Introduction
腫瘍溶解性ウイルス（OV）を選択的に、正常細胞と腫瘍細胞1,2間の生化学的相違を利用して、腫瘍細胞中で複製する。天然に存在する野生型ウイルスと呼ばれる選択的な腫瘍崩壊を達成するために、突然変異を必要としないもの、および選択的な腫瘍崩壊を達成するように操作されなければならないもの：OVSの2種類がある。所定の腫瘍タイプ内の変異のコレクションは、OV 2のために、正常な細胞上の選択的な増殖の利点の性質を決定する。 OVSを使用することの安全性および利点は、臨床試験3-7に実証されている。腫瘍溶解性ウイルス療法の分野における進歩にもかかわらず、より良いモデルはOVSの抗腫瘍効果を評価するために必要であることを示唆し、前臨床及び臨床結果との間に隙間が存在する。
ウシヘルペスウイルス1型（BHV-1）、 ヘルペスウイルス科ファミリーのメンバー、及びAlphaherpesviridaeサブファミリーである。 BHV-1のiniti悪い風邪に似た症状が8,9、多種多様な顕在牛のATEウシ呼吸器病、。 BHV-1は、ヘパラン硫酸とネクチン1 10として、HSV-1によって使用される添付ファイルとエントリの受容体と結合する。しかし、ネクチン2 10の代わりに、CD155に特異的に結合する。 BHV-1は、それが効率的に入力して、正常および形質転換マウス細胞-3,4,10-で複製を開始することができないような非常に狭い宿主範囲を有している。これは、従来のマウスモデルの使用には問題となる。 BHV-1の腫瘍崩壊能力は、 インビトロ 11,12 に実証されている。 BHV-1で複製を開始し、セル11,12を開始乳癌細胞および乳癌を含む組織学的起源の様々なヒト腫瘍細胞を死滅させることが示されている。しかし、BHV-1の抗腫瘍容量は、免疫担当ホストのコンテキスト内で、生体内で評価されなければならない。
のためのヒトアデノウイルス（AD）、57の血清型が同定された最も一般的にヒトにおける呼吸器疾患の原因がある。腫瘍溶解性Adベクターは、いくつかの臨床試験13-15に進出して、それらの抗腫瘍効果について評価されている。有望な前臨床データにもかかわらず、臨床結果は期待の短い下落している。それらはウイルス16,17に対する免疫応答を減衰さ呈するものの、ヒト腫瘍異種移植片モデルは、典型的には、Adベクターの抗腫瘍効果を研究するために使用される。さらに、同系マウスモデルは、広告感染に対する非許容である17,18非現実的なこれらのモデルを使用して、ホストの免疫応答の評価を行う。
宿主の免疫系は、腫瘍細胞死を誘発する19 OVSそれによって最も影響力のあるメカニズムとして同定されている。寛容および非寛容化腫瘍関連抗原（TAA）モデル間の抗腫瘍応答が異なると大幅にOV療法の成功に影響を与えることができる。 HSV-1 OV KM100（ICP0 N2121814 20 における VP16）20,21は、マウスポリオーマミドルT抗原乳癌モデル22における担癌マウスの80％において腫瘍退縮を誘発した。しかし、HER-2 / neuのモデルにおいて、KM100の抗腫瘍効果は、トランスジェニック同系マウス腫瘍静止状態で20％の完全な退行の間HER2寛容化マウスを変える。一緒にこれらのデータは、完全に最高の完全に治療の成功を決定する機能を理解するために、ヒトの免疫風景を再現動物モデルを用いてOVSを評価することの重要性を強調。
（5で検討される）南北アメリカ原産のコットンラット（Sigmodon紫檀 ） は 、最も一般的にRSウイルス感染症のモデルとして使用されます。それらは6,23複雑ウシ呼吸器疾患に関連する病理を再現するように、コットンラットは、抗BHV-1ワクチン接種の研究で使用されている。コットンラットのさらに、BHV-1感染持続的な粘膜および全身の免疫応答6,23-25 を誘導する、免疫原性である。細胞株はそれぞれ26、自発的な線維肉腫および骨肉腫乳腺（LCRT）のと骨（CCRTとVCRT）に由来している。コットンラットは、それらが広告感染に対して感受性であり、ヒトの27-29と同様の病理を示すように腫瘍溶解性Adベクターのインビボでの有効性を評価するために使用されてきた。 OVSの前臨床評価のための免疫不全のモデルの使用だけでなく、治療に対する臨床反応の少ない指標であるが、彼 らは考慮に腫瘍溶解性ウイルス療法30,31における免疫系の役割を取ることができない。したがって、同系および乳癌および骨肉腫の腫瘍寛容コットンラットモデルは、従来のマウスモデルを用いて研究することができないようなBHV-1とOVS、およびAdの前臨床効力を評価するの関連モデルである。
