Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Hantering av Cotton Rat i studier för Preklinisk utvärdering av onkolytisk virus

doi: 10.3791/52232 Published: November 24, 2014

Introduction

Onkolytiska virus (OV) selektivt replikera i tumörceller genom att utnyttja biokemiska skillnader mellan normala och tumörceller 1,2. Det finns två typer av OVS: de som inte kräver en mutation för att uppnå selektiv onkolys, kallat naturligt förekommande vildtyp virus och sådana som måste konstrueras för att uppnå selektiv onkolys. Insamlingen av mutationer inom en given tumörtyp bestämmer vilken typ av selektiv tillväxtfördel över normala celler för en OV 2. Säkerheten och nyttan av att använda OVS har påvisats i kliniska prövningar 3-7. Trots framsteg inom området för onkolytisk virotherapy finns det luckor mellan prekliniska och kliniska resultat, vilket tyder på att bättre modeller behövs för att utvärdera antitumör effekten av OVS.

Bovint herpesvirus typ 1 (BHV-1) är en medlem av Herpesviridae familjen, och Alphaherpesviridae underfamilj. BHV-1 initiates bovina luftvägsinfektioner komplex i boskap, manifesterar sig i en mängd olika symptom som liknar en dålig kall 8,9. BHV-1 binder fäst och inträdes receptorer används av HSV-1, såsom heparansulfat och nectin-1 10. Men binder CD155 i stället för nectin-2 10. BHV-1 har en mycket smal värdområde så att den inte kan effektivt komma in och initiera replikering i normala och transformerade murina celler 3,4,10. Detta gör användningen av konventionella musmodeller problematisk. Den onkolytiska förmåga hos BHV-1 har visats in vitro 11,12. BHV-1 har visat att initiera replikering i och döda humana tumörceller från en mängd olika histologiska ursprung, inklusive bröstcancerceller och bröstcancer initierande celler 11,12. Emellertid måste det antitumörkapacitet hos BHV-1 utvärderas in vivo inom ramen för en immunkompetent värd.

Humant adenovirus (Ad), för vilkenDet finns 57 identifierade serotyper, oftast orsakar respiratorisk sjukdom hos människor. Onkolytisk Ad vektorer har utvärderats för sin antitumör effekt med flera avancera in i kliniska prövningar 13-15. Trots lovande prekliniska data, har kliniska resultat nått upp till förväntningarna. Mänsklig tumör xenograft modeller används vanligtvis för att studera antitumör effekten av Ad-vektorer, även om de uppvisar försvagat immunsvar mot viruset 16,17. Dessutom syngena musmodeller är icke tillåtna att Ad-infektion, vilket gör utvärdering av värdimmunsvar som använder dessa modeller opraktiska 17,18.

Värdens immunsystem har identifierats som den mest inflytelserika mekanism genom vilken OVS framkallar tumörcelldöd 19. Antitumörsvar mellan toleransstimulerade och icke-toleransstimulerade tumörassocierat antigen (TAA) modeller skiljer och kan kraftigt påverka framgången för OV terapi. HSV-1 OV KM100 (ICP0 n212VP16 1814 20) 20,21 framkallade tumörregression i 80% av tumörbärande möss i en mus Polyoma Mellanöstern T-antigen bröstcancer modell 22. Men i HER-2 / neu-modeller, antitumör effekten av KM100 varierade mellan 20% färdigt regression i syngena möss och tumör stasis i transgena, HER2-toleranta möss. Tillsammans har dessa uppgifter betona vikten av fullt utvärdera OVS använder djurmodeller som bäst sammanfatta människans immun landskapet till fullo förstå vilka funktioner bestämmer terapeutisk framgång.

Bomulls råtta (Sigmodon hispidus), infödda på Nord- och Sydamerika, används oftast som en modell av respiratory syncytial virus infektion (som ses i 5). Bomulls råttor används också i anti-BHV-1 vaccination forskning som de rekapitulera patologin associerad med bovin respiratorisk sjukdom komplex 6,23. Vidare, BHV-1 infektion i bomullsråttorär immunogent, förmå ihållande mucosal och systemiska immunsvar 6,23-25. Cellinjer har härletts från spontana fibrosarkom och osteosarkom av bröstkörteln (LCRT) och ben (CCRT och VCRT), respektive 26. Bomullsråttor har använts för att utvärdera effektiviteten av onkolytiska Ad-vektorer in vivo eftersom de är mottagliga för Ad-infektion och uppvisar en liknande patologi till människor 27-29. Användningen av nedsatt immunförsvar modeller för preklinisk utvärdering av OVS är inte bara mindre tecken på kliniska svar på terapi men de misslyckas med att ta hänsyn till den roll i immunsystemet i onkolytiskt virotherapy 30,31. Därför syngena och tumör toleranta bomullsråttmodeller av bröstkarcinom och osteosarkom är relevanta modeller i vilka för att utvärdera för-kliniska effekten av OVS, såsom BHV-1 och Ad som inte kan studeras med användning av konventionella musmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: De protokoll som används har godkänts av vår institutionella Animal Research Ethics Board vid McMaster University enligt kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer. Experiment utfördes vid McMaster University Central Animal Facility.

1. Odling LCRT Celler

  1. Kultur LCRT celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 pg / ml streptomycin. Behåll celler i T-150 vävnadsodlingsflaskor vid 37 ° C och 5% CO2. Passage celler när de bildar en 90% sammanhängande monoskikt (var 2-3 dagar, figur 1).
  2. Pre-varm 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 1x trypsin och medium i ett 37 ° C vattenbad i 10 min före dela cellerna.
  3. Aspirera medium från kolven och skölj celler med 5 ml 1 x PBS.
  4. Efter sköljning, aspirera PBS och inkuberaceller med 2 ml 1x trypsin tills cellerna dissocieras från kolven (~ 2 min).
  5. Resuspendera cellerna i 8 ml medium (för totalt 10 ml cellsuspension) och försiktigt pipettera upp och ned för att bryta upp klumpar av celler.
  6. Behåll cellerna i en T-150-kolv genom ympning 1 ml cellsuspension i 24 ml medium (för totalt 25 ml per T-150) och rock kolv försiktigt från sida till sida. Behåll cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 tills nästa split.

2. Bedöma Virus Replication och cytotoxicitet i LCRT Cells

  1. Virus Replication
    OBS: Virus konstruktioner som uttrycker ett fluorescerande tagg, såsom grönt fluorescerande protein (GFP), under kontroll av endogena viruspromotorer underlättar visualisering av virusinfektion och sprids med hjälp av fluorescens plattläsare.
    1. Seed LCRT celler i odlingsplattor, som lämnar en väl för räkning. Seed celler så att de kommer att vara från 80 till 90% konfluenta en dag senare. Använd en koncentration av 10 5 cells / ml (100 | il per brunn) för att producera den önskade konfluens en dag senare i 96-brunnars flatbottnade plattor.
    2. Nästa dag, pre-warm 1 x PBS, 1x trypsin, komplett och serumfritt medium i en 37 ° C vattenbad i 10 min före start av experimentet.
    3. Aspirera medium från uppräkningsverksam- väl och skölj celler med 5 ml av 1 x PBS genom att gunga den över ytan av brunnen.
    4. Efter sköljning, aspirera PBS och inkubera celler med 2 ml 1x trypsin tills cellerna avstånd från kolven (~ 2 min).
    5. Resuspendera cellerna i lämplig volym av komplett medium för att ge en celltäthet inom uppräknelig intervall med hjälp av en hemocytometer. För att säkerställa en korrekt celltal, grundligt blanda cellsuspensionen före inokuleringen av hemocytometer genom att pipettera upp och ned.
    6. Bestäm volymen av virusförråds krävs för infektion vid önskad multiplicitet av infektion (MOI).
      Obligatorisk Paque Forming Units (pfu) = antal strukna cellerna * MOI(Pfu / cell)
      Volym virus lager krävs = obligatoriskt pfu / virus lager titer (PFU / ml)
    7. Förbered virus inokulat i serumfritt medium i tuber. Blanda noggrant genom att vortexa eller pipettering innan du lägger inokulat till cellerna.
    8. Infektera celler under 1 h vid 37 ° C, varefter tillämpa en underhållslagring av DMEM + 1% FBS.
    9. Skannings plattorna en och två dagar efter infektion (pi) för att visualisera GFP fluorescens.
  2. Virus Cytotoxicitet
    OBS: Utför resazurin cytotoxicitetsanalysen i svag belysning som föreningen är ljuskänsliga. En väl innehållande medium endast bör ingå för att korrigera för bakgrundsfluorescens.
    1. Bered en 5% (volym / volym) lösning av resazurin i 1x PBS. Blanda lösningen genom pipettering.
    2. Sug medium från celler och tillämpa resazurin lösningen 5%. Inkludera en brunn som innehåller enbart medium för att korrigera för bakgrundsfluorescens.
    3. Inkubera cellerna under 30 min vid 37 ° C, eftersom läste fluorescensen med användning av en fluorescensplattläsare (excitation 530 nm, emission 595 nm).
    4. Analysera data i förhållande till oinfekterade kontroller korrigera för bakgrundsfluorescens.

3. Bostäder och Hantering

  1. Bostäder och kost
    1. Hus bomullsråttor individuellt minska i-striderna i polykarbonat råttburar innehåller gnagare sängar (1/8 "majskolv sängkläder), ett avsnitt av PVC-slang inte längre än 8 inches och nestlets som berikning (Figur 2).
    2. Använd en fästbar stålkorg att sitta overtop av buren och innehåller gnagare mat och en vattenflaska.
      OBS: Denna bur inställning kommer att möjliggöra säker och enkel avskiljning av djuren, med placeringen av anrikningsröret mot slutet av buren är av yttersta vikt.
  2. Hantering
    1. Handtag bomullsråttor på morgonen, innan rundor av djuranläggningar tekniker för att undvika spännande dem innanen procedur.
    2. Under alla förfaranden, bär tjocka läderhandskar för skydd.
    3. Som djuren kvar främst i anrikningsrören, använda dem för att överföra råttorna i en ny bur under rutinmässig rengöring. Alternativt, öppna buren något för att göra det möjligt för föraren att nå sin hand i, kan djuret sedan tillbaka av scruffing huden strax ovanför axlarna och trycka ner. Öva att inte använda för mycket kraft som djuret kan bita sin tunga.
    4. Ha tålamod och använd en stadig hand som djuren har en stark flygning-eller-kampen svar och kommer att försöka undvika fångst genom att köra och hoppa ut ur buren. Viktigt inte hanterar djuren i svansen som degloving kommer att inträffa.
    5. Trap djuren i sina anrik tuber över direkt hantering. Detta minskar drastiskt skador och flyr.

4. Fånga och anestesi

  1. Capture
    1. Bär tjocka läderhandskar för skyddsion under alla procedurer.
    2. Använd en stor klar plastbehållare med hål för luft och ett lock, ett anestetiskt induktionskammare stor nog att passa på behållaren och en noskon monteras på gasutmatningen slangen (Figur 3).
    3. Arbeta i par för att göra förfarandet effektivare och för att minska exponeringstiden av djuren till isofluran, ett inhalationsanestetikum. Se en forskare ansvarar för öppning och byte av stållocket på buren och locket av induktionskammare (handler # 1) och deras associera ansvarar för infångning av djuret i röret och transport till induktionskammare (handler # 2).
    4. Placera buren på en plan yta och ta bort det yttre locket. Lyft matarstålbrickan något och sakta manövrera anrikning röret så det är parallellt med sidorna av buren och mot ryggen. Använd vid behov ett objekt att manövrera anrikningsröret utan att öppna buren för att undvika att agitera djuret (handtagr # 1).
    5. Om djuret blir upprörd och lämnar röret, ger tillräcklig tid för djuret att slappna av och återigen bosätta sig i röret (handler # 1).
    6. Långsamt och medvetet lyfta kanten av stållocket längst från anrikningsröret, att hålla den andra änden i kontakt med buren. Gör ett utrymme stort nog för plastbehållaren (hanterare # 2).
    7. I en jämn, snabb rörelse in plastbehållaren overtop av anrikningsröret. Bibehåll kontakt av behållaren med den sida av buren, att djuret fångas i röret. Utför steg 4.1.6 och 4.1.7 så snabbt som möjligt (hanterare # 2).
    8. Ta stålkassetten och ge plastbehållaren locket till handler # 2 (handler # 1). Skjut plastlocket mellan sidan av buren och behållaren, att vara uppmärksam på den fångade djurets bihang i processen. Täta inte behållaren eftersom detta kommer att göra nästa steg svårare (handler # 2).
  2. Anesthesia
    1. Kontrollera att behållaren förblir stängd och transportera djuret till induktionskammaren. Placera snabbt djuret i kammaren och ta bort locket behållaren i en flytande rörelse (handler # 2). Öppna och omedelbart ersätta locket induktionskammare (handler # 1).
    2. Slå på flödet av isofluran till induktionskammaren (5 l / min) och övervaka djuret efter tecken på letargi, vid vilken punkt snabbt glider djuret från röret och behållaren, avlägsna både från induktionskammaren för att underlätta gascirkulationen.
    3. När råttan är helt bedövad, flytta den till arbetsytan och placera näsan och munnen i noskonen (Figur 3). Råttan är helt bedövad när det inte svarar på en kraftfull tå nypa.
    4. Placera veterinär vaselin oftalmologiska salva på djurets ögon att förhindra torrhet och skrubbsår. Detta är ett viktigt steg som bomullsråttor har stora ögon som kan vara benägna att infektion om skada uppstår.
    5. <li> Noggrant övervaka och hålla en konstant andningsfrekvens och se till att djurets nos kvar i noskonen montering under hela förfarandet. Justera flödeshastigheten av isofluran på lämpligt sätt. Den mängd isofluran som krävs för att söva varje djur kommer att variera.
    6. Post-förfarande, tillbaka djuret till sin bur och se till att den återfår full rörlighet och sternala VILA.

5. Beredning av LCRT Celler för subkutan tumörbildning

OBS: En T-150-kolv av LCRT (90% konfluens) ger ca 2 x 10 7 celler. Basera antalet T-150 flaskor som krävs på det totala antalet celler som behövs. Seed extra flaskor för att säkerställa det totala antalet celler som krävs uppnås och att rymma celler förlorade under förberedelserna och de som behövs för extra injektioner. Håll celler på is när det är möjligt att förlänga cellernas livskraft.

  1. Att skörda celler, aspirera mediet från kolven end skölj celler med 5 ml 1 x PBS.
  2. Aspirera PBS och inkubera cellerna med 2 ml 1x trypsin tills cellerna dissocieras från kolven (~ 2 min).
  3. Resuspendera cellerna i 8 ml medium (för totalt 10 ml cellsuspension) och försiktigt pipettera upp och ned för att bryta upp klumpar av celler. Fortsätt att skörda celler från ytterligare kolvar.
  4. Pool alla cellsuspensioner i ett koniskt rör, ca 4 T-150s per 50 ml koniska rör.
  5. Centrifugera röret vid 160 x g under 10 min vid 4 ° C.
  6. Aspirera medium och resuspendera cellpelleten i lämplig volym av PBS (10 ml PBS per T-150) för att ge en celltäthet inom uppräknelig intervall med hjälp av en hemocytometer. För att säkerställa en korrekt celltal, grundligt blanda cellsuspensionen före laddning av hemocytometer genom att pipettera upp och ned.
  7. Beräkna det totala antalet celler:
    Totalt antal celler skörd = celler (celler / ml) x resuspendering volym (ml)
  8. Bestämvolymen av cellsuspension som krävs för alla injektioner. Gör 2-3 extra doser per försök. Totalt 5 x 10 5 LCRT celler injicerade subkutant bildar palpabla tumörer inom 3-4 dagar.
    Totalt antal celler som krävs = 5 x 10 5 celler x totala antalet doser
    Volym cellsuspension krävs (ml) = (totala celler krävs * summan av injektionsvolymer) / (totalt antal celler skördade)
  9. Pipettera önskad volym cellsuspension i en konisk rör innehållande PBS och blanda väl. Alikvotera enskilda injektioner (100 ^) i Eppendorf-rör. Behåll rören på is under injektionsproceduren.

6. Injektioner

OBS: Genomför förfaranden med två forskare, en för att utföra injektionerna medan andra bildskärmar djurets andningsfrekvens och allmäntillstånd under anestesi. Använd insulinsprutor (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) för alla injektioner och en ny nål förvarje djur.

  1. Subkutana injektioner
    1. Fånga och söva djuret (avsnitt 4).
    2. Raka injektionsstället med hjälp Clippers. Bomull råtta päls är tjock och kräver en skarp trimmer för att få en jämn yta för injektionsvätskor. Rengör injektionsstället med 70% etanol med en bomullspinne och låt den avdunsta helt innan du fortsätter.
    3. Last sprutor (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med cellerna genom att utarbeta långsamt och stadigt. Om bubblor är uppenbara snärt sprutan med lite kraft. När bubblorna är överst tryck kolven tills vätskan är på toppen av nålen.
    4. Lyft huden vid injektionsstället (kallas hud tälta) och stick in nålen avfasning uppåt. Kontrollera att nålen rör sig fritt under huden för att undvika att injicera intramuskulärt.
    5. Utvisa innehållet i sprutan jämnt och långsamt. Dra ut nålen avfasning nedåt.
  2. Intratumoral injektioner
    1. Fånga end söva djuret (avsnitt 4).
    2. Rengör injektionsstället med 70% etanol med en bomullspinne och låt den avdunsta helt innan du fortsätter.
    3. Last sprutor (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med viruset inokulatet genom att utarbeta långsamt och stadigt medan nålen innehav i ett upprätt läge. Om bubblor är uppenbara snärt sprutan med lite kraft. När bubblorna är överst tryck sedan kolven tills vätskan är på toppen av nålen.
    4. Sätt upp nålen avfasning sidan i tumören och utvisa innehållet i sprutan jämnt och långsamt medan nålen rör sig i en solfjäderliknande mönster, delvis dra tillbaka nålen före varje rörelse för att förhindra laceration av tumören. Dra ut nålen avfasning nedåt.
      OBS: Subkutan LCRT tumörer är snabbväxande, når ca 100 mm 3 i 5-7 dagar. Vidare nekrotiska och hemorragiska centra bildar ofta på ytan av tumören inom flera dagar och kräver careful övervakning (Figur 4).
  3. Intraperitoneala injektioner
    1. Fånga och söva djuret (avsnitt 4).
    2. Rengör injektionsstället med 70% etanol med hjälp bomullspinnar och låt det avdunsta helt innan du fortsätter.
    3. Last sprutor (29 G x 1/2 ", 0,3 ml) med läkemedlet genom att utarbeta långsamt och stadigt. Om bubblor är uppenbara snärt sprutan med lite kraft. När bubblorna är överst tryck sedan kolven tills vätskan är på toppen av nålen.
    4. Stick in nålen i den högra nedre kvadranten av buken. Dra tillbaka kolven för att se till att blod eller avföring inte aspireras, indikerar detta felaktiga placeringen av nålen. Om detta inträffar, dra nålen och förbereda en ny spruta. När nålen är rätt placerat, utvisa innehållet i sprutan jämnt och långsamt.

7. Tumör Excision och obduktion

  1. Samla och rengör all verktyg med 70% etanol före avlivning av djuret.
  2. Euthanize djuret med önskad metod, är CO2 inhalation (2 L / min i 5-10 min) rekommenderas. Undersök djuret för eventuella avvikelser i kondition.
  3. Placera djuret i rygg VILA på en dissektion styrelse och rengör djuret med 70% etanol.
  4. Använd pincett för att lyfta huden på nedre delen av magen. Skär genom huden och musklerna med sax och göra en medial snitt kör längden av djuret (anus till hakan).
  5. Skär bröstkorgen genom att göra två snitt, en i sidled upp på sidan av bröstkorgen och en över bröstbenet att exponera hjärtat och lungorna. Undersök lober i lungan för eventuella metastaser 27,29.
  6. Undersök alla organ för avvikelser och registrera eventuella förändringar i färg, storlek och konsistens. Om det behövs, incisionsfilm organ med en skalpell för att undersöka inre vävnader. Specifikt undersöka lever, njurar, mjälte och mag-tarmkanalen.
  7. Inspektera lymfkörtlarna för metastaser och utvidgningen 27,29.
  8. Att samla tumören, gör flank snitt över och under tumören så att huden kan dras bort från kroppen med pincett. Medan ordentligt håller huden med pincett, använd en skalpell för att försiktigt ta bort tumören genom att skära mellan tumören och dermis (Figur 5).
  9. Placera omedelbart tumören i en märkt behållare med 10% neutralt buffrat formalin.
  10. Beroende på storleken av tumören, tillåter 1-2 dagar (≤ 2 mm, små) eller 5-6 dagar (> 2 mm, stor) för fixering innan du förbereder sektioner för histologisk analys (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grund av den extremt lättretad natur bomullsråttor, som är bekant med och utnyttja förfaranden optimerade för att minska stressen hos djuren kommer att minska i deras användning som en preklinisk djurmodell. Användning av lämpliga hanteringstekniker kommer också minimera risken för forskaren.

Vid användning av bomullsråttor är det absolut nödvändigt att vara lugn. Råttorna är mycket lättretad och försöker fly sin bur. Användning av en anriknings rör och nestlets minimerar flyktförsök. Figur 2 visar optimal bur inställning till stöd i fångst av bomullsråttor, inklusive placering av anrikningsröret. Vidare arbetar i ett litet rum om möjligt för att underlätta återerövring. Om flykt inträffar, vänta på djuret för att lugna ner sig och förbli stillastående, sedan täcka den med den klara capture behållaren eller täck med handskar på händerna, försiktigt så att inte använda överdrivet våld.

I motsats till en mus, har studier på råtta en långsträckt nos wso m kräver en annan näsa passar för att leverera den anestesigas. Figur 3 visar en noskon konstruerad för att korrekt passa ett bomullsråtta och maximera leverans av isofluran. Med hjälp av en gummimembran som en passande kan resultera i trauma till näsan hos råttan.

Om möjligt få kasta fisk överbord djur (de som inte behövs av andra forskare, bomullsråttor eller på annat sätt) att öva injektionsteknik innan du försöker dem på råttorna. Detta gör det möjligt för forskaren att få förtrogenhet med nålar och hur man på ett säkert sätt hantera dem. Insulinsprutor föreslås för injektioner i bomullsråttor som deras hud är tjock och seg i jämförelse med en mus. Däremot kan en större nål (21 G x 1 ') användas för injektion av tumörceller för att undvika förlust av cellviabilitet grund av cell klippning under injektion. Säkerhetsåtgärder bör följas, till exempel inte recapping nålar och korrekt avfallshantering i en avfallsbehållare.

Den injecning av livskraftiga tumörceller är viktigt för korrekt tumörbildning. Figur 1A visar en hälsosam monolager av LCRT celler som kan framställas för injektion i bomullsråttor. I jämförelse Figur 1B visar LCRT celler som har låg lönsamhet och bör inte användas för injektioner. Det är viktigt att kontrollera tumör cellviabiliteten med användning av en metod såsom Trypan blå färgning när räkna celler för injektioner.

Tumörerna bildade från LCRT celler är snabbväxande och nekrotiska centra bildar ofta (Figur 4A). Som sådan bör tumörbildning övervakas noga för att undvika sår (Figur 4B). Om sår uppstår djuret ska offras för att undvika infektion och eventuell död från sepsis.

Effekterna av antitumörbehandlingar ofta bäst examineras genom histologisk analys. Detta kräver excision av tumören efter slakt. Att upprätthålla tumörvävnadsintegritet kommer result i ett prov som är en mer exakt representation av tumören in vivo. Figur 5 visar en excision teknik med vilken tumören försiktigt separeras från omgivande vävnad med hjälp av en skalpell och pincett. Ta bort tumören genom att dra den med våld från den omgivande vävnaden med pincett kan spricka tumören eller störa tumörvävnad integritet, påverkar ordentlig histologisk analys. Den täta och mycket vaskulariserade struktur av tumören, såsom framgår av fig 6, bibehålls genom denna utskärning teknik. Detta är viktigt vid analys av behandlingar som påverkar tumörvaskulatur, vilket är fallet med många OVS.

Figur 1
Figur 1:. Ljust fält mikroskopi bild av LCRT Cells (A) Fenotyp av friska (~ 90% livskraftiga) LCRT celler färdiga för förberedelse för injektion i bomullsråttor. (B) Oönskad fenotyp av LCRT celler inte passar för injektion. Rundade celler är döda eller döende (indikeras med en pil). Bilder fångades vid 10x förstoring; skala bar = 1 mm.

Figur 2
Figur 2: Exempel på bur inställning för enkel infångning av bomullsråttor Optimal placering av anriknings röret mot slutet av buren och integration av nestlets hjälpmedel i djur capture..

Figur 3
Figur 3:. Anesthesia noskon passande för leverans av isofluran till sövda bomullsråttor Tillverkad noskon passar långsträckt nos bomull råtta för att säkerställa korrekt leverans av isofluran gas utan trauma för näsan.

"Bild Figur 4:. Nekrotisk vävnad på en subkutan LCRT tumör (A) Tidiga stadier av nekros av tumörvävnad. Djuret ska övervakas noggrant för att undvika progression till (B) helt öppen sår. Djuret ska offras om tumör ulcerates som infektion och sepsis kan leda.

Figur 5
Figur 5:. Excision av en subkutan LCRT tumör för histologi Den subkutana tumören på flanken av en bomullsråtta tas försiktigt bort från huden med en skalpell för att upprätthålla tumörvävnadsintegritet, vilket ger en bättre representation av tumör arkitektur för histologisk analys.

Figur 6 Figur 6:. Histologisk vävnadssnitt från en subkutan LCRT tumör morfologi LCRT tumörvävnad undersöktes med användning av paraffininbäddade snitt färgade med hematoxylin och eosin (H & E). Bild fångades vid 20X förstoring; skala bar = 1 mm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium  Gibco 11965-092 May use any brand 
1X Phosphate Buffered Saline  Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine Gibco 25030164 May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic  Gibco 15240-062 May use any brand
Fetal bovine serum Quality Biological Inc. 110-001-101HI May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask Fisher Scientific 14-826-80 May use any brand
1X TypLE Express Life Technologies 12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom Fisher Scientific 08-772-29 May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue Life Technologies DAL1025 May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet Harlan  8640
1/8” corncob rodent bedding Harlan 7092
Nestlets Ancare - Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes Fisher Scientific 14-432-22 May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
70% Ethanol Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich HT501128 May use any brand
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) NAPCO Model used not currently available May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath Fisher Scientific Model used not currently available  May use any brand
Name Company Catalog Number Comments
Reichert Bright-line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629 May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer  GE Healthcare Life Sciences Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader Tecan Model used not currently available  May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge Beckman Coulter 366816 May use any brand
Table Top Anaesthesia machine VetEquip Model used not currently available  May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers Wahl May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL BD 329464 May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. 
Cotton swabs MedPro 018-425 May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 8940 May use any brand
Dissecting Tissue Forceps Fisher Scientific 13-812-41 May use any brand

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cervantes-Garcia, D., Ortiz-Lopez, R., Mayek-Perez, N., Rojas-Martinez, A. Oncolytic virotherapy. Ann Hepatol. 7, (1), 34-45 (2008).
  2. Vaha-Koskela, M. J., Heikkila, J. E., Hinkkanen, A. E. Oncolytic viruses in cancer therapy. Cancer Lett. 254, (2), 178-216 (2007).
  3. Abril, C., et al. Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor-deficient mice. J Virol. 78, (7), 3644-3653 (2004).
  4. Nakamichi, K., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Defective infection of bovine herpesvirus 1 in non-permissive murine cells. J Vet Med Sci. 63, (10), 1139-1142 (2001).
  5. Boukhvalova, M. S., Blanco, J. C. The cotton rat sigmodon hispidus model of respiratory syncytial virus infection. Curr Top Microbiol Immunol. 372, 347-358 (2013).
  6. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Induction of immunity in the respiratory tract and protection from bovine herpesvirus type 1 infection by different routes of immunization with recombinant adenovirus. Viral Immunol. 11, (2), 79-91 (1998).
  7. Hughes, T. C. R., Lilley, C. E., Ponce, R., Kaufman, H. L. Critical analysis of an oncolytic herpesvirus encoding granulocyte-macrophage colony stimulating factor for the treatment of malignant melanoma. Journal of Oncolytic Virotherapy. 3, 11-20 (2014).
  8. Jones, C., Chowdhury, S. A review of the biology of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1), its role as a cofactor in the bovine respiratory disease complex and development of improved vaccines. Anim Health Res Rev. 8, (2), 187-205 (2007).
  9. Jones, C., Chowdhury, S. Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is an important cofactor in the bovine respiratory disease complex. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 26, (2), 303-321 (2010).
  10. Hushur, O., Takashima, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H. Restriction of bovine herpesvirus 1 (BHV-1) growth in non-permissive cells beyond the expression of immediate early genes. J Vet Med Sci. 66, (4), 453-455 (2004).
  11. Cuddington, B. P., Dyer, A. L., Workenhe, S. T., Mossman, K. L. Oncolytic bovine herpesvirus type 1 infects and kills breast tumor cells and breast cancer-initiating cells irrespective of tumor subtype. Cancer Gene Ther. 20, (5), 282-289 (2013).
  12. Cuddington, B. P., Mossman, K. L. Permissiveness of Human Cancer Cells to Oncolytic Bovine Herpesvirus 1 Is Mediated in Part by KRAS Activity. J Virol. 88, (12), 6885-6895 (2014).
  13. Small, E. J., et al. A phase I trial of intravenous CG7870, a replication-selective, prostate-specific antigen-targeted oncolytic adenovirus, for the treatment of hormone-refractory, metastatic prostate cancer. Mol Ther. 14, (1), 107-117 (2006).
  14. Freytag, S. O., et al. Phase I study of replication-competent adenovirus-mediated double suicide gene therapy for the treatment of locally recurrent prostate cancer. Cancer Res. 62, (17), 4968-4976 (2002).
  15. Benjamin, R., Helman, L., Meyers, P., Reaman, G. A phase I/II dose escalation and activity study of intravenous injections of OCaP1 for subjects with refractory osteosarcoma metastatic to lung. Hum Gene Ther. 12, (12), 1591-1593 (2001).
  16. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), Available from: http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm 3-5 (1994).
  17. Tsai, J. C., Garlinghouse, G., McDonnell, P. J., Trousdale, M. D. An experimental animal model of adenovirus-induced ocular disease. The cotton rat. Arch Ophthalmol. 110, (8), 1167-1170 (1992).
  18. Ginsberg, H. S., et al. A mouse model for investigating the molecular pathogenesis of adenovirus pneumonia. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, (5), 1651-1655 (1991).
  19. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nat Biotechnol. 30, (7), 658-670 (2012).
  20. Mossman, K. L., Saffran, H. A., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 mutants are hypersensitive to interferon. J Virol. 74, (4), 2052-2056 (2000).
  21. Mossman, K. L., Smiley, J. R. Herpes simplex virus ICP0 and ICP34.5 counteract distinct interferon-induced barriers to virus replication. J Virol. 76, (4), 1995-1998 (2002).
  22. Hummel, J. L., Safroneeva, E., Mossman, K. L. The role of ICP0-Null HSV-1 and interferon signaling defects in the effective treatment of breast adenocarcinoma. Mol Ther. 12, (6), 1101-1110 (2005).
  23. Papp, Z., Middleton, D. M., Mittal, S. K., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. Mucosal immunization with recombinant adenoviruses: induction of immunity and protection of cotton rats against respiratory bovine herpesvirus type 1 infection. J Gen Virol. 78, (11), 2933-2943 (1997).
  24. Papp, Z., Babiuk, L. A., Baca-Estrada, M. E. The effect of pre-existing adenovirus-specific immunity on immune responses induced by recombinant adenovirus expressing glycoprotein D of bovine herpesvirus type 1. Vaccine. 17, (7-8), 933-943 (1999).
  25. Mittal, S. K., et al. Induction of systemic and mucosal immune responses in cotton rats immunized with human adenovirus type 5 recombinants expressing the full and truncated forms of bovine herpesvirus type 1 glycoprotein gD. Virology. 222, (2), 299-309 (1996).
  26. Steel, J. C., et al. Syngeneic Cotton Rat Cancer Model for Replicating Adenoviral Vectors. Molecular Therapy. 13, (1), 123 (2006).
  27. Toth, K., et al. Cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Hum Gene Ther. 16, (1), 139-146 (2005).
  28. Toth, K., Spencer, J. F., Wold, W. S. Immunocompetent, semi-permissive cotton rat tumor model for the evaluation of oncolytic adenoviruses. Methods Mol Med. 130, 157-168 (2007).
  29. Steel, J. C., et al. Immunocompetent syngeneic cotton rat tumor models for the assessment of replication-competent oncolytic adenovirus. Virology. 369, (1), 131-142 (2007).
  30. Workenhe, S. T., et al. Immunogenic HSV-mediated oncolysis shapes the antitumor immune response and contributes to therapeutic efficacy. Mol Ther. 22, (1), 123-131 (2014).
  31. Sobol, P. T., et al. Adaptive antiviral immunity is a determinant of the therapeutic success of oncolytic virotherapy. Mol Ther. 19, (2), 335-344 (2011).
  32. Prince, G. A. The Cotton Rat in Biomedical Research. Animal Welfare Information Center Newsletter. 5, (2), http://www.nal.usda.gov/awic/newsletters/v5n2/5n2princ.htm (1994).
Hantering av Cotton Rat i studier för Preklinisk utvärdering av onkolytisk virus
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).More

Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232, doi:10.3791/52232 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter