Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Метод Узловые ганглиев инъекций в Спрэг Dawley крыс

Published: November 25, 2014 doi: 10.3791/52233

Protocol

Все процедуры и протоколы были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Иллинойса в Чикаго. Эксперименты, описанные здесь, являются острые эксперименты, не выживания, и не было никакой пользы глазной мази. Поддержание стерильных условиях происходит только тогда, когда хирургические инструменты промывают 70% этанолом в DIH 2 O. Жертвоприношение крыс в конце эксперимента место с помощью передозировки IV кетамина / ксилазина.

1. Подготовка инструментов и химических веществ

  1. Подготовка исходного раствора 0,05 М 5-НТ HCl в PBS. Затем разбавленные запас с PBS до конечной концентрации 5-НТ в 0,203 мМ.
  2. Развести дронабинол в кунжутном масле в концентрации 20 мкг / мкл.
  3. Сокращение длиной 20 см из полиэтилена (ПЭ) -50 трубки (ID 0,58 мм, OD 0,965 мм). На одном конце трубки, сократить фаски наконечник с помощью ножниц, а на другом конце квадратный, вставить иглу 23 г. Подключите этот 23 г иглы в 1 млшприц, и заполнить его с 0,3 мл 50 ед / мл гепарина.
  4. Вырезать четыре части 4-0 плетеной шелковой нити и установите в сторону.
  5. Стерилизовать хирургические ножницы, 2 изогнутые Грефе пинцет и 3 микро зажимы с 70% этанола в DIH 2 O.

2. Катетеризация бедренной вены

Протокол катетеризации редактировался Jespersen и др. 21

  1. Обезболить крысу Sprague-Dawley с внутрибрюшинно (IP), кетамин / ксилазина (100 мг / кг: 10 мг / кг). Зажмите палец ноги крысы и наблюдать какое-либо движение, чтобы подтвердить надлежащий уровень анестезии. Бритье вентральной части левого бедра, и вентральной части шеи. При необходимости местный комитет Уходу за животными и использование, применять глазную мазь, чтобы предотвратить сухость.
  2. Безопасный крысы в ​​положении лежа на спине на хирургической доске. Используйте хирургические ножницы, чтобы срезать кожу в левой задней части бедра.
  3. Использование щипцов, проведение тупой dissectioп поверхностной мышцы, чтобы разоблачить бедренную вену. Используйте пинцет, чтобы отделить вены из бедренной артерии, и поместите 2 темы вокруг бедренной вены.
  4. Используйте изогнутые Грефе пинцет, чтобы потянуть вверх вены, чтобы остановить поток крови. Использование 22 G иглу шприца, прокол бедренной вены, а затем вставьте скошенный конец PE-50 трубки в вену.
  5. Убедитесь в том, PE-50 трубки был вставлен правильно втягивания поршень шприца. Кровь следует рассматривать ввода PE-50 трубки. Свяжите 2 узлов вокруг вены и PE-50 трубки, используя 2 темы.

3. 5-HT-индуцированной апноэ с помощью внутривенной инфузии

  1. Поместите пьезоэлектрический датчик деформации вокруг крысы для измерения дыхания.
  2. Изменить настройки для уровня усиления электронного усилителя через усилитель программного обеспечения на компьютере: для усиления (100x) и полосовой фильтр (1-10 Гц) дыхательные сигналы, полученные от датчика деформации, установите "highpas фильтр" на & #8220; AC @ 1 Гц "и" фильтра нижних частот "на" 10 Гц ", и установите усиление путем ввода" 10 "для" начального роста "и" 100 "для" общего прироста "..
  3. Изменить настройки для частоты дискретизации при открытии "Аналоговый вход" с помощью программного обеспечения для записи на компьютере. Для оцифровки (500 Гц частоту дискретизации) с помощью аналого-цифрового, "образец" на "1000 Гц" и "пропустить" все другие точки записи на "1" (вступает в силу с частотой дискретизации 500 Гц), а затем записать сигнал с помощью программного обеспечения записи.
  4. Удалить 1 мл шприц из катетера и вставки 500 мкл точность стеклянный шприц, наполненный 0,203 мМ 5-НТ в катетер.
  5. Поместите 500 мкл точность стеклянный шприц в инфузионный насос. Настаивать 12,5 мкг / кг в 350 мкл / кг 5-НТ раствора со скоростью 63 мл / ч. Выполните несколько настоев и наблюдать апноэ у крыс, которая рассматриваетсяса паузу в дыхании (≥ 2,5 сек) в записанном дыхательных сигналов на мониторе компьютера.
  6. Прежде чем приступить к шее хирургии, контролировать дыхание шаблон и проверить боли рефлекса с головы крайнем случае у крыс. Если дыхание затруднено, или, если есть боль рефлекс с головы крайнем случае, управлять IP-кетамин / ксилазин (100 мг / кг: 5 мг / кг), а затем еще раз подтвердить надлежащий уровень анестезии.

4. Шея хирургии, чтобы разоблачить узловые Ganglia

  1. Безопасный крысы в ​​положении лежа на спине на хирургической доске. Сделайте срединный продольный разрез, используя хирургические ножницы в шею.
  2. Использование тупым на Подкожная мышца шеи (с использованием 2 микро зажимы, чтобы держать эту мышцу подальше от места операции), выставить sternohyoideus и omohyoideus мышцы. Разделяют эти мышцы, чтобы разоблачить внутренней сонной артерии и одной из его ветвей, крылонебной артерии.
  3. Обратите внимание на блуждающий нерв, как она работает вдоль внутренней сонной артерии, а затем по го е крылонебный артерии. Наблюдайте, как блуждающий нерв и крылонебный артерии, вместе с языкоглоточного нерва (черепной нерв IX) и спинного нерва (черепной нерв XI), введите задние рваные отверстия в основании черепа.
  4. Обратите внимание, что нодозного ганглий отображается в виде набухания блуждающего нерва права прежде чем он попадает в задние рваная отверстия. Также обратите внимание, что из глотки и гортани ветвей нерва оторваться передней и задней стороны, соответственно, нодозного ганглия. 5
  5. Используя щипцы Грефе, отделить блуждающий нерв из артерий, и поместите кусок нить вокруг блуждающего нерва. Поставьте зажим на резьбой применять небольшое напряжение на блуждающего нерва, и очистить узловые ганглий любого соединительной ткани, чтобы обеспечить меньшее сопротивление при введении.
  6. Повторите 5-HT-индуцированной апноэ, как указано в разделе 3, чтобы подтвердить, что никаких повреждений не было сделано в нодозного ганглиев.
Заголовка "> 5. Intranodose Ганглии впрыска дронабинола

  1. Заполните 10 мкл точности газонепроницаемая стеклянный шприц, прикрепленный с заказ 28 г полдюйма иглу шприца с 35 ° скошенными наконечник с 5 мкл дронабинола в кунжутном масле.
  2. Поставьте микро зажим на резьбой применять небольшое напряжение на блуждающего нерва, и проколоть узловые ганглий, стараясь не проколоть через него. Нажмите шприц медленно (≥ 60 сек), чтобы ввести все содержимое шприца. Обратите внимание, что некоторые из содержимого шприца будет вытекать из ганглия.
  3. Повторите 5-HT-индуцированной апноэ, как указано в разделе 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Рисунок 1 представляет запись дыхательный образец у крыс, имевших вливание 5-НТ, чтобы вызвать апноэ до и после intranodose ганглиев инъекций дронабинолом. 5-HT активирует 5-HT 3 рецепторы на нодозного ганглиев, которые способствуют Bezold-Jarisch рефлекса брадикардия, гипотония и апноэ. 11,17-19 Intranodose ганглиев инъекции дронабинола активировать ингибирующие рецепторы CB, или аллостерически модулирует 5-HT 3 рецепторы, которые ингибируют 5-HT-индуцированное возбуждение блуждающего нерва. 16,17,20,22 до (рис 1, верхняя панель) и после (Рисунок 1, средняя панель) шея хирургия настой 5-НТ (рис 1 , предъявлено обвинение по красной линии) вызывает в апноэ ответ рассматривается как отсутствие живота движения измеряется пьезоэлектрического датчика деформации. После intranodose ганглиев инъекций дронабинола (рис 1, нижняя панель), IV 5-HT настой не вызываютапноэ ответ. После кунжутном масле инъекций (данные не показаны) в нодозного ганглиев управления транспортным средством крыс, И. 5-НТ инфузии вызывал апноэ ответ, сравнимый с исходными данными. 17

Рисунок 1
Рисунок 1:. Примеры записи с острой 5-HT-indudced экспериментов апноэ до и после 100 мкг дронабинол в 5 мкл на кунжутном масле вливаний в нодозного ганглиев блуждающих нервов 17 Респираторные записи были сделаны до операции (верхняя панель), после операции ( средняя панель), и после того, как узловые инъекций ганглиев (нижняя панель). Красная линия означает IV 5-HT настой, чтобы вызвать апноэ. После кунжутном масле инъекций (данные не показаны) в нодозного ганглиев управления транспортным средством крыс, И. 5-НТ инфузии вызывал апноэ ответ, сравнимый с исходными данными. 17 Эта цифра была изменена с Calik и др. 17AU = условных единиц; RESP = дыхания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критические шаги для успешного введения нейрохимических минуте нодозного ганглиев являются: 1) выявление и очистки соединительной ткани и выключение нодозного ганглиев; 2) подтверждения целостности нодозного ганглиев перед инъекцией; 3) и с помощью небольшой иглы, чтобы впрыснуть в тонко, но не полностью прокалывания через, по узловатый ганглиев.

Блуждающий нерв иннервирует многие органы в области шеи и брюшной полости, и передает важную информацию, такую ​​как частота сердечных сокращений, артериального давления, бронхолегочной раздражение и желудочно-кишечного живота в ЦНС. Нодозного ганглии блуждающего нерва содержат разнообразный спектр рецепторов для аминокислот, моноаминов, нейропептидов и других нейрохимических веществ. 1 Intranodose ганглиев инъекции нейрохимических для тех рецепторов изменяют активность блуждающего нерва было сделано раньше, 16,17 и представляют собой отличную экспериментальную модель, чтобы выяснить периферической pharmacologiкал воздействие на блуждающий нерв, который может изменять заболеваний, таких как апноэ сна, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, или хронический кашель. 2-4

Чтобы разоблачить Узловые ганглиев, шеи хирургии проводится и мышцы шеи разделяются показывать внутреннюю сонную артерию. Блуждающих нервов видны вдоль внутренней сонной артерии и крылонебной артерий. Клеточные тела однополярного блуждающих нервов расположены в нодозного и каменистого ганглиев, которые видели, как отек блуждающих нервов перед входом в череп на заднем рваная foramens. 5

Манипуляции с нодозного ганглиев важны постольку, что нодозного ганглии и блуждающего нервов не повреждены во время операции. Неправильное и сырой хирургическая техника может повредить Узловые ганглиев и его нервные ветви, вместе с артериями и других черепных нервов. В этом протоколе, чтобы стабилизировать блуждающий нерв, мы предоставляем небольшое напряжение в vaguс нерва с помощью шелковой нити прикреплен к микро клипа. Это позволяет нам адекватно очистить любую соединительную ткань, которая может сделать это труднее ввести в нодозного ганглия. Кроме того, мы подтверждаем, что узловые ганглиев целы прежде чем приступить к инъекции, вызывая одышку по 5-HT инфузии. Для подачи в нодозного ганглии, мы использовали недорогой небольшого калибра (28 G, OD 362 мкм) иглы, прикрепленные к точности стеклянный шприц. С глубины в месте инъекции, чтобы предотвратить прокалывание через нодозного ганглиев было проблемой, скошенные концы шприцев заказ с более вертикальным углом 35 °. Это отличается от других методов микроинъекций, в которых используются стеклянные микропипетки 8-10,14-16 Преимущество стеклянной микропипетки является меньший диаметр наконечника.; Однако, существует риск разрыва наконечник во время процедуры из-за хрупкости стекла. Кроме того, дорогостоящее оборудование необходимо, чтобы вытащить стекло микропипетки, которые могут обладать не каждый лаборатория, В заказ иглы не имеют риск поломки, и, хотя они были большего диаметра (362 мкм) 17 по сравнению со стеклянными микропипеток (20-100 мкл), 8,9,14-16 иглы были еще достаточно мал для нодозного ганглиев инъекций. Кроме того, эти иглы были повторно использоваться для многочисленных экспериментов и были значительными вычетом расходов, чем оборудования, используемого, чтобы вытащить микропипетки.

Из-за размера заказного иглы, используемые для инъекций в нодозного ганглиев, важно оценить ущерб, если таковые имеются, нодозного ганглиев. Один из способов оценки повреждения нодозного ганглиев через гистологической обработки и микроскопии в нодозного ганглиев. 6-9,13,15 Второй способ, который используется в данном протоколе, чтобы оценить функцию блуждающего нерва афферентный сравнивает электрофизиологических и поведенческих результатов между экспериментальных и контрольных групп инъекции. 14-17 Дронабинол инъекции, как было показано, чтобы ослабить 5-НТ-индуцированной апноэ по сравнению с Control инъекции, 17, означающее, что если бы был какой-то ущерб от большего диаметра пользовательских игл, было еще достаточно функциональные узловые ганглиев клетки, которые тормозились дронабинола. Кроме того, количественной оценки степени диффузии 5 мкл дронабинолом в масле не стоит, так как функциональные результаты (то есть, апноэ) были важным показателем этого протокола. Объем, используемый в данном протоколе была выбрана, чтобы гарантировать широкое распространение раствора, введенного в нодозного ганглиев. В других подобных протоколов, вводили объемы не были слишком различны и варьировались от 0,1 до 3 мкл. 8,9,14-16 степень диффузии дронабинолом нефти было достаточно для ослабления 5-НТ-индуцированной апноэ. 17

Изменения к настоящему Протоколу возможно. Во-первых, если профилактика повреждение нодозного ганглиев является необходимостью, меньшего калибра иглы (33 г наименьшее) могут быть использованы в данном протоколе. Недостаток использования меньшего гауGE игл: 1) они могут быть легко погнуты или сломаны; 2) они внутренний диаметр слишком мал, чтобы позволить для инъекций вязких жидкостей, таких как кунжутное масло. Кроме того, если инъекция глубина сайт является важным, более вертикальный угол иглы (до 45 °) может быть приобретено. Тем не менее, более вертикальный угол сделает его более трудным для прокола Узловые ганглиев. Во инъекции нодозного ганглиев, изменение натяжения блуждающего нерва может быть изменен путем размещения микро зажимы различных размеров. Если повреждение блуждающего нервов / нодозного ганглиев должно быть предотвращено, а затем с помощью небольших микро зажимы является идеальным. Наконец, инъекции жидкостей, содержащих нейрохимические вещества могут быть модифицированы с помощью объема и концентрации вводимой жидкости. В этом протоколе, 5 мкл было более чем достаточно, чтобы насытить Узловые ганглиев.

Основным недостатком этого протокола является возможность прокола через нодозного ганглиев. Если это произойдет, то повторное подтверждение целостности нодозного ганглиев шоасоциальное быть сделано. Если целостность нодозного ганглиев подтвердится, то нодозного инъекции ганглии могут быть повторены. Однако, если есть сомнения по поводу целостности нодозного ганглиев, то эксперимент с новым крысы должны быть завершены. 17

Разнообразие рецепторов на нодозного ганглиев может увеличить или препятствовать афферентной активности нервной системы. Повышение данные свидетельствуют о том, что афферентных никогда активности не играет важную роль в человеческих болезней. 2-4,23 Этот протокол обеспечивает недорогой способ местного введения нейрохимических в нодозного ганглиев, чтобы изучить их влияние на афферентной активности нервов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения (грант 1UM1HL112856).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-HT HCl MP Biomedicals 215376591 12.5 µg/kg per 350 µl/kg
Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) AbbVie NDC 0051-0023-21 Dilute with sesame oil to 20 µg/µl
Sesame Oil Sigma-Aldrich S3547
Intramedic Polyethylene-50 BD 427411 Ordered from VWR (Cat. # 63019-047)
Graefe Forceps Roboz RS-5138 Two are needed
Johns Hopkins Bulldog Clamp Roboz RS-7441 Three are needed
Piezoelectric Strain Gauge Ambu 813255-100
Data Acquisition USB Subsystems DataWave Technologies
Sciworks Experimenter Software
CyberAmp Axon Instruments
Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL Hamilton Company 81220
Syringe, 10 µl, Model 1801 RN 7659-01
Needle, 28 G, Small Hub RN 7803-02 Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog. Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
  2. Carley, D. W., Radulovacki, M. Pharmacology of vagal afferent influences on disordered breathing during sleep. Respir. Physiol. Neurobiol. 164 (1-2), 197-203 (2008).
  3. Kuo, P., Holloway, R. H. Beyond acid suppression: new pharmacologic approaches for treatment of GERD. Curr. Gastroenterol. Rep. 12 (3), 175-180 (2010).
  4. Maher, S. A., Dubuis, E. D., Belvisi, M. G. G-protein coupled receptors regulating cough. Curr. Opin. Pharmacol. 11 (3), 248-253 (2011).
  5. Greene, E. C. Anatomy of the rat. , Hafner. (1963).
  6. Li, Y., Wu, X., Zhou, S., Owyang, C. Low-affinity CCK-A receptors are coexpressed with leptin receptors in rat nodose ganglia: implications for leptin as a regulator of short-term satiety. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (2), 217-227 (1152).
  7. Powley, T. L., et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Auton. Neurosci. 177 (2), 129-142 (2013).
  8. Neuhuber, W. L. Sensory vagal innervation of the rat esophagus and cardia: a light and electron microscopic anterograde tracing study. J. Auton. Nerv. Syst. 20, 243-255 (1987).
  9. Rogers, R. C., Nasse, J. S., Hermann, G. E. Live-cell imaging methods for the study of vagal afferents within the nucleus of the solitary tract. J. Neurosci. Methods. 150 (1), 47-58 (2006).
  10. Wan, S., et al. Presynaptic melanocortin-4 receptors on vagal afferent fibers modulate the excitability of rat nucleus tractus solitarius neurons. J. Neurosci. 28 (19), 4957-4966 (2008).
  11. Verberne, A. J., Lewis, S. J., Jarrott, B., Louis, W. J. Bezold-Jarisch reflex is inhibited by excitotoxin-induced destruction of vagal primary afferent neurons. Eur. J. Pharmacol. 139 (3), 365-367 (1987).
  12. Lewis, S. J., et al. Excitotoxin-induced degeneration of rat vagal afferent neurons. Neuroscience. 34 (2), 331-339 (1990).
  13. Wallick, D. W., Dunlap, M. E., Stuesse, S. S., Thames, M. D. Denervation of vagal cardiopulmonary receptors by injection of kainic acid into the nodose ganglia in dogs. Auton. Neurosci. 102 (1-2), 85-89 (2002).
  14. Muroi, Y., et al. Selective inhibition of vagal afferent nerve pathways regulating cough using Nav 1.7 shRNA silencing in guinea pig nodose ganglia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304 (11), 1017-1023 (2011).
  15. Kollarik, M., et al. Transgene expression and effective gene silencing in vagal afferent neurons in vivo using recombinant adeno-associated virus vectors. J. Physiol. 588 (21), 4303-4315 (2010).
  16. Zhang, Z., Zhang, C., Zhou, M., Xu, F. Activation of opioid mu-receptors, but not delta- or kappa-receptors, switches pulmonary C-fiber-mediated rapid shallow breathing into an apnea in anesthetized rats). Respir. Physiol. Neurobiol. 183 (3), 211-217 (2012).
  17. Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. Intranodose ganglion injections of dronabinol attenuate serotonin-induced apnea in Sprague-Dawley rat. Respir. Physiol. Neurobiol. 190, 20-24 (2014).
  18. Yoshioka, M., Goda, Y., Togashi, H., Matsumoto, M., Saito, H. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine-induced apnea in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 260 (2), 917-924 (1992).
  19. Kopczynska, B., Szereda-Przestaszewska, M. 5HT2 and 5HT3 receptors' contribution to modeling of post-serotonin respiratory pattern in cats. Life Sci. 75 (19), 2281-2290 (2004).
  20. Fan, P. Cannabinoid agonists inhibit the activation of 5-HT3 receptors in rat nodose ganglion neurons. J. Neurophysiol. 73 (2), 907-910 (1995).
  21. Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J. Vis. Exp. (59), (2012).
  22. Barann, M., et al. Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site. Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).
  23. Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).

Tags

Neuroscience выпуск 93 неврологии узловатый ганглий блуждающий нерв ЭМГ серотонин апноэ genioglossus каннабиноиды
Метод Узловые ганглиев инъекций в Спрэг Dawley крыс
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calik, M. W., Radulovacki, M.,More

Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat. J. Vis. Exp. (93), e52233, doi:10.3791/52233 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter