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Medicine

Manejo de la rata del algodón en Estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

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Virus oncolíticos (OV) se replican selectivamente en las células tumorales mediante la explotación de las diferencias bioquímicas entre células normales y tumorales 1,2. Hay dos tipos de VO: aquellos que no requieren una mutación para lograr oncolisis selectivo, denominado naturales virus de tipo salvaje y aquellas que deben ser diseñados para lograr oncolisis selectiva. La colección de mutaciones dentro de un tipo de tumor dado determina la naturaleza de la ventaja de crecimiento selectiva sobre las células normales para un OV 2. La seguridad y el beneficio de utilizar VO se ha demostrado en ensayos clínicos 3-7. A pesar de los avances en el campo de la virotherapy oncolítico existen brechas entre los resultados preclínicos y clínicos, lo que sugiere que se necesitan mejores modelos para evaluar la eficacia antitumoral de VO.

Virus del herpes bovino tipo 1 (BHV-1) es un miembro de la familia Herpesviridae, subfamilia y Alphaherpesviridae. BHV-1 iniates bovina complejo de la enfermedad respiratoria en ganado, que se manifiesta en una amplia variedad de síntomas similares a un resfriado 8,9. BHV-1 se une a receptores de fijación y de entrada utilizados por HSV-1, tales como el sulfato de heparán y nectin-1 10. Sin embargo, se une CD155 en el lugar de nectin-2 10. BHV-1 tiene una gama de huéspedes muy estrecha de tal manera que es incapaz de entrar e iniciar eficazmente la replicación en células murinas normales y transformadas 3,4,10. Esto hace que el uso de modelos murinos convencionales problemático. La capacidad oncolítico del BHV-1 se ha demostrado in vitro 11,12. BHV-1 se ha demostrado para iniciar la replicación en y matar células tumorales humanas de una variedad de orígenes histológicos, incluyendo las células de cáncer de mama y el cáncer de mama células iniciar 11,12. Sin embargo, la capacidad antitumoral de BHV-1 debe ser evaluado in vivo en el contexto de un huésped inmunocompetente.

Adenovirus humano (Ad), para lo cualhay 57 serotipos identificados, más comúnmente causa enfermedades respiratorias en los seres humanos. Vectores de Ad oncolíticos han sido evaluados por su eficacia antitumoral con varios avanzar en ensayos clínicos 13-15. A pesar de los datos pre-clínicos prometedores, los resultados clínicos han estado a la altura de las expectativas. Modelos de xenoinjertos de tumores humanos se suelen utilizar para estudiar la eficacia antitumoral de vectores de anuncios, aunque presentan atenúan la respuesta inmune al virus 16,17. Además, los modelos murinos singénicos no son permisivas a la infección del anuncio, por lo que la evaluación de las respuestas inmunitarias del huésped que utilizan estos modelos impracticables 17,18.

El sistema inmune del huésped ha sido identificado como el mecanismo más influyente por el cual VO provocan la muerte de las células tumorales 19. Respuestas antitumorales entre tolerizado y el antígeno asociado a tumor no tolerizado modelos (TAA) son diferentes y pueden afectar en gran medida el éxito de la terapia OV. El HSV-1 OV KM100 (ICP0 n212VP16 en 1814 20) 20,21 provocó la regresión del tumor en el 80% de los ratones portadores de tumor en un modelo de cáncer mamario de antígeno T medio del polioma murino 22. Sin embargo, en HER-2 modelos / neu, la eficacia antitumoral de KM100 varió entre el 20% de regresión completa en ratones singénicos y estasis del tumor en ratones transgénicos, los ratones HER2 hacer tolerante. En conjunto, estos datos ponen de relieve la importancia de evaluar plenamente VO utilizando modelos animales que mejor se recapitulan el paisaje inmunológico humano para entender completamente qué características determinan el éxito terapéutico.

La rata algodonera (Sigmodon hispidus), indígena de Norte y Sur América, es más comúnmente utilizado como un modelo de infección por el virus sincitial respiratorio (tal como fue revisado en 5). Ratas del algodón también se utilizan en-BHV-1 Investigación de la vacunación contra, ya que recapitulan la patología asociada con la enfermedad respiratoria bovina complejo 6,23. Además, BHV-1 infección de ratas del algodónes inmunogénica, la inducción de la mucosa sostenido y respuestas inmunes sistémicas 6,23-25. Las líneas celulares se han derivado de fibrosarcoma espontánea y osteosarcomas de la glándula mamaria (LCRT) y el hueso (CCRT y VCRT), respectivamente 26. Ratas del algodón se han utilizado para evaluar la eficacia in vivo de vectores de Ad oncolíticos, ya que son susceptibles a la infección por Ad y exhiben patología similar a los seres humanos 27-29. El uso de modelos inmunocomprometidos para la evaluación preclínica de VO no sólo son menos indicativo de una respuesta clínica a la terapia pero no tienen en cuenta el papel del sistema inmune en virotherapy oncolítico 30,31. Por lo tanto, los modelos de rata de algodón tolerantes a tumores de carcinoma mamario y osteosarcoma singénico y son modelos pertinentes en los cuales evaluar la eficacia pre-clínica de VO, tales como BHV-1 y Ad que no puede ser estudiada usando modelos murinos convencionales.

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Protocol

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NOTA: Los protocolos utilizados han sido aprobados por nuestro Consejo de Ética de Investigación de Animales institucional de la Universidad McMaster de acuerdo con Consejo Canadiense de Cuidado de Animales Directrices. Los experimentos se realizaron en las instalaciones de la Universidad de McMaster Animal Central.

1. cultivar células LCRT

  1. Células LCRT cultivo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Mantener las células en frascos de cultivo de tejido T-150 a 37 ° C y 5% de CO 2. Células Passage cuando forman una monocapa 90% de confluencia (cada 2-3 días, Figura 1).
  2. Pre-caliente 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x tripsina y medio en un 37 ° C baño de agua durante 10 min antes de la división de las células.
  3. Aspirar medio del matraz y enjuagar las células con 5 ml de PBS 1x.
  4. Después de enjuagar, aspirar PBS e incubarcélulas con 2 ml de 1x tripsina hasta que las células se disocian del matraz (~ 2 min).
  5. Resuspender las células en 8 ml de medio (para un total de 10 ml de suspensión celular) y suavemente pipeta arriba y abajo para romper los grumos de células.
  6. Mantener células en un matraz T-150 mediante la siembra de 1 ml de suspensión de células en un medio de 24 ml (para un total de 25 ml por T-150) y el frasco de roca suavemente de un lado a otro. Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta el próximo partido.

2. La evaluación de la replicación del virus y la citotoxicidad en células LCRT

  1. La replicación del virus
    NOTA: virus de constructos que expresan un marcador fluorescente, como la proteína verde fluorescente (GFP), bajo el control de promotores virales endógenos facilitar la visualización de la infección y propagación del virus usando lectores de placas de fluorescencia.
    1. Semilla células LCRT en placas de cultivo, dejando un pozo para el conteo. Células de semillas tales que serán 80-90% confluentes un día después. Utilice una concentración de 10 5 cells / ml (100 l por pocillo) para producir la confluencia deseada un día después en placas de 96 pocillos de fondo plano.
    2. El día siguiente, pre-caliente PBS 1x, 1x tripsina, medio completo y libre de suero en un baño de agua C 37 ° durante 10 min antes de iniciar el experimento.
    3. Aspirar medio de las contando bien y enjuague células con 5 ml de PBS 1x oscilando por encima de la superficie del pozo.
    4. Después de enjuagar, las células aspirado de PBS y se incuban con 2 ml de tripsina hasta que las células se disocian 1x del matraz (~ 2 min).
    5. Resuspender las células en el volumen apropiado de medio completo para dar una densidad celular dentro de la gama contable utilizando un hemocitómetro. Para asegurar un recuento celular exacto, mezclar bien la suspensión celular antes de la inoculación del hemocitómetro pipeteando arriba y abajo.
    6. Determinar el volumen del stock de virus necesaria para la infección en la multiplicidad deseada de infección (MOI).
      Requerido Paque Unidades Formadoras (pfu) = número de células sembradas * MOI(Pfu / célula)
      Volumen de reserva de virus requerido = pfu / virus requerida stock título (pfu / ml)
    7. Preparar inóculo de virus en medio libre de suero en tubos. Mezclar bien con un vórtex o pipetear antes de añadir el inóculo a las células.
    8. Infectar las células durante 1 hora a 37 ° C, después de lo cual se aplica un recubrimiento de mantenimiento de DMEM + 1% FBS.
    9. Placas de escaneo uno y después de la infección de dos días (pi) para visualizar la fluorescencia de GFP.
  2. La citotoxicidad Virus
    NOTA: Realizar el ensayo de citotoxicidad resazurina en condiciones de poca luz como el compuesto es fotosensible. Un medio que contenía solamente debe ser incluido para corregir la fluorescencia de fondo.
    1. Preparar una solución de resazurina 5% (v / v) en PBS 1x. Mezclar la solución con la pipeta.
    2. Aspirar medio de las células y se aplica la solución de resazurina 5%. Incluir un medio que contenía solamente para corregir la fluorescencia de fondo.
    3. Se incuban las células durante 30 min a 37 ° C, después deque lee la fluorescencia usando un lector de placas de fluorescencia (excitación 530 nm, emisión 595 nm).
    4. Analizar la información relativa a los controles no infectados corrección para el fondo de fluorescencia.

3. Vivienda y Manejo

  1. Vivienda y Dieta
    1. Las ratas del algodón Casa individual para disminuir las luchas internas en jaulas de ratas de policarbonato que contienen ropa de cama de roedores (1/8 "ropa de cama de mazorca de maíz), una sección de tubo de PVC no más de 8 pulgadas y nestlets como el enriquecimiento (Figura 2).
    2. Use una canasta de acero asegurable para sentarse overtop de la jaula y contener alimentos de roedores y una botella de agua.
      Nota: esta configuración permitirá jaula para la captura segura y fácil de los animales, con la colocación del tubo de enriquecimiento contra el extremo de la jaula de ser de la mayor importancia.
  2. Manejo
    1. Manejar las ratas del algodón de la mañana, antes de las rondas de los técnicos de las instalaciones de los animales para evitar emocionante antesun procedimiento.
    2. Durante todos los procedimientos, use guantes de cuero gruesos de protección.
    3. A medida que los animales permanecen principalmente en los tubos de enriquecimiento, los utilizan para transferir las ratas en una nueva jaula durante la limpieza de rutina. Alternativamente, abra la jaula ligeramente para permitir que el manejador de llegar en su mano, el animal puede entonces ser restringido por scruffing la piel justo por encima de los hombros y empujando hacia abajo. Cuidado de Práctica no utilizar fuerza excesiva ya que el animal puede morder la lengua.
    4. Sea paciente y utilizar una mano firme ya que los animales tienen una fuerte respuesta de huida o lucha y tratarán de evitar ser capturado por correr y saltar fuera de la jaula. Es importante destacar que no se ocupan de los animales por la cola como ocurrirá degloving.
    5. Trampa los animales en sus tubos enriquecimientos más de manipulación directa. Esto disminuye drásticamente las lesiones y escapar.

4. Captura y Anestesia

  1. Captura
    1. Use guantes de cuero gruesos para protegerion durante todos los procedimientos.
    2. Utilice un recipiente grande de plástico transparente con agujeros para el aire y una tapa, una cámara de inducción de anestesia lo suficientemente grande para encajar el recipiente y un cono de nariz montado en el tubo de salida de gas (Figura 3).
    3. Trabajar en parejas para hacer el procedimiento más eficiente y disminuir el tiempo de exposición de los animales al isoflurano, un anestésico de inhalación. Asegúrese de que un investigador es responsable de la apertura y la sustitución de la cubierta de acero de la jaula y la tapa de la cámara de inducción (controlador # 1) y su asociado es responsable de la captura del animal en el tubo y el transporte a la cámara de inducción (controlador # 2).
    4. Colocar la jaula en una superficie plana y quitar la tapa exterior. Levante la bandeja de alimentación de acero ligeramente y lentamente maniobrar el tubo de enriquecimiento de manera que quede paralelo con los lados de la jaula y contra la parte posterior. Si es necesario, utilizar un objeto para maniobrar el tubo de enriquecimiento sin necesidad de abrir la jaula para evitar agitar el animal (manejarr # 1).
    5. Si el animal se vuelve agitado y sale del tubo, dar tiempo suficiente para que el animal se relaje y una vez más se instalan en el tubo (manejador # 1).
    6. Lentamente y deliberadamente levantar el borde más alejado de la cubierta de acero del tubo de enriquecimiento, manteniendo el otro extremo en contacto con la jaula. Hacer un espacio lo suficientemente grande para que el recipiente de plástico (controlador # 2).
    7. En un movimiento suave y rápido, empuje el recipiente de plástico overtop del tubo de enriquecimiento. Mantener el contacto del recipiente con el lado de la jaula, atrapando el animal en el tubo. Realice los pasos 4.1.6 y 4.1.7 lo antes posible (manejador # 2).
    8. Retire la bandeja de alimentación de acero y dar la tapa de plástico contenedor al controlador # 2 (controlador # 1). Deslice la tapa de plástico entre el lado de la jaula y el contenedor, siendo consciente de apéndices del animal atrapado en el proceso. No selle el envase, ya que esto hará que el siguiente paso más difícil (manejador # 2).
  2. AnesthesIowa
    1. Asegúrese de que el contenedor permanece cerrado y el transporte de los animales a la cámara de inducción. Colocar rápidamente el animal en la cámara y retirar la tapa del recipiente en un movimiento fluido (controlador # 2). Abra y vuelva a colocar inmediatamente la tapa de la cámara de inducción (manejador # 1).
    2. Encienda el flujo de isoflurano a la cámara de inducción (5 L / min) y monitorear el animal para detectar signos de letargo, en cuyo punto se deslizan rápidamente el animal desde el tubo y el recipiente, la eliminación tanto de la cámara de inducción para facilitar la circulación de gas.
    3. Cuando la rata está totalmente anestesiado, moverlo a la superficie de trabajo y colocar la nariz y la boca en el cono de la nariz (Figura 3). La rata está totalmente anestesiado cuando no responde a una pizca dedo contundente.
    4. Coloque vaselina veterinario pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar la sequedad y abrasiones. Este es un paso esencial como las ratas del algodón cuentan con grandes ojos que pueden ser propensos a la infección si se produce una lesión.
    5. <li> monitorear cuidadosamente y mantener una tasa de respiración constante y asegúrese de que la nariz del animal permanece en la instalación durante todo el procedimiento cono de la nariz. Ajustar la velocidad de flujo de isoflurano adecuadamente. La cantidad de isoflurano requiere para anestesiar a cada animal variará.
    6. Después del procedimiento, devolver el animal a su jaula y asegúrese de que recupere la movilidad completa y decúbito esternal.

5. Preparación de las células LCRT para la formación de tumores subcutáneos

NOTA: Una T-150 frasco de LCRT (90% de confluencia) produce aproximadamente 2 x 10 7 células. Basar el número de T-150 frascos requeridos sobre el número total de células necesarias. Semillas frascos adicionales para asegurar el número total de células requerida se obtiene y para acomodar las células perdidas durante la preparación y los necesarios para inyecciones adicionales. Mantener las células en hielo siempre que sea posible para prolongar la viabilidad celular.

  1. Para cosechar las células, medio aspirado desde el un matrazd células enjuague con 5 ml de PBS 1x.
  2. Aspirar PBS e incubar las células con 2 ml de 1x tripsina hasta que las células se disocian del matraz (~ 2 min).
  3. Resuspender las células en 8 ml de medio (para un total de 10 ml de suspensión celular) y suavemente pipeta arriba y abajo para romper los grumos de células. Continuar para cosechar las células de los matraces adicionales.
  4. Piscina todo suspensiones de células en un tubo cónico, aproximadamente 4 T-150 por cada 50 ml tubo cónico.
  5. Centrifugar el tubo a 160 x g durante 10 min a 4 ° C.
  6. Aspirar medio y volver a suspender el sedimento celular en el volumen apropiado de PBS (10 ml de PBS por T-150) para producir una densidad celular dentro de la gama contable utilizando un hemocitómetro. Para asegurar un recuento celular exacto, mezclar bien la suspensión celular antes de cargar el hemocitómetro pipeteando arriba y abajo.
  7. Calcular el número total de células:
    Número total de células recogidas = recuento de células (células / ml) x resuspensión volumen (ml)
  8. Determinarel volumen de suspensión de células requerido para todas las inyecciones. Hacer 2-3 dosis adicionales por experimento. Un total de 5 x 10 5 células inyectadas subcutáneamente LCRT formará tumores palpables dentro de 3-4 días.
    Número total de células requeridas = 5 x 10 5 células x número total de dosis
    Suspensión de células volumen requerido (ml) = (células totales requeridos * suma de los volúmenes de inyección) / (número total de células recogidas)
  9. Pipetear el volumen requerido de la suspensión celular en un tubo cónico que contenía PBS y mezclar bien. Alícuotas inyecciones individuales (100 l) en tubos Eppendorf. Mantener los tubos en hielo durante el procedimiento de inyección.

6. Inyecciones

NOTA: Realizar procedimientos con dos investigadores, uno para realizar las inyecciones, mientras que los otros monitores de la tasa de respiración del animal y el estado general, mientras que bajo anestesia. Utilice jeringas de insulina (29 G x 2.1 ", 0.3 ml) para todas las inyecciones y una aguja nueva paracada animal.

  1. Las inyecciones subcutáneas
    1. Captura y anestesiar al animal (sección 4).
    2. Afeitar el sitio de la inyección usando las podadoras. Piel de rata algodón es gruesa y requiere un condensador de ajuste afilado para obtener una superficie lisa para inyecciones. Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70%, utilizando un hisopo de algodón y deje que se evapore antes de proceder.
    3. Jeringas de carga (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) con las células mediante la elaboración lenta y constantemente. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje el émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja.
    4. Levante la piel en el lugar de la inyección (denominado persistencia del pliegue cutáneo) e inserte el bisel de la aguja hacia arriba. Asegúrese de que la aguja se mueve libremente debajo de la piel para evitar la inyección intramuscular.
    5. Expulsar el contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente. Retirar el lado bisel de la aguja hacia abajo.
  2. Inyecciones intratumorales
    1. Captura de unad anestesiar al animal (sección 4).
    2. Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70%, utilizando un hisopo de algodón y deje que se evapore antes de proceder.
    3. Jeringas de carga (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) con el inóculo de virus mediante la elaboración lenta y constantemente mientras se mantiene la aguja en posición vertical. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje entonces émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja.
    4. Insertar el lado bisel de la aguja hacia el tumor y expulsar el contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente mientras se mueve la aguja en un patrón en forma de abanico, retirando parcialmente la aguja antes de cada movimiento para evitar laceración del tumor. Retirar el lado bisel de la aguja hacia abajo.
      NOTA: Los tumores subcutáneos son LCRT, alcanzando aproximadamente 100 mm 3 en 5-7 días de rápido crecimiento. Además, los centros necróticos y hemorrágicos a menudo se forman en la superficie del tumor dentro de varios días y requieren camonitoreo REFUL (Figura 4).
  3. Las inyecciones intraperitoneales
    1. Captura y anestesiar al animal (sección 4).
    2. Limpie el sitio de la inyección con etanol al 70% utilizando hisopos de algodón y deje que se evapore antes de proceder.
    3. Jeringas de carga (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) con la droga mediante la elaboración lenta y constantemente. Si las burbujas son evidentes película de la jeringa con un poco de fuerza. Una vez que las burbujas se encuentran en la parte superior de empuje entonces émbolo hasta que el líquido está en la parte superior de la aguja.
    4. Inserte la aguja en el cuadrante inferior derecho del abdomen. Tire hacia atrás del émbolo para asegurarse de que la sangre o las heces no son aspirados, esto indica una incorrecta colocación de la aguja. Si esto ocurre, retire la aguja y preparar una nueva jeringa. Cuando la aguja se coloca correctamente, expulsar contenido de la jeringa de manera uniforme y lentamente.

7. Tumor Escisión y Necropsia

  1. Recoger y limpiar all herramientas con etanol al 70% antes de la eutanasia del animal.
  2. La eutanasia a los animales por el método deseado, se recomienda inhalación de CO2 (2 l / min durante 5 a 10 minutos). Examine el animal para detectar cualquier anormalidad en la condición corporal.
  3. Colocar el animal en decúbito dorsal sobre una tabla de disección y limpiar el animal con etanol al 70%.
  4. Utilice las pinzas para levantar la piel en la parte inferior del abdomen. Corte a través de la piel y el músculo con unas tijeras y hacer una incisión medial que recorre la longitud del animal (ano a la barbilla).
  5. Cortar la caja torácica haciendo dos cortes, uno lateralmente por el lado de la caja torácica y uno a través del esternón para exponer el corazón y los pulmones. Examine los lóbulos del pulmón para cualquier metástasis 27,29.
  6. Examinar todos los órganos de anomalías y registrar cualquier cambio en el color, tamaño y consistencia. Si es necesario, los órganos incisión con un escalpelo para examinar los tejidos internos. Específicamente, examinar el hígado, los riñones, el bazo y el tracto gastrointestinal.
  7. Inspeccione los ganglios linfáticos de las metástasis y la ampliación 27,29.
  8. Para recoger el tumor, hacer incisiones flanco encima y debajo del tumor de tal manera que la piel puede ser arrancada del cuerpo con pinzas. Mientras sujeta firmemente la piel con pinzas, utilizar un bisturí para quitar cuidadosamente el tumor cortando entre el tumor y la dermis (Figura 5).
  9. Colocar inmediatamente el tumor en un recipiente etiquetado de 10% de formalina tamponada neutral.
  10. Dependiendo del tamaño del tumor, de 1-2 días (≤ 2 mm, pequeñas) o 5-6 días (> 2 mm, grande) para la fijación de las secciones antes de preparar para el análisis histológico (Figura 6).

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Representative Results

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Debido a la naturaleza extremadamente excitable de las ratas del algodón, estar familiarizado con y utilizar procedimientos optimizados para reducir el estrés de los animales facilitará en su uso como un modelo animal preclínico. El uso de técnicas de manejo adecuadas también reducirá al mínimo el riesgo para el investigador.

Al utilizar las ratas del algodón es imprescindible para mantener la calma. Las ratas son muy excitables y tratarán de escapar de su jaula. El uso de un tubo de enriquecimiento y nestlets minimizarán intentos de fuga. Figura 2 muestra la configuración óptima jaula para ayudar en la captura de las ratas del algodón, incluida la colocación del tubo de enriquecimiento. Además, trabajar en una pequeña habitación si es posible para ayudar en la recuperación. Si se produce fuga, esperar a que el animal para calmarse y permanecer inmóvil, luego cubrirlo con el contenedor de captura clara o cubra con las manos enguantadas, teniendo cuidado de no utilizar la fuerza excesiva.

En contraste con un ratón, la rata de algodón tiene un hocico alargado which requiere una nariz diferente ajuste para entregar el gas anestésico. La figura 3 muestra un cono de nariz diseñado para encajar correctamente una rata de algodón y maximizar la entrega de isoflurano. El uso de una membrana de goma como un accesorio puede resultar en trauma a la nariz de la rata.

Si es posible obtener animales de descarte (aquellos que no necesitan de otros investigadores, ratas de algodón o de otro tipo) para practicar las técnicas de inyección antes de intentar ellos en las ratas. Esto permitirá que el investigador para familiarizarse con las agujas y la forma de hacerlo en forma segura. Las jeringas de insulina se sugieren para inyecciones en las ratas del algodón como su piel es gruesa y resistente en comparación con un ratón. Sin embargo, una aguja más grande (21 G x 1 ') se puede utilizar para la inyección de las células tumorales para evitar la pérdida de viabilidad celular debido a la cizalladura de células durante la inyección. Precauciones de seguridad deben seguirse, como no volver a tapar las agujas y la eliminación adecuada en un contenedor de objetos punzantes.

El injecla de las células tumorales viables es importante para la formación de tumores apropiado. La Figura 1A muestra una monocapa sana de las células LCRT que pueden prepararse para la inyección en ratas del algodón. En comparación Figura 1B muestra células LCRT que tienen baja viabilidad y no debe utilizarse para inyecciones. Es importante para verificar la viabilidad celular del tumor usando un método tal como tinción con azul de tripano al contar las células para preparaciones inyectables.

Los tumores formados a partir de células LCRT son de rápido crecimiento y centros necróticos menudo forman (Figura 4A). Como tal, la formación del tumor debe ser monitoreado cuidadosamente para evitar la ulceración (Figura 4B). Si se produce ulceración el animal debe ser sacrificado para evitar la infección y la posible muerte por sepsis.

Los efectos de los tratamientos anti-tumorales son a menudo mejor examinaron mediante un análisis histológico. Esto requiere la extirpación del tumor puesto mortem. El mantenimiento de la integridad del tejido tumoral se resULT en una muestra que es una representación más precisa del tumor in vivo. La Figura 5 muestra una técnica de escisión por la que el tumor se separa cuidadosamente del tejido circundante usando un bisturí y pinzas. Extracción del tumor tirando de ella por la fuerza del tejido circundante utilizando pinzas puede romper el tumor o interrumpir la integridad del tejido tumoral, afectando el análisis histológico adecuado. La estructura densa y altamente vascularizado del tumor, como se ve en la Figura 6, se mantiene mediante esta técnica escisión. Esto es importante en el análisis de los tratamientos que afectan a la vasculatura del tumor, como es el caso con muchos VO.

Figura 1
Figura 1:. Imagen de microscopía de campo claro de células LCRT (A) Fenotipo de salud (~ 90%) las células viables LCRT listos para la preparación para la inyección en ratas del algodón. (B) fenotipo indeseable de células LCRT no es apta para la inyección. Células redondeadas están muertos o moribundos (indicado por una flecha). Las imágenes fueron capturadas en un aumento de 10X; barra de escala = 1 mm.

Figura 2
Figura 2: Ejemplo de configuración de jaula para facilitar la captura de las ratas del algodón colocación óptima de tubo de enriquecimiento contra el extremo de la jaula y la inclusión de auxiliares nestlets en la captura animal..

Figura 3
Figura 3:. Apropiado para la entrega de isoflurano a ratas anestesiadas algodón Anestesia cono de la nariz Fabricado nariz cono encaja hocico alargado de rata del algodón para garantizar la entrega precisa de gas isoflurano sin trauma en la nariz.

"Figura Figura 4:. El tejido necrótico en un tumor LCRT subcutánea (A) primeras etapas de la necrosis del tejido tumoral. El animal debe ser vigilada cuidadosamente para evitar la progresión a (B) ulceración completamente abierta. El animal debe ser sacrificado si se ulcera tumorales como la infección y la sepsis pueden resultar.

Figura 5
Figura 5:. Escisión de un tumor LCRT subcutánea para histología El tumor subcutáneo en el flanco de una rata de algodón se retira cuidadosamente de la piel con un bisturí para mantener la integridad del tejido tumoral, proporcionando así una mejor representación de la arquitectura del tumor para el análisis histológico.

Figura 6 Figura 6:. Sección de tejido histológico de un tumor LCRT subcutánea La morfología del tejido tumoral LCRT examinó utilizando secciones incluidas en parafina teñidas con hematoxilina y eosina (H & E). La imagen fue capturada en 20 aumentos; barra de escala = 1 mm.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

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References

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Manejo de la rata del algodón en Estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos
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Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

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