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Protocol
注：使用されるプロトコルは、動物ケアのガイドラインにカナダの評議会によるとマクマスター大学で私たちの施設内動物研究倫理委員会によって承認されている。実験は、マクマスター大学、中央動物施設で実施した。
1.培養LCRT細胞
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で培養LCRT細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）、2 mM L-グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシンを補充した。 37℃でT-150組織培養フラスコ中で細胞を維持し、5％CO 2。継代細胞は90％コンフルエントな単層（2〜3日毎に、 図1）を形成する。
- 前加温1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、細胞を分割する前に10分間37℃の水浴中で1×トリプシンおよび培地。
- 吸引除去フラスコから培地および1×5mlのPBSで細胞をすすいでください。
- すすいだ後、PBSを吸引し、インキュベート1Xトリプシンの2ミリリットルをもつ細胞の細胞がフラスコ（〜2分）から解離するまで。
- 穏やかに（10ミリリットルの細胞懸濁液の合計）8ミリリットル培地中の細胞を再懸濁し、細胞の塊を破壊するために上下にピペット。
- 左右に優しく側から、ロックフラスコ（T-150あたり25ミリリットルの合計）24ミリリットル培地に1ミリリットルの細胞懸濁液を播種することにより、T-150フラスコ中の細胞を維持する。次の分割まで37℃で、5％CO 2で細胞を維持する。
2. LCRT細胞におけるウイルス複製と細胞毒性を評価する
- ウイルス複製
注：そのような内因性のウイルスプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光タグを発現するウイルス構築物は、ウイルス感染の可視化を容易にし、蛍光プレートリーダーを用いて広げた。- 計数のために井戸を残して培養プレートにシードLCRT細胞。彼らは1日後に80〜90％コンフルエントになるようシード細胞。 10 5セル画の濃度を使用してくださいのls / mlの（ウェル当たり100μl）を96ウェル平底プレート中で一日後、所望の密集度を生成する。
- 翌日、前加温1×PBS、1×トリプシン、事前実験を開始する10分間37℃の水浴中で完全な無血清培地。
- よく数え、ウェルの表面の上に揺動することによって1×PBS 5mlで細胞をリンスから培地を吸引。
- すすいだ後、吸引PBS、細胞がフラスコ（〜2分）から解離するまでの1xトリプシンの2ミリリットルで細胞を培養する。
- 血球計数器を用いてカウント可能範囲内に細胞密度を得るために完全培地の適切な体積で細胞を再懸濁する。正確な細胞数を確保するために、前に十分ピペッティングにより血球計数器を接種する細胞懸濁液を混ぜる。
- 感染の所望の多重度（MOI）で感染に必要ウイルスストックの量を決定します。
形成単位必要なコールパック（PFU）=播種した細胞の数* MOI（PFU /細胞）
ウイルスストックのボリュームに必要=必要なPFU /ウイルスストックの力価（PFU / ml）を - チューブ内の無血清培地中でウイルス接種を準備します。細胞に接種材料を追加する前に、ボルテックスまたはピペッティングで完全に混合します。
- DMEM + 1％FBSのメンテナンスオーバーレイを適用した後、37℃で1時間、細胞に感染する。
- スキャンプレート1および2日後に感染（π）は、GFP蛍光を可視化した。
- ウイルス細胞毒性
注：化合物が感光性であるように、低光条件下でレサズリン細胞毒性アッセイを実行します。ウェルを含有する培地は、バックグラウンド蛍光を補正するために含まれるべきである。- 1×PBS中レサズリンの5％（v / v）の溶液を調製する。ピペッティングにより溶液を混ぜる。
- 吸引細胞からの培地、5％のレサズリン溶液を適用する。唯一のバックグラウンド蛍光を補正するためによく含む媒体を含む。
- 37℃で30分間細胞をインキュベート °C、後その蛍光プレートリーダー（励起530nmで、放射595 nm）を用いて蛍光をお読みください。
- バックグラウンド蛍光を補正する非感染対照と比較したデータを分析します。
3.住宅および取扱い
- 住宅·ダイエット
- ハウスコットンラットを個別に-戦っげっ歯類寝具（1/8 "トウモロコシの穂軸寝具）、もはや濃縮などの8インチとnestletsよりPVCチューブ（ 図2）のセクションを含むポリカーボネートラットケージに減少します。
- 頭上ケージの座ると齧歯類食品や水のボトルを含むように固定可能なスチールバスケットを使用してください。
注：このケージのセットアップが最も重要のケージ幸福の終わりに対して濃縮管の配置を、動物の安全かつ容易なキャプチャが可能になります。
- 取り扱い
- 前エキサイティングそれらを避けるために前に動物施設の技術者によるラウンドに、午前中にコットンラットを扱う手順。
- すべての手順の間、保護のための厚手の革手袋を着用してください。
- 動物は主に濃縮管に残っているように、定期的な洗浄中に新しいケージにラットを転送するためにそれらを使用しています。代替的に、ハンドラがそれらの手に到達することを可能にするためにわずかにケージを開いて、動物は、ちょうど肩の上の皮膚をscruffingと押し下げて抑制することができる。動物として無理な力を加えないように練習ケアは彼らの舌をかむことがあります。
- 我慢してと動物が強い飛行または戦いの応答があり、実行していると、ケージの外にジャンプして捕獲を避けるためにしようとするように着実に手を使用しています。 deglovingが発生するように重要なのは、テールにより動物を扱うことができません。
- トラップ直接取り扱い上の彼らの濃縮度管の動物。これは大幅に傷害を減少させ、脱出。
4.キャプチャと麻酔
- キャプチャー
- プロテクト用の厚手の革手袋を着用してくださいすべての手順の間にイオン。
- 空気と蓋、容器及びガス出力ホース（ 図3）に取り付けられたノーズコーンに合わせて十分な大きさの麻酔導入室用の穴を持つ大規模な明確なプラスチック容器を使用してください。
- 手順がより効率的にするとイソフルラン、吸入麻酔薬に動物の露光時間を減少させるためにペアで動作。 1研究者は、開口部を担当していることを確認し、ケージと誘導室（ハンドラ＃1）の蓋とその準にスチールカバーを交換すると誘導室にチューブ内の動物の捕獲や輸送を担当する（ハンドラ＃ 2）。
- 平らな面にケージを置き、外蓋を取り外します。少しスチール給紙トレイを持ち上げて、ゆっくりとそれがケージの側面と、背面に対して平行になるように濃縮チューブを操縦。必要に応じて、動物を攪拌避けるためにケージを開かずに濃縮管を操縦するためにオブジェクトを使用（ハンドルR＃1）。
- 動物が攪拌され、チューブを残しなった場合、動物はリラックスして再びチューブ（ハンドラ＃1）に定住するための十分な時間を確保。
- ゆっくりと意図的にケージに接触してもう一方の端を維持し、濃縮管から鋼カバー遠いの端を持ち上げます。プラスチック容器（ハンドラ＃2）のために十分な大きさのスペースを作る。
- 1なめらかな、クイックモーションでは、濃縮管の頭上プラスチック容器を押してください。チューブ内の動物を捕獲する、ケージの側面を有する容器の接触を維持する。可能な限り迅速に（ハンドラ＃2）のステップ4.1.6と4.1.7を実行します。
- 鋼の給紙トレイを取り外し、＃2（ハンドラ＃1）ハンドラにプラスチック容器の蓋を与える。プロセスの中に閉じ込め、動物の付属に留意され、ケージの側面と容器との間プラスチックのふたをスライドさせます。これは（ハンドラ＃2）次のステップをより困難になりますように、容器を密封しないでください。
- AnesthesIA
- 容器は閉じたままと誘導室に動物を輸送することを確認してください。すばやく室で動物を配置し、一つの流体運動（ハンドラ＃2）に容器蓋を取り外します。開いて、すぐに誘導室蓋を交換する（ハンドラ＃1）。
- 誘導室（5 L /分）にイソフルランの流れをオンにして、無気力の兆候動物を監視し、ガス循環を促進するために誘導室から両方取り外し、チューブおよびコンテナから動物をスライドさせてすぐに、その時点で。
- ラットが完全に麻酔されると、作業面に移動し、ノーズコーン（ 図3）内に、鼻と口を配置する。それは強力なつま先のピンチに反応しないときラットは完全に麻酔をかけている。
- 乾燥や擦り傷を防ぐために、動物の目に獣医のワセリン眼軟膏を置きます。コットンラットは、傷害が発生した場合、感染しやすいことができ、大きな目を持っているので、これは必須のステップです。 <李は>注意深く監視し、一定の呼吸速度を維持し、動物の鼻が手順を通してフィッティングノーズコーンに残ることを確認してください。適切にイソフルランの流量を調整します。各動物を麻酔するために必要なイソフルランの量が変化します。
- 後手順は、そのケージに動物を返し、それは完全なモビリティと胸骨横臥を取り戻すことを確認してください。
皮下腫瘍形成のためのLCRT細胞の5準備
NOTE：LCRT（90％コンフルエント）のOne T-150フラスコを約2×10 7個の細胞が得られる。基本必要な細胞の総数に必要なT-150フラスコの数。必要な細胞の総数を取得し、準備し、余分な注入のために必要なものの間に失われた細胞を収容するように保証するために余分なフラスコに播種する。細胞生存率を延長することが可能な限り氷上で細胞を保管してください。
- 収穫細胞、フラスコANから吸引媒体へ1×5mlのPBSで細胞をリンスdは。
- 吸引しPBSおよび細胞がフラスコ（〜2分）から解離するまでの1xトリプシンの2ミリリットルで細胞を培養する。
- 穏やかに（10ミリリットルの細胞懸濁液の合計）8ミリリットル培地中の細胞を再懸濁し、細胞の塊を破壊するために上下にピペット。追加のフラスコから細胞を回収し続ける。
- 1円錐管、50ミリリットルコニカルチューブあたり約4 T-150Sにすべての細胞懸濁液をプール。
- 遠心機で4℃で10分間160×gでチューブ。
- 培地を吸引し、血球計数器を用いてカウント可能な範囲内に細胞密度を得た（T-150当たり10 mlのPBS）、PBS適切な容量の細胞ペレットを再懸濁する。正確な細胞数を確保するために、前に十分ピペッティングにより血球計数器をロードする細胞懸濁液を混ぜる。
- 細胞の総数を計算します。
=細胞数（細胞/ ml）を回収した細胞の総数は、再懸濁の体積（ミリリットル）× - 決定するすべての注射に必要な細胞懸濁液の量。実験あたり2-3余分な用量を確認します。皮下注射し、5×10 5 LCRT細胞の合計は3〜4日以内に触知可能な腫瘍を形成することになる。
必要な細胞の総数= 5×10 5細胞xの用量の総数
必要な体積の細胞懸濁液（ミリリットル）=（注入量の*和に必要な総細胞）/（回収した細胞の総数） - ピペットは、PBSを含むコニカルチューブに細胞懸濁液の量を必要とし、完全に混合する。エッペンドルフチューブに小分けし、個々の注射（100μL）。注入手順の間、氷上にチューブを維持します。
6.注射
注：1はしばらく他のモニター動物の呼吸速度と全身状態ながら、麻酔下で注射を行うために、2人の研究者との手順を実行します。すべての注射との新たな針のためのインスリン注射器（29 G X 1/2」、0.3ミリリットル）を使用各動物。
- 皮下注射
- 動物（セクション4）を取得し、麻酔。
- バリカンを使用した注射部位を剃る。コットンラットの毛皮は厚く、注射のために滑らかな表面を得るために、鋭いトリマーが必要です。綿棒を用いて70％エタノールで注射部位を清掃し、それが先に進む前に、完全に蒸発させる。
- ゆっくりと着実に描画することによって細胞を用いた負荷シリンジ（29 G xの1/2」、0.3ミリリットル）。気泡はいくつかの力で注射器明らかフリックしている場合。気泡が上部に表示されたら、液体が針の一番上になるまで、プランジャーを押してください。
- （皮膚テンティングと呼ばれる）、注射部位の皮膚を持ち上げて、針のベベル面を上にして挿入します。針が筋肉内注射を避けるために皮膚の下に自由に動くことを確認してください。
- 均等にゆっくりと注射器の内容物を排出する。針ベベル側を下に撤回。
- 腫瘍内注射
- キャプチャ動物（セクション4）を麻酔dは。
- 綿棒を用いて70％エタノールで注射部位を清掃し、それが先に進む前に、完全に蒸発させる。
- 直立位置に針を保持しながら、ゆっくりと着実に描画することでウイルス接種による負荷シリンジ（29 Gは0.3ミリリットル、「1/2 X）。気泡はいくつかの力で注射器明らかフリックしている場合。液体は針の一番上になるまで、気泡は、プランジャーから、上部プッシュでたら。
- 腫瘍に針のベベル側を挿入し、部分的に腫瘍の裂傷を防止するために、各移動前の針を引き抜く、ファン状に針を移動させながら均一にゆっくりと注射器の内容物を放出する。針ベベル側を下に撤回。
注：皮下LCRTの腫瘍は5-7日間で約100ミリメートル3に到達する、急速に成長している。さらに、壊死性および出血性センターは、多くの場合、数日以内に腫瘍の表面に形成し、CAが必要ですreful監視します（ 図4）。
- 腹腔内注射
- 動物（セクション4）を取得し、麻酔。
- 綿棒を用いて70％エタノールで注射部位を清掃し、それが先に進む前に、完全に蒸発させる。
- ゆっくりと着実に策定による薬物と負荷シリンジ（29 Gは0.3ミリリットル、「1/2 X）。気泡はいくつかの力で注射器明らかフリックしている場合。液体は針の一番上になるまで、気泡は、プランジャーから、上部プッシュでたら。
- 腹部の右下腹部に針を挿入します。血液や糞を吸引していないことを確認するために戻ってプランジャーを引っ張る、これは針の不正確な配置を示している。この問題が発生した場合は、針を撤回し、新しい注射器を準備します。針が正確に置かれたとき、均一にゆっくりと注射器の内容物を放出する。
7.腫瘍切除および剖検
- アルを収集し、きれいに動物の安楽死の前に70％エタノールリットルツール。
- 所望の方法によって、動物を安楽死させる、CO 2吸入（5〜10分間2リットル/分）が推奨されます。身体状態の異常のために動物を調べます。
- 解剖ボードに背側横臥位で動物を置き、70％エタノールで動物を清掃してください。
- 下腹部の皮膚を持ち上げるためにピンセットを使用してください。はさみを使って皮膚や筋肉を切断し、動物の長さ（あごに肛門）を実行して、内側切開する。
- 心臓や肺を露出させるために2カット、1横方向に胸郭の側面までと胸骨全体の1にすることによって胸郭をカット。すべての転移27,29のために肺のローブを調べます。
- 異常のためにすべての臓器を調べ、色、大きさ、および一貫性の変化を記録する。必要に応じて、内部組織を調べるためにメスで臓器を切開する。具体的には、肝臓、腎臓、脾臓、および消化管を検査。
- 転移および拡大27,29のためのリンパ節を検査します。
- 腫瘍を収集するには、脇腹切開の上に、皮膚がピンセットで身体から引き離さすることができるように、腫瘍の下に作る。しっかりとピンセットで皮膚を保持しながら、慎重に腫瘍及び真皮（ 図5）との間で切断することにより、腫瘍を除去するためにメスを使用しています。
- すぐに10％中性緩衝ホルマリンのラベル容器に腫瘍を配置。
- 腫瘍の大きさに応じて、組織学的分析（ 図6）のために切片を作製する前に固定するための1~2日（≤2mmの小）または5-6日間（大> 2mmの）を可能にする。
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Representative Results
によるコットンラットの非常に興奮性の性質を熟知していると、前臨床動物モデルとしての使用に容易になり、動物のストレスを低減するように最適化手順を利用する。適切な処理技術の使用はまた、研究者へのリスクを最小限にする。
コットンラットを使用したとき、それは穏やかな滞在することが不可欠です。ラットは非常に興奮性であり、それらのケージを脱出しようとします。濃縮管とnestletsの使用は、エスケープの試みを最小限に抑えることができます。 図2に、濃縮管の配置など、コットンラット、の捕獲を支援するために、最適なケージのセットアップを示しています。奪還を支援するために、可能な場合また、小さな部屋で働いています。エスケープが発生した場合は、無理な力を加えないように注意しながら、手袋をはめた手で明確なキャプチャコンテナまたはカバーでそれをカバーし、沈静化するために動物を待ち、静止している。
マウスとは対照的に、コットンラットは、細長いスナウトワットを有するHICHは、麻酔ガスを送達するようにフィッティング異なる鼻を必要とする。 図3は、適切にコットンラットにフィットし、イソフルランの送達を最大にするノーズコーンを示している。フィッティングのゴム膜を使用すると、ラットの鼻への外傷を生じ得る。
廃棄動物を得ることができた場合は、ラットにそれらを試みる前に注射技術を実践するために（それらは、そうでなければ、他の研究者、コットンラットまたはが必要としない）。これは研究者は、針とどのようにそれらを安全に処理する方法に精通して得ることができるようになります。彼らの皮膚は、マウスに比べて厚く、タフであるようにインスリン注射器は、コットンラットにおける注射のために提案されている。しかしながら、より大きな注射針（1×21 G '）は、注入中に、セルのせん断に対する細胞生存率の低下を回避するために、腫瘍細胞の注射のために使用することができる。安全上のご注意は、このような鋭利物容器に針や適切な処分をさらいしないように、従うべき。
injec生存腫瘍細胞のる適切腫瘍形成に重要である。 図1Aは、コットンラットへの注入のために調製することができるLCRT細胞の健全な単層を示している。比較して、図1Bは、低い生存率を有し、注射のために使用されるべきではないLCRT細胞を示す。注射用の細胞を計数する際には、トリパンブルー染色などの方法を用いて腫瘍細胞の生存率を確認することが重要である。
LCRT細胞から形成された腫瘍は、急成長および壊死中心が頻繁に（ 図4A）を形成している。このように、腫瘍形成は、潰瘍（ 図4B）を避けるために注意深く監視されるべきである。潰瘍が発生した場合動物は敗血症から感染し、可能死を避けるために犠牲にする必要があります。
抗腫瘍治療の効果は、多くの場合、最高の組織学的分析を介して調べられる。これは、腫瘍の死後の切除が必要です。腫瘍組織の完全性を維持することがresはなりインビボでの腫瘍のより正確な表現であり、試料中のULT。 図5は、腫瘍を注意深くメス及びピンセットを用いて、周囲の組織から分離することにより、切除技術を示す。ピンセットを使って周囲の組織からの力によってそれを引っ張って腫瘍を除去すると、腫瘍を破壊または腫瘍組織の完全性を崩壊させる、適切な組織学的分析に影響を与えることがあります。腫瘍の緻密で高度に血管構造は、 図6に示すように、この切除技術によって維持される。多くのOVSの場合のように、これは、腫瘍血管系に影響を与える治療の分析において重要である。
図1：健康のLCRT細胞の明視野顕微鏡画像（A）表現型（約90％生存）コットンラットへの注入の準備のための準備ができてLCRT細胞。（B）LCRT細胞の望ましくない表現型注入には向いていない。丸みを帯びた細胞は死んでいるか（矢印で示す）が死んでいる。画像は10倍の倍率で撮影された。スケールバー= 1ミリメートル。
図2：コットンラットの取り込みを容易にするためにケージのセットアップの例ケージや動物の捕獲でnestlets助剤の含有物の端部に対して濃縮チューブの最適な配置。。
図3：麻酔をコットンラットにイソフルランを送達するためのフィッティング麻酔ノーズコーンを購入ノーズコーンは、鼻に外傷なしにイソフルランガスの正確な配送を確保するために、コットンラットの細長い鼻にフィットします。
図4：皮下LCRT腫瘍における壊死組織（A）腫瘍組織の壊死の初期段階。動物は、慎重に（B）全開潰瘍形成への進行を回避するために監視されるべきである。感染症や敗血症などの腫瘍潰瘍が結果ができれば動物を犠牲にする必要があります。
図5：組織学のために皮下LCRT腫瘍の切除コットンラットの側腹部に皮下腫瘍を注意深く従って、組織学的分析のために腫瘍構造のよりよい表現を提供する、腫瘍組織の完全性を維持するために、外科用メスを用いて皮膚から除去される。
図6：皮下LCRT腫瘍の組織学的組織切片 LCRT腫瘍組織の形態は、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色したパラフィン包埋切片を用いて調べた。画像は20Xの倍率で撮影した。スケールバー= 1ミリメートル。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965-092 | May use any brand |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Can prepare in lab, filter to sterilize | ||
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | May use any brand |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | May use any brand |
| Fetal bovine serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| T-150cm2 tissue culture flask | Fisher Scientific | 14-826-80 | May use any brand |
| 1X TypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| 12-well cell culture plate, flat bottom | Fisher Scientific | 08-772-29 | May use any brand, must be tissue culture treated |
| alamarBlue | Life Technologies | DAL1025 | May use an alternative reagent for determination of cell viability |
| 8640 Teklad 22/5 Rodent diet | Harlan | 8640 | |
| 1/8” corncob rodent bedding | Harlan | 7092 | |
| Nestlets | Ancare | - | Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable |
| 50 mL Conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | May use any brand, must be sterile |
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| 70% Ethanol | Can prepare in lab | ||
| 10 % Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | May use any brand |
| NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) | NAPCO | Model used not currently available | May use any brand |
| Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath | Fisher Scientific | Model used not currently available | May use any brand |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reichert Bright-line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | May use any brand |
| Typhoon Trio BioAnalyzer | GE Healthcare Life Sciences | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader | Tecan | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Allegra 6R benchtop centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| Table Top Anaesthesia machine | VetEquip | Model used not currently available | May use any brand, must be portable |
| Wahl Peanut Mini Clippers | Wahl | May use any brand of small clippers | |
| Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL | BD | 329464 | May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. |
| Cotton swabs | MedPro | 018-425 | May use any brand |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
References
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