Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Обращение с хлопковых крыс в исследованиях для доклинических оценки онколитических вирусов

Published: November 24, 2014 doi: 10.3791/52232
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology and Molecular Medicine, McMaster Immunology Research Centre, Institute for Infectious Disease Research, McMaster University

Introduction

Онколитического вируса (OV) избирательно реплицироваться в опухолевых клетках, используя биохимические различия между нормальными и опухолевыми клетками 1,2. Существуют два типа ОВС: те, которые не требуют мутацию, чтобы достичь селективного онколиза, называют природе вирусов дикого типа и те, которые должны быть разработаны, чтобы достичь селективного онколиза. Сбор мутаций в пределах данного типа опухоли определяет природу селективного преимущества роста над нормальными клетками для О.В. 2. Безопасность и выгода от использования ОВС была продемонстрирована в клинических испытаниях 3-7. Несмотря на достижения в области онколитической виротерапии существуют пробелы между доклинических и клинических результатов, предполагая, что лучшие модели необходимы для оценки противоопухолевой эффективности ОВС.

Крупного рогатого скота типа герпеса 1 (BHV-1) является членом семьи Herpesviridae и Alphaherpesviridae подсемейства. BHV-1 INITIТочные бычьей комплекс респираторных заболеваний у крупного рогатого скота, проявляется в самых разнообразных симптомов, напоминающих простуду 8,9. BHV-1 связывается крепления и ввода рецепторы, используемые HSV-1, такие как гепарансульфата и nectin-1 10. Тем не менее, он связывается CD155 в месте nectin-2 10. BHV-1 имеет очень узкий спектр хозяев, так что он не в состоянии эффективно ввести и инициировать репликацию в нормальных и трансформированных мышиных клеток 3,4,10. Это делает использование обычных моделей мышей проблематично. Онколитический емкость BHV-1 была продемонстрирована ин витро 11,12. BHV-1, как было показано, чтобы инициировать репликацию в и убивать опухолевые клетки человека из различных гистологических происхождения, включая клетки рака молочной железы и рака молочной железы инициирования клеток 11,12. Тем не менее, противоопухолевое емкость BHV-1 должны быть оценены в естественных условиях в контексте иммунитетом.

Аденовируса человека (Ad), для которыхЕсть 57 определены серотипов, наиболее часто вызывает респираторные заболевания у людей. Онколитических векторы объявления были оценены по их противоопухолевой эффективности с несколькими продвижения в клинических испытаниях 13-15. Несмотря на многообещающие доклинических данных, клинические результаты не оправдали ожиданий. Модели ксенотрансплантата человеческой опухоли, как правило, используется для изучения противоопухолевой эффективности векторов объявление, хотя они обладают ослабляется иммунный ответ на вирус 16,17. Кроме того, сингенные мышиные модели непермиссивные инфекции объявления, что делает оценку иммунного ответа с помощью этих моделей непрактичные 17,18.

Иммунная система хозяина была определена как наиболее влиятельного механизма, посредством которого OVS вызывать гибель клеток опухоли 19. Ответы Противоопухолевые между толеризованной и без толеризованной опухоли антигеном (ТАА) модели отличаются и может значительно повлиять на успех О.В. терапии. HSV-1 О.В. KM100 (ICP0 N212VP16 в 1814 году 20) 20,21 вызвало регрессию опухоли у 80% мышей с опухолями в мышиной полиома Средний Т-антигена модели 22 Рак молочной железы. Тем не менее, в ее-2 моделей / Neu, противоопухолевая эффективность из KM100 колебалась от 20% полной регрессии в сингенных мышей и опухолевых застой в трансгенных, HER2-толеризованной мышей. Вместе эти данные подчеркивают важность полного оценке OVS с помощью животных моделей, которые лучше всего повторять человеческую иммунную пейзаж, чтобы в полной мере понять, какие функции определения терапевтического успеха.

Хлопок крыса (Sigmodon hispidus), коренными жителями Северной и Южной Америки, наиболее часто используется в качестве модели респираторно-синцитиальный вирусной инфекции (как рассмотрено в 5). Хлопковые крысы также используется в-BHV-1 анти исследований вакцинации, поскольку они воспроизводят в патологии, связанной с бычьим респираторных заболеваний сложного 6,23. Кроме того, BHV-1 инфекции хлопковых крысявляется иммуногенным, вызывая устойчивый слизистых оболочек и системного иммунных ответов 6,23-25. Клеточные линии были получены в результате спонтанного фибросаркому и остеосарком молочной железы (LCRT) и кости (CCRT и VCRT), соответственно 26. Крысах были использованы для оценки эффективности в естественных условиях онколитических векторов объявление как они восприимчивы к инфекции объявление и имеет аналогичные патологию человека 27-29. Использование ослабленным иммунитетом моделей для предварительной клинической оценки OVS не только менее свидетельствует о клинических ответов на терапии, но они не принимают во внимание роль иммунной системы в онколитической виротерапии 30,31. Таким образом, сингенная и опухолевые толеризованной модели хлопок крыса молочной железы и остеосаркомы являются актуальными моделями, в которых для оценки доклинических эффективность OVS, таких как BHV-1 и объявления, которые не могут быть исследованы с помощью обычных моделей мышиных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: протоколы, используемые были утверждены нашей институциональной животных Совета по этике исследований на Университете МакМастер в соответствии с Канадским советом по руководящих принципов по уходу за животными. Эксперименты проводились на Университет МакМастер Центральный животных фонда.

1. Культивирование LCRT Клетки

  1. Культура LCRT клетки в среде Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Поддержание клеток в Т-150 колбу с тканевой культурой при 37 ° С и 5% СО 2. Прохождение клетки, когда они образуют 90% сливающийся монослой (каждые 2-3 дня, рисунок 1).
  2. Предварительно теплой 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), 1x трипсина и среднего C водяной бане 37 ° в течение 10 мин до разделения клеток.
  3. Аспирируйте среднего из колбы и промыть клетки с 5 мл 1x PBS.
  4. После промывки, аспирация PBS и инкубироватьклетки с 2 мл трипсина 1х, пока клетки диссоциируют из колбы (~ 2 мин).
  5. Ресуспендируют клеток в 8 мл среды (в общей сложности 10 мл клеточной суспензии) и аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы разбить скопления клеток.
  6. Поддерживать клетки в T-150 колбу путем посева 1 мл клеточной суспензии в 24 мл среды (в общей сложности 25 мл на Т-150) и рок-колбы осторожно из стороны в сторону. Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% СО 2 до следующего раскола.

2. Оценка репликации вирусов и цитотоксичности в LCRT клеток

  1. Вирус Репликация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные конструкции, выражающие флуоресцентной метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), под управлением эндогенных вирусных промоторов облегчения визуализации заражения вирусом и распространять с помощью флуоресцентной пластины читателей.
    1. Семенной LCRT клеток в культуре пластин, оставляя хорошо для подсчета. Семенной клетки таким образом, что они будут на 80-90% сплошности на день позже. Использование концентрации 10 5 челLs / мл (100 мкл на лунку) для получения желаемого слияния на день позже в 96-луночных плоскодонных планшетах.
    2. На следующий день, предварительно теплой 1X PBS, 1x трипсина, полной и свободной от сыворотки средой, в водяной бане при 37 ° в течение 10 мин до начала эксперимента.
    3. Отберите среду из подсчета хорошо и промыть клетки с 5 мл 1x PBS, тряся его по поверхности хорошо.
    4. После промывки, аспирация PBS и инкубировали клетки с 2 мл трипсина 1х до клетки диссоциируют из колбы (~ 2 мин).
    5. Ресуспендируют клеток в соответствующем объеме полной среде с получением плотности клеток в счетной диапазоне с помощью гемоцитометра. Для обеспечения точного подсчета клеток, тщательно перемешать клеточной суспензии до инокуляции гемоцитометра с помощью пипетки вверх и вниз.
    6. Определить объем вирусного штамма, необходимого для инфекции в желаемом множественности инфекции (MOI).
      Обязательно Paque единиц (БОЕ) = количество посеянных клеток * МВД(БОЕ / клетка)
      Объем вирусного штамма требуется = требуемая бое / вирус Stock титр (БОЕ / мл)
    7. Подготовка вируса инокулята в среде без сыворотки в пробирках. Тщательно перемешать на вортексе или пипетки перед добавлением инокулята в клетки.
    8. Инфицировать клетки в течение 1 часа при 37 ° С, после чего применить обслуживания накладку DMEM + 1% FBS.
    9. Сканирование пластины один и два дня после заражения (PI) для визуализации флуоресценции GFP.
  2. Вирус цитотоксичности
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните ресазурин цитотоксичности в условиях низкой освещенности, как соединение светочувствительной. И содержащую среду должны быть включены только для коррекции фоновой флуоресценции.
    1. Подготовка 5% (объем / объем) раствор резазурин в 1x PBS. Смешайте решение с помощью пипетки.
    2. Отберите среду из клеток и применять 5% раствор резазурин. Включить и среду, содержащую только для коррекции фоновой флуоресценции.
    3. Инкубируйте клетки в течение 30 мин при 37 ° С, послекоторый гласил флуоресценции с помощью флуоресцентного планшет-ридер (возбуждение 530 нм, эмиссия 595 нм).
    4. Анализ данных относительно неинфицированных лиц контрольной группы коррекции фоновой флуоресценции.

3. Корпус и регулировать

  1. Корпус и диета
    1. Дом крысах индивидуально для уменьшения внутренней борьбы в поликарбонатных крыс клетки, содержащие грызунов Солома (1/8 "кукурузник постельных принадлежностей), раздел ПВХ трубы длиной не более 8 дюймов и nestlets как обогащение (рисунок 2).
    2. Используйте защищаемого стальная корзина сидеть возвышаться из клетки и содержат корм для грызунов и бутылку воды.
      Примечание: Эта установка клетки позволит безопасно и легко захвата животных, с размещением трубы обогащения по отношению к концу клетки существа первостепенное значение.
  2. Обработка
    1. Ручка хлопка крыс утром, до раундов за животными техников, чтобы избежать волнующие их, прежде чемПроцедура.
    2. Во время всех процедур, носить толстые кожаные перчатки для защиты.
    3. Как животные, прежде всего, остается в трубах обогащению, использовать их для передачи крыс в новую клетку во обычной очистки. Кроме того, открыть клетку немного, чтобы обработчик для достижения их руку в, животных, то, может быть ограничено по scruffing кожу чуть выше плеч и нажимая. Уход практика не применять чрезмерную силу, как животное может укусить свой язык.
    4. Будьте терпеливы и использовать твердую руку, так как животные имеют сильную реакцию полета или бой и постараемся, чтобы избежать захвата бег и прыжки из клетки. Главное, не справиться животных за хвост, как будет происходить degloving.
    5. Ловушка животных в их обогащения труб более прямой обработки. Это значительно уменьшает повреждения и сбежать.

4. Захват и Анестезия

  1. Захват
    1. Носите толстые кожаные перчатки для защитыионов в всех процедур.
    2. Используйте большую прозрачную пластиковую емкость с отверстиями для воздуха и крышкой, обезболивающий индукции камеры достаточно большой, чтобы соответствовать контейнер и носовой обтекатель, установленное на выходе газового шланга (рис 3).
    3. Работа в парах, чтобы сделать процедуру более эффективной и сократить время экспозиции животных в ИФ, ингаляции анестетика. Убедитесь, что один исследователь отвечает за открытие и замены стальное покрытие на клетке и крышке индукции камеры (обработчик 1 #) и их помощник отвечает за захват животного в трубке и транспорта на индукции камеры (обработчик # 2).
    4. Поместите клетку на плоской поверхности, и удалить внешнюю крышку. Приподнимите лоток подачи стали и медленно маневрировать трубку обогащению, так что параллельно сторонам каркаса и против задней части. Если необходимо, используйте объект маневрировать трубку обогащению, не открывая клетку, чтобы избежать перемешивания животное (ручкаR # 1).
    5. Если животное становится взволнованным и оставляет трубку, время, достаточное для животных, чтобы расслабиться и вновь поселиться в трубку (обработчика # 1).
    6. Медленно и намеренно поднять край крышки стали дальше всего от трубки обогащения, сохраняя другой конец в контакте с сепаратором. Сделать пространство, достаточное для пластиковой тары (обработчик # 2).
    7. Одним плавным, быстрым движением, нажмите на пластиковый контейнер возвышаться трубки по обогащению урана. Поддержание контакт контейнера с стороне клетки, захвата животное в трубе. Выполните шаги 4.1.6 и 4.1.7 как можно быстрее (обработчика # 2).
    8. Снимите лоток подачи стальной и дать пластиковую крышку контейнера с укротителем # 2 (обработчик 1 #). Вставьте пластиковую крышку между боковыми клетки и контейнером, вспоминая придатков захваченных животного в процессе. Не закрывать контейнер, так как это сделает следующий шаг сложнее (обработчик # 2).
  2. AnesthesАйова
    1. Убедитесь, что контейнер остается закрытым и транспортировки животного в индукции камеры. Быстро разместить животное в камере и снимите крышку контейнера одним движением жидкости (обработчик # 2). Откройте и сразу же заменить крышку индукции камеры (обработчик # 1).
    2. Включите потока изофлюрана к индукции камеры (5 л / мин) и контролировать животное на наличие признаков летаргии, после чего быстро скользят животное из трубки и контейнер, удаляя как с индукционной камеры для облегчения циркуляции газа.
    3. Когда крыса полностью под наркозом, переместите его рабочей поверхности и поместите на нос и рот в нос конуса (рис 3). Крыса полностью под наркозом, когда он не отвечает на силового ног крайнем случае.
    4. Поместите ветеринар вазелин глазной мази на глазах животного, чтобы предотвратить сухость и ссадины. Это важный шаг, как хлопок крыс имеют большие глаза, которые могут быть подвержены инфекции в случае травмы.
      5. <LI> Тщательно контролировать и поддерживать постоянную частоту дыхания и убедитесь, что нос животного остается в носовом конусе фитинга на протяжении всей процедуры. Регулировка скорости потока изофлуран соответствующим образом. Количество изофлуран анестезии необходимо каждое животное будет меняться.
    5. После процедуры можно вернуться животное в клетку и убедиться, что он восстанавливает полную мобильность и грудины лежачее положение.

5. Подготовка LCRT клеток для подкожного опухолевого образования

ПРИМЕЧАНИЕ: Один T-150 колбу LCRT (90% слияния) дает около 2 х 10 7 клеток. Стройте количество Т-150 колб, необходимых от общего числа клеток, необходимых. Семенной дополнительные колбы, чтобы обеспечить общее количество клеток, необходимых получают и для размещения клеток, утраченных в процессе подготовки и те, которые необходимы для дополнительных инъекций. Хранить клетки на льду, когда это возможно, чтобы продлить жизнеспособность клеток.

  1. Для уборки клетки, аспирация среды из колбы апD промывки клеток с 5 мл 1x PBS.
  2. Аспирируйте PBS, и инкубировали клетки с 2 мл трипсина 1х, пока клетки диссоциируют из колбы (~ 2 мин).
  3. Ресуспендируют клеток в 8 мл среды (в общей сложности 10 мл клеточной суспензии) и аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы разбить скопления клеток. Продолжайте собирать клетки от дополнительных колбах.
  4. Бассейн все клеточные суспензии в одну коническую трубку, примерно в 4 Т-150 в 50 мл коническую трубку.
  5. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  6. Аспирируйте средних и ресуспендируют осадок клеток в соответствующий объем PBS (10 мл PBS на Т-150) с получением плотности клеток в счетной диапазоне с помощью гемоцитометра. Для обеспечения точного подсчета клеток, тщательно перемешать клеточной суспензии перед загрузкой гемоцитометр с помощью пипетки вверх и вниз.
  7. Рассчитать общее количество клеток:
    Общее количество собранных клеток = подсчета клеток (клеток / мл) х ресуспендирование объем (мл)
  8. ОпределятьОбъем клеточной суспензии требуется для всех инъекций. Сделайте 2-3 дополнительных доз в эксперименте. В общей сложности 5 × 10 5 клеток LCRT вводили подкожно образуют пальпируемых опухолей в течение 3-4 дней.
    Общее количество клеток, необходимых = 5 х 10 5 клеток х общего количества доз,
    Объем клеточной суспензии требуется (мл) = (общая клетки, необходимые * сумма объемов закачки) / (общее число клеток, полученных)
  9. Пипеткой необходимый объем клеточной суспензии в коническую пробирку, содержащую PBS и тщательно перемешать. Кратные отдельные инъекции (100 мкл) в пробирки Эппендорфа. Поддержание труб на льду во время процедуры инъекции.

6. Инъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуры с двух исследователей, один для выполнения инъекций, а остальные мониторы частота дыхания животного и общее состояние под наркозом. Используйте инсулиновые шприцы (29 г х 1/2 ", 0,3 мл) для всех инъекций и новой иглой длякаждое животное.

  1. Подкожные инъекции
    1. Захват и обезболить животное (раздел 4).
    2. Бритье место инъекции, используя ножницы. Хлопок крыса мех густой и требует резкого триммер, чтобы получить гладкую поверхность для инъекций. Очистите место инъекции 70% -ного этанола с помощью ватного тампона и дайте ему полностью испариться, прежде чем продолжить.
    3. Загрузка шприцы (29 г х 1/2 ", 0,3 мл) с клетками путем составления медленно и неуклонно. Если пузырьки видны фильм шприц с какой-либо силой. После того, как пузырьки в верхней толкать поршень до жидкости в верхней части иглы.
    4. Подтяжка кожи в месте инъекции (называется палаток кожи) и вставить иглу конической стороной вверх. Убедитесь, что игла движется свободно под кожу, чтобы избежать инъекций внутримышечно.
    5. Выгнать содержимое шприца равномерно и медленно. Извлеките иглу конической стороной вниз.
  2. Внутриопухолевых инъекции
    1. Захватбы обезболить животное (раздел 4).
    2. Очистите место инъекции 70% -ного этанола с помощью ватного тампона и дайте ему полностью испариться, прежде чем продолжить.
    3. Загрузка шприцы (29 г х 1/2 ", 0,3 мл) с вирусом посевного путем составления медленно и неуклонно, удерживая иглу в вертикальном положении. Если пузырьки видны фильм шприц с какой-либо силой. После того, как пузырьки в верхней нажатием затем плунжера, пока жидкость не находится в верхней части иглы.
    4. Вставить иглу конической стороной вверх в опухоль и удалить содержимое шприца равномерно и медленно при перемещении иглы в веерообразной модели, частично извлечение иглы перед каждым движением, чтобы предотвратить рваные раны опухоли. Извлеките иглу конической стороной вниз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: подкожные опухоли LCRT быстро растет, достигая примерно 100 мм 3 в течение 5-7 дней. Кроме того, некротические и геморрагические центров часто образуют на поверхности опухоли в течение нескольких дней и требуют CAreful мониторинг (Рисунок 4).
  3. Внутрибрюшинные инъекции
    1. Захват и обезболить животное (раздел 4).
    2. Очистите место инъекции 70% -ного этанола с помощью ватных тампонов и дайте ему полностью испариться, прежде чем продолжить.
    3. Загрузка шприцы (29 г х 1/2 ", 0,3 мл) с препаратом путем составления медленно и неуклонно. Если пузырьки видны фильм шприц с какой-либо силой. После того, как пузырьки в верхней нажатием затем плунжера, пока жидкость не находится в верхней части иглы.
    4. Вставьте иглу в правом нижнем квадранте живота. Оттяните на поршень, чтобы гарантировать, что кровь или фекалии не отсасывали, это указывает на неправильное расположение иглы. Если это происходит, вывести иглы и подготовить новый шприц. Когда игла установлена ​​правильно, изгнать содержимое шприца равномерно и медленно.

7. удаления опухоли и Necropsy

  1. Сбор и очистить альл инструменты с 70% этанола до эвтаназии животного.
  2. Эвтаназии животное желаемым способом, CO 2 ингаляции (2 л / мин в течение 5-10 мин) рекомендуется. Осмотрите животное для каких-либо патологий в состоянии тела.
  3. Место животное в спинной лежачее положение на вскрытии борту и очистить животное с 70% этанола.
  4. Используйте пинцет, чтобы поднять кожу в нижней части живота. Вырезать через кожу и мышцы с помощью ножниц и сделать медиальной разрез, идущую по длине животного (анус до подбородка).
  5. Разрежьте грудной клетки, делая два надреза, один с боков до стороне грудной клетки и один по грудине, чтобы разоблачить сердце и легкие. Проверьте долях легких для любых метастазов 27,29.
  6. Осмотрите все органы для нарушений и записывать любые изменения по цвету, размеру и консистенции. Если необходимо, разрежьте органы с помощью скальпеля, чтобы изучить внутренние ткани. В частности, исследовать печень, почки, селезенка и желудочно-кишечный тракт,
  7. Проверьте лимфатические узлы метастазов и увеличение 27,29.
  8. Для сбора опухоль, чтобы боковые разрезы выше и ниже опухоли, так что кожа может быть отстранилась от тела с помощью пинцета. В то время как крепко держит кожу с помощью пинцета, использовать скальпель, чтобы тщательно удалить опухоль, сокращая между опухолью и дермы (рисунок 5).
  9. Сразу же место опухоли в маркированный контейнер 10% нейтральный буферный формалин.
  10. В зависимости от размера опухоли, позвольте 1-2 дней (≤ 2 мм, малый) или 5-6 дней (> 2 мм, большой) для фиксации перед приготовлением разделы для гистологического анализа (рисунок 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Из-за чрезвычайно возбудимой природе хлопковых крыс, будучи знакомы с использованием процедур и оптимизированные для снижения нагрузки животных облегчит их использование в качестве доклинической модели животных. Использование надлежащих методов обработки также позволит свести к минимуму риск для исследователя.

При использовании хлопковых хомяков крайне важно сохранять спокойствие. Крысы очень возбудимы и будет пытаться избежать их клетку. Использование в трубе обогащения и nestlets сведут к минимуму попыток побега. Рисунок 2 показывает оптимальную настройку клетки, чтобы помочь в поимке крысах, в том числе размещения трубки по обогащению урана. Кроме того, работа в маленькой комнате, если это возможно, чтобы помочь в улавливании. Если побег происходит, подождите животного, чтобы успокоиться и остаются неподвижными, а затем покрыть прозрачной емкости захвата или покрытия с руками в перчатках, соблюдая осторожность, чтобы не применять чрезмерную силу.

В отличие от мыши, крысы хлопка имеет удлиненную морду масHICH требует иного нос фитинг для доставки ингаляционных анестетиков. Рисунок 3 показывает носовой обтекатель, разработанную для установки надлежащим образом хлопковых крыс, и максимально доставку ИФ. Используя резиновую мембрану в качестве арматуры может привести к травме в нос крысы.

Если возможно получить отсева животных (тех, кто не нужен других исследователей, крысах или иным образом) на практике методы инъекции перед попыткой их на крысах. Это позволит исследователю получить знакомство с иглами и как безопасно обращаться с ними. Шприцы инсулиновые предлагается для инъекций в хлопковых крыс, как их кожа толстая и жесткая по сравнению с мышью. Тем не менее, большее иглы (21 г х 1 ') может быть использован для инъекции опухолевых клеток, чтобы избежать потери жизнеспособности клеток за счет клеток сдвига во время инъекции. Меры предосторожности должны соблюдаться, например, не резюмируя иглы и надлежащей утилизации в контейнер для острых предметов.

INJECции жизнеспособных опухолевых клеток является важным для правильного формирования опухоли. 1А показывает здорового монослой LCRT клеток, которые могут быть получены для инъекции в хлопковых крыс. По сравнению Фиг.1В показывает LCRT клеток, которые имеют низкую жизнеспособность и не должны быть использованы для инъекций. Важно, чтобы проверить жизнеспособность опухолевых клеток с использованием способа, такого как окрашивания трипановым синим при подсчете клеток для инъекций.

Опухоли, сформированные из LCRT клеток быстрорастущих и некротические центры часто формируют (рис 4а). Таким образом, формирование опухоли должны находиться под тщательным наблюдением, чтобы избежать язвы (рис 4б). Если язвы происходит животное должно быть принесено в жертву, чтобы избежать инфекции и возможной смерти от сепсиса.

Эффекты противоопухолевых лечения часто лучше исследовали с помощью гистологического анализа. Это требует иссечение сообщению опухоль вскрытии. Сохранение целостности опухолевой ткани будет ресии в образце, который является более точным представлением опухоли в живом организме. 5 показан метод вырезания с помощью которого опухоль тщательно отделен от окружающих тканей с использованием скальпель и пинцет. Удаление опухоли, потянув его силой от окружающей ткани с помощью пинцета может привести к разрыву опухоли или нарушения целостности опухолевой ткани, влияя надлежащего гистологического анализа. Плотной и насыщена сосудами структура опухоли, как показано на рисунке 6, поддерживается с помощью этого метода вырезания. Это важно при анализе лечения, которые влияют на кровоснабжение опухоли, как это имеет место со многими ОВС.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Яркий поля-микроскопическое изображение LCRT клеток () Фенотип здоровым (~ 90% жизнеспособных) LCRT клетки, готовые для подготовки к инъекции в крысах. (B) Нежелательно фенотип LCRT клеток не подходят для инъекций. Закругленные клетки мертвы или умирают (показано стрелкой). Изображения были получены в 10-кратным увеличением; Шкала бар = 1 мм.

Фиг.2
Рисунок 2: Пример установки сепаратора для облегчения захвата хлопковых крыс Оптимальное размещение обогащения трубки с конца клетки и включение nestlets СПИДа в захвате животного..

Рисунок 3
Рисунок 3:. Анестезия носовой конус Место доставки изофлюрана анестезированным крысах Изготовитель носовой конус подходит удлиненный морду хлопковых крыс, чтобы обеспечить точную доставку ИФ газа без травмы носа.

Рисунок 4:. Некротических тканей на подкожной опухоли LCRT () на ранних стадиях некроза опухолевой ткани. Животное должно тщательно контролироваться, чтобы избежать прогрессирования до (B) полностью открытом язв. Животное должно быть принесено в жертву, если опухолевые ulcerates как инфекции и сепсиса может привести.

Рисунок 5
Рисунок 5:. Удаление подкожного опухоли LCRT для гистологии подкожной опухоли на фланге хлопковых крыс, осторожно удаляют с поверхности кожи с помощью скальпеля, чтобы сохранить целостность тканей опухоли, обеспечивая тем самым лучшее представление архитектуры опухоли для гистологического анализа.

Рисунок 6 Рис. 6: раздел Гистологическое ткани из подкожной опухоли LCRT Морфология LCRT опухолевой ткани исследовали с помощью парафин срезах, окрашенных гематоксилином и эозином (H & E). Снимок был сделан в 20х увеличении; Шкала бар = 1 мм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7 (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254 (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78 (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63 (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11 (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8 (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26 (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66 (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20 (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88 (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14 (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62 (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12 (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110 (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30 (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74 (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76 (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12 (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78 (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17 (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222 (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13 (1), 123 (2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16 (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369 (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22 (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19 (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5 (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).

Tags

Вирусологии выпуск 93 хлопок крыса онколитический вирус обработка животных крупного рогатого скота типа герпеса 1
Обращение с хлопковых крыс в исследованиях для доклинических оценки онколитических вирусов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cuddington, B., Verschoor, M.,… More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter