuldig monitoren en een constante ademhaling te handhaven en ervoor zorgen dat de neus van het dier blijft in de neuskegel fitting tijdens de gehele procedure. Stel het debiet van isofluraan adequaat. De hoeveelheid isofluraan nodig verdoven elk dier variëren.
    6. Post-procedure, de terugkeer van de dieren naar zijn kooi en zorgen voor het herwint volledige mobiliteit en borstligging.

5. Voorbereiding van de LCRT Cellen voor subcutane tumorvorming

OPMERKING: Een T-150 kolf van LCRT (90% samenvloeiing) levert ongeveer 2 x 10 7 cellen. Baseren het aantal T-150 kolven vereist op het totale aantal cellen nodig. Seed extra kolven aan het totale aantal cellen vereiste verkregen waarborgen en cellen verloren tijdens de bereiding en overeenkomsten om extra injecties tegemoet. Houd cellen op ijs waar mogelijk aan levensvatbaarheid van de cellen te verlengen.

  1. Om cellen, aspireren medium uit de kolf een oogstd spoelen cellen met 5 ml 1x PBS.
  2. Zuig PBS en incubeer cellen met 2 ml van 1 x trypsine tot cellen distantiëren van de kolf (-2 min).
  3. Resuspendeer cellen in 8 ml medium (voor een totaal van 10 ml celsuspensie) en voorzichtig pipet op en neer te breken klonten van cellen. Blijven cellen te oogsten van extra kolven.
  4. Bundelen alle celsuspensies in een conische buis, ongeveer 4 T-150s per 50 ml conische buis.
  5. Centrifugeer het buisje bij 160 x g gedurende 10 min bij 4 ° C.
  6. Zuig medium en resuspendeer de celpellet in het geschikte volume van PBS (10 ml PBS per T-150) tot een celdichtheid te leveren binnen de telbare bereik met een hemocytometer. Om een ​​nauwkeurige telling cellen waarborgen, grondig celsuspensie te mengen voorafgaand aan het laden van de hemocytometer door en neer te pipetteren.
  7. Bereken het totaal aantal cellen:
    Totaal aantal cellen geoogst = celtelling (cellen / ml) x resuspensie volume (ml)
  8. Bepalenhet volume celsuspensie vereist voor alle injecties. Zorg 2-3 extra doses per experiment. Een totaal van 5 x 10 5 LCRT cellen subcutaan geïnjecteerd zal voelbare tumoren te vormen binnen 3-4 dagen.
    Totaal aantal cellen nodig = 5 x 10 5 cellen x totaal aantal doses
    Volume celsuspensie vereist (ml) = (totale vereiste * som van injectievolume cellen) / (totaal aantal cellen geoogst)
  9. Pipet de vereiste hoeveelheid celsuspensie in een conische buis met PBS en meng goed. Aliquot afzonderlijke injecties (100 pl) in Eppendorf buisjes. Onderhouden buizen op ijs tijdens de injectie procedure.

6. Injecties

Opmerking: Voer procedures met twee onderzoekers een om de injectie uit te voeren terwijl de andere monitoren ademhalingssnelheid het dier en algemene conditie terwijl onder verdoving. Gebruik van insuline spuiten (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) voor alle injecties en een nieuwe naald voorelk dier.

  1. Subcutane injecties
    1. Vangen en verdoven van het dier (paragraaf 4).
    2. Scheer de injectieplaats met behulp tondeuse. Bont katoen rat is dik en vereist een scherpe snoeischaar om een ​​glad oppervlak te krijgen voor injecties. Maak de injectieplaats met 70% ethanol met een wattenstaafje en laat het dan volledig verdampen voordat u verder gaat.
    3. Load spuiten (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) met de cellen door het opstellen van langzaam en gestaag. Als bubbels zijn evident flick de spuit met enige kracht. Wanneer de bellen staan ​​bovenaan druk de zuiger tot de vloeistof bovenin de naald.
    4. Til de huid op de injectieplaats (aangeduid als de huid tentvorming) en steek de naald schuine kant naar boven. Zorg ervoor dat de naald beweegt zich vrij onder de huid om te voorkomen dat het injecteren van intramusculair.
    5. Verdrijf de inhoud van de spuit gelijkmatig en langzaam. Trek de naald schuine kant naar beneden.
  2. Intratumorale injecties
    1. Leg eend verdoven van de dieren (hoofdstuk 4).
    2. Maak de injectieplaats met 70% ethanol met een wattenstaafje en laat het dan volledig verdampen voordat u verder gaat.
    3. Load spuiten (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) met de virusinoculum door het opstellen van langzaam en gestaag terwijl de naald in een rechtopstaande positie. Als bubbels zijn evident flick de spuit met enige kracht. Zodra de bubbels staan ​​bovenaan druk vervolgens piston totdat de vloeistof is op de top van de naald.
    4. Steek de naald schuine kant naar boven in de tumor en het verdrijven van de inhoud van de spuit gelijkmatig en langzaam, terwijl het verplaatsen van de naald in een fan-achtig patroon, gedeeltelijk terugtrekken van de naald voor elke beweging tot scheuring van de tumor te voorkomen. Trek de naald schuine kant naar beneden.
      OPMERKING: Onderhuids LCRT tumoren zijn snel groeiende, ongeveer 100 mm 3 bereiken in 5-7 dagen. Bovendien necrotische en hemorragische centra vormen vaak op het oppervlak van de tumor binnen enkele dagen vereisen cazichtig bewaking (figuur 4).
  3. Intraperitoneale injecties
    1. Vangen en verdoven van het dier (paragraaf 4).
    2. Maak de injectieplaats met 70% ethanol met behulp van wattenstaafjes en laat het dan volledig verdampen voordat u verder gaat.
    3. Load spuiten (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) met het geneesmiddel door het opstellen van langzaam en gestaag. Als bubbels zijn evident flick de spuit met enige kracht. Zodra de bubbels staan ​​bovenaan druk vervolgens piston totdat de vloeistof is op de top van de naald.
    4. Steek de naald in de juiste onderste kwadrant van de buik. Trek de zuiger om ervoor te zorgen dat bloed of ontlasting niet worden opgezogen, wijst dit op een onjuiste plaatsing van de naald. Als dit gebeurt, verwijder dan de naald en bereiden een nieuwe spuit. Als de naald correct is geplaatst, verdrijven inhoud van de spuit gelijkmatig en langzaam.

7. tumorexcisie en lijkschouwing

  1. Verzamelen en te reinigen all gereedschappen met 70% ethanol voor euthanasie van het dier.
  2. Euthanaseren het dier de gewenste methode wordt CO2 inhalatie (2 l / min gedurende 5-10 min) aanbevolen. Onderzoeken het dier op eventuele afwijkingen in het lichaam staat.
  3. Plaats het dier in dorsale decubitus op een dissectie boord en reinig het dier met 70% ethanol.
  4. Gebruik een pincet om de huid te heffen op de onderbuik. Knip de huid en spieren met een schaar en een mediale incisie over de gehele lengte van het dier (anus kin).
  5. Snijd de ribbenkast door twee snedes zijdelings de kant van de ribbenkast en een over het borstbeen naar het hart en de longen bloot. Onderzoek de lobben van de long voor eventuele uitzaaiingen 27,29.
  6. Onderzoek alle organen voor afwijkingen en registratie van alle veranderingen in kleur, grootte en consistentie. Eventueel incisie de organen met een scalpel interne weefsels te onderzoeken. Specifiek, onderzoekt de lever, nieren, milt en maagdarmkanaal.
  7. Inspecteer de lymfeklieren voor uitzaaiingen en de uitbreiding 27,29.
  8. Om de tumor verzamelen, maken flank incisies boven en onder de tumor, zodanig dat de huid kan worden weggetrokken uit het lichaam met een pincet. Terwijl stevig houdt de huid met een pincet, gebruik een scalpel zorgvuldig verwijderen tumor door te snijden tussen de tumor en dermis (figuur 5).
  9. Plaats onmiddellijk de tumor in een gelabelde container van 10% neutraal gebufferde formaline.
  10. Afhankelijk van de grootte van de tumor, wil 1-2 dagen (≤ 2 mm, klein) of 5-6 dagen (> 2 mm, groot) voor het fixeren vóór bereiden afdelingen voor histologische analyse (figuur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Door de zeer opgewonden aard van katoenratten, vertrouwd met en gebruik procedures geoptimaliseerd om de stress van de dieren te verminderen gemak in het gebruik als een preklinisch diermodel. Gebruik van de juiste afhandeling technieken zullen ook risico's voor de onderzoeker te minimaliseren.

Bij het gebruik van katoen ratten is het noodzakelijk om kalm te blijven. De ratten zijn zeer prikkelbaar en proberen hun kooi ontsnappen. Gebruik van een verrijking buis en Nestlets zal ontsnappingspogingen te minimaliseren. Figuur 2 toont een optimale kooi setup om te helpen bij het ​​vastleggen van katoen ratten, inclusief plaatsing van de verrijking buis. Bovendien werken in een kleine kamer, indien mogelijk te helpen bij het heroveren. Als ontsnapping gebeurt, wacht tot het dier te kalmeren en stil blijven staan, dan bedekken met de duidelijke capture container of bedekken met handschoenen aan, en let niet teveel kracht te gebruiken.

In tegenstelling tot een muis, de katoenrat een langwerpige snuit which vereist een andere neus passend bij de narcose gas te leveren. Figuur 3 toont een neuskegel ontworpen om goed te passen in een katoenen rat en het maximaliseren van de levering van isofluraan. Met behulp van een rubberen membraan als passend kan leiden tot trauma aan de neus van de rat.

Als het mogelijk is te verkrijgen discard dieren (die niet nodig zijn door andere onderzoekers, katoen ratten of anderszins) aan de injectie technieken voorafgaand aan het proberen ze op de ratten te oefenen. Hierdoor kan de onderzoeker om bekendheid te krijgen met naalden en hoe ze veilig te behandelen. Insuline spuiten zijn voorgesteld voor injecties in katoenratten hun huid dik en taai vergeleken met een muis. Toch kan een grotere naald (21 G x 1 ") worden gebruikt voor de injectie van tumorcellen verlies van cellevensvatbaarheid vermijden door cel afschuiving tijdens de injectie. Veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het niet recapping naalden en correcte verwerking in een naaldcontainer.

De injectie-tie van levensvatbare tumorcellen belangrijk is voor tumorvorming. Figuur 1A toont een gezonde monolaag van LCRT cellen die kunnen worden bereid voor injectie in katoenratten. In vergelijking toont figuur 1B LCRT cellen die lage levensvatbaarheid en moeten niet worden gebruikt voor injecties. Het is belangrijk tumor cellevensvatbaarheid te verifiëren met behulp van een werkwijze zoals trypan blauw kleuring bij het tellen van cellen voor injecties.

De tumoren gevormd uit LCRT cellen zijn snel groeiende en necrotische centra vormen vaak (figuur 4A). Als zodanig moet tumorvorming zorgvuldig worden gecontroleerd op ulceratie (Figuur 4B) te vermijden. Als ulceratie optreedt het dier moet worden opgeofferd voor infecties en mogelijk de dood van sepsis te voorkomen.

De effecten van anti-tumor behandelingen worden vaak het best onderzocht door histologische analyse. Dit vereist excisie van de tumor post mortem. Het handhaven van tumorweefsel integriteit zal resULT in een monster dat een nauwkeurigere weergave van de tumor in vivo. Figuur 5 toont een uitsnede techniek waarbij de tumor wordt zorgvuldig gescheiden van de omringende weefsel met een scalpel en pincet. Het verwijderen van de tumor door het met geweld te trekken uit de omliggende weefsel met behulp van een pincet kan de tumor scheuren of verstoren van de integriteit van tumorweefsel, invloed juiste histologische analyse. De dichte en zeer gevasculariseerde structuur van de tumor, zoals in figuur 6, wordt gehandhaafd door de excisie techniek. Dit is belangrijk analyse van behandelingen die tumorvasculatuur beïnvloeden, zoals bij veel OVS.

Figuur 1
Figuur 1:. Bright-veld microscopie beeld van LCRT Cells (A) fenotype van gezonde (~ 90% levensvatbare) LCRT cellen klaar voor voorbereiding voor injectie in katoen ratten. (B) Ongewenste fenotype van LCRT cellen niet geschikt voor injectie. Afgeronde cellen dood of stervend (aangegeven door een pijl). Beelden werden vastgelegd met 10x vergroting; schaal bar = 1 mm.

Figuur 2
Figuur 2: Voorbeeld van kooi opstelling voor gemakkelijke vangst van katoenratten optimale plaatsing van verrijking buis tegen het einde van de kooi en opname van Nestlets steun in dierlijke vangen..

Figuur 3
Figuur 3:. Anesthesie neuskegel montage voor de levering van isofluraan verdoofde katoen ratten Vervaardigd neuskegel past langwerpige snuit van katoen rat te accurate levering van isofluraan gas te waarborgen, zonder trauma aan de neus.

"Figuur Figuur 4:. Necrotisch weefsel op een subcutane tumor LCRT (A) Vroege stadia van necrose van tumorweefsel. Het dier moet zorgvuldig worden gecontroleerd om progressie naar (B) volledig open zweren te voorkomen. Het dier moet worden opgeofferd als tumor ulcerates als infectie en sepsis kan leiden.

Figuur 5
Figuur 5:. Excisie van een subcutane LCRT tumor histologie De subcutane tumor op de flank van een katoenrat wordt voorzichtig van de huid met behulp van een scalpel tumorweefsel integriteit te behouden, waardoor een betere voorstelling van tumor architectuur voor histologische analyse.

Figuur 6 Figuur 6:. Histologische weefselsectie van een subcutane tumor LCRT De morfologie van LCRT tumorweefsel bestudeerd middels paraffine ingebedde coupes gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E). Afbeelding werd gevangen bij een vergroting van 20x; schaal bar = 1 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7, (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254, (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78, (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63, (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11, (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8, (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26, (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66, (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20, (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88, (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14, (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62, (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12, (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110, (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30, (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74, (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76, (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12, (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78, (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17, (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222, (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13, (1), 123 (2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16, (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369, (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22, (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19, (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).
Het hanteren van de Cotton Rat in Studies voor de Pre-klinische evaluatie van Oncolytic Virussen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter