Protocol
모든 절차 및 프로토콜은 시카고 일리노이 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 여기에 설명 된 실험은 급성 비 생존 실험, 그리고 눈 연고의 아무 소용이 없었다. 수술 도구가 DIH O. 2에서 70 % 에탄올로 세척하고, 멸균 조건의 경우에만 발생 정비 실험의 끝에 쥐의 희생은 IV 케타민 / 자일 라진 (xylazine)의 과다 복용을 통해 발생했습니다.
악기 및 화학 1. 준비
- PBS에서 0.05 M 5-HT의 염산 원액을 준비합니다. 이어서 0.203 ㎜의 최종 5-HT의 농도로 PBS에 희석 스톡.
- 20 ㎍ / μL의 농도 참기름 dronabinol을 희석.
- (PE) -50 튜브 (ID 0.58 mm, 외경 0.965 mm) 폴리에틸렌의 20cm 길이를 잘라. 호스의 일단 부에, 가위를 사용하여 경사 팁을 절단하고, 다른 단부에서 정사각형, 23g 바늘을 삽입한다. 1 ml의이 23g 바늘을 연결주사기, 50 U / ㎖ 헤파린의 0.3 ml로 그것을 채우십시오.
- 4-0 꼰 실크 스레드의 네 가지를 잘라 옆으로 설정합니다.
- DIH 2 O.에, 70 % 에탄올로 2 곡선 Graefe 씨 집게, 3 마이크로 클램프를 수술 가위를 소독
대퇴 정맥의 2 도관
카테터를위한 프로토콜 제스 퍼슨 등의 알에서 수정됩니다. (21)
- (10 ㎎ / ㎏ 100 ㎎ / ㎏) 복강 내 (IP) 케타민 / 자일 라진 (xylazine)와 스프 라그 - 돌리 쥐를 마취. 쥐의 발가락을 꼬집어 및 마취의 적절한 수준을 확인하는 움직임을 관찰합니다. 왼쪽 허벅지 복부 측면에서, 그리고 목 복부 측면을 면도. 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 필요한 경우 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다.
- 수술 보드에 앙와위에서 보안 쥐. 왼쪽 뒷다리 허벅지에서 피부를 절개하는 수술 용 가위를 사용합니다.
- 집게를 사용하여, 행동 무딘 dissectio피상적 근육의 n은 대퇴 정맥을 노출. 대퇴 정맥 주위에 2 스레드를 대퇴 동맥에서 정맥을 분리하고, 배치 집게를 사용합니다.
- 풀업하는 정맥 혈액의 흐름을 중지 곡선 Graefe 씨의 집게를 사용합니다. 22 G 주사기 바늘을 사용하여, 대퇴 정맥에 구멍을 후 정맥에 PE-50 튜브의 경 사진 끝을 삽입합니다.
- PE-50 튜브가 주사기의 플런저를 후퇴 올바르게 삽입되었는지 확인합니다. 혈액은 PE-50 튜브를 입력보아야한다. 2 스레드를 사용하여 정맥 및 PE-50 튜브 약 2 매듭을 묶어.
3. IV 주입을 통해 가사를 5-HT 유도
- 호흡을 측정하기 위해 쥐의 주위에 압전 스트레인 게이지를 놓습니다.
- 컴퓨터 증폭기 소프트웨어를 통해 전자 증폭기의 증폭 레벨에 대한 설정 변경 : 증폭 (100X) 및 대역 통과 필터 (1-10 Hz에서) 스트레인 게이지에 의한 호흡 신호, AT & "highpas 필터"로 설정8220;. 총 이득 "에 대한"10 Hz에서, "와 입력하여 증폭을 설정"(10)를 초기 이득 "에 대한" "와"100 ""에서 "AC @ 1 HZ"과 "로우 패스 필터.
- 컴퓨터에 기록 소프트웨어를 통해 "아날로그 입력"을 열어 샘플링 속도에 대한 설정을 변경합니다. "1000 Hz에서"와 AT, "샘플"아날로그 - 디지털 변환기를 사용하여 (500 Hz의 샘플링 레이트)를 디지털화하는 것은 "1"(유효 샘플링 속도 500 Hz에서)에 의해 다른 모든 기록 지점 "SKIP"을 선택한 후, 신호를 기록 기록 소프트웨어를 사용.
- 카테터에서 1 ML의 주사기를 제거하고 카테터에 5-HT의 0.203 mM의 가득 500 ㎕를 정밀 유리 주사기를 삽입합니다.
- 주입 펌프에 500 μL 정밀 유리 주사기를 놓습니다. 63 ㎖ / hr의 속도로 350 μL / 5-HT 용액 kg 당 12.5 ㎍ / kg 달이다. 을 볼 수 쥐에서 여러 주입을 수행하고 관찰 무호흡증,컴퓨터 모니터에 기록 된 호흡 신호에 (≥ 2.5 초) 호흡에 일시 정지 SA.
- 목 수술을 진행하기 전에, 패턴 호흡 모니터링하고 쥐의 발가락 핀치에서 통증 반사를 확인합니다. 호흡이 불규칙하거나 발가락 핀치로부터 반사 통증이 있으면, IP 케타민 / 자일 라진 관리하는 경우 (100 ㎎ / kg : 5 ㎎ / kg)을 한 후 마취의 적절한 수준을 다시 확인한다.
4. 목 수술 Nodose 신경절을 노출
- 수술 보드에 앙와위에서 보안 쥐. 목에 수술 가위를 사용하여 중간 선 길이 절단을 확인합니다.
- (수술 부위의 명확한이 근육을 유지하기 위해 2 마이크로 클램프를 사용) 활 경근 근육에 무딘 절개를 사용하여 sternohyoideus 및 omohyoideus 근육을 노출. 내 경동맥과 그 가지 중 하나 pterygopalatine 동맥을 노출이 근육을 분리합니다.
- 이 일을 따라하고 내 경동맥을 따라 실행으로 미주 신경을 준수 전자 pterygopalatine 동맥. 설인 신경 (뇌신경 IX) 및 척추 부신경 (뇌신경 XI)와 함께 미주 신경과 pterygopalatine 동맥, 두개골의 바닥에있는 후방 찢 난원를 입력하는 방법을 준수하십시오.
- nodose 신경절은 (는) 후방 찢 난원에 진입하기 직전 미주 신경의 부종으로 표시되는 것을 알 수 있습니다. 또한 인두와 후두 신경 가지 nodose 신경절의 각각 전방 및 후방 측면을 벗겨 것을 알 수 있습니다. (5)
- Graefe 씨 집게를 사용하여 동맥으로부터 미주 신경을 분리하고, 미주 신경 주위의 실 부재를 배치했다. 미주 신경에 약간 긴장을 적용하고, 주입 할 때 더 적은 저항을 제공하기 위해 모든 결합 조직의 nodose 신경절을 청소 스레드에서 클램프를 놓습니다.
- 손상이 nodose 신경절에 수행되지 않았 음을 확인하기 위해 제 3 항에 명시된대로 5-HT 유도 가사를 반복합니다.
- 참기름 dronabinol의 5 μL와 팁을 경사 35 °와 맞춤 28g 반 인치 주사기 바늘에 부착 된 10 μL 기밀 정밀 유리 주사기를 입력합니다.
- 미주 신경에 약간 긴장을 적용하고, 그것을 뚫하지 nodose 신경절 돌보는에 구멍을하는 스레드에서 마이크로 클램프를 놓습니다. 주사기의 전체 내용을 천천히 주입 주사기 (≥ 60 초)을 밟아. 주사기의 내용 중 일부는 신경절에서 누출합니다.
- 3 장에서 언급 한 바와 같이 반복 무호흡증 5-HT는 유도.
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Representative Results
그림 1은 dronabinol의 intranodose 신경 주사 전후에 가사를 유도하는 5-HT의 주입했다 쥐에서 샘플 호흡 녹화를 나타냅니다. 5-HT는 5-HT에게 서맥, 저혈압, 무호흡의 Bezold-Jarisch 반사에 기여하는 nodose 신경절에 3 수용체를 활성화합니다. dronabinol의 11,17-19 Intranodose 신경 주사는 억제 CB 수용체를 활성화 또는 알로 스테 릭 5-HT는 변조 (그림 1, 상단 패널) 전후 미주 신경의. 16,17,20,22 5-HT에 의한 자극을 억제하는 3 수용체 (그림 1, 가운데 패널) 5-HT의 목 수술 주입 (그림 1 ) 붉은 선으로 기소 압전 스트레인 게이지에 의해 측정 복부 운동의 부족으로 볼 apneic 반응을 이끌어 낸다. dronabinol의 intranodose 신경 주사 (그림 1, 하단 패널) 한 후, IV 5-HT의 주입은 유도하지 않았다apneic 응답. 차량 제어 래트 nodose 신경절에 참기름 주사 (데이터는 도시하지 않음) 후, 5-HT IV 주입은 기준선 비교 apneic 응답을 이끌어. 17
그림 1 :. 이전과 미주 신경의 nodose 신경절에 100 μg의 dronabinol 5 μL 참기름 주사 후 급성 5-HT-indudced 무호흡증 실험에서 샘플 녹음이 17 호흡기 기록은 수술 후, 수술 (상단 패널) 전에 찍은 ( 가운데 패널) 및 nodose 신경 주사 후 (아래 패널). 레드 라인은 무호흡을 유도 IV 5-HT 주입을 의미합니다. 차량 제어 래트 nodose 신경절에 참기름 주사 (데이터는 도시하지 않음) 후, IV 5-HT의 주입 기준선 비교 apneic 응답을 이끌어. (17)이 도면은 Calik 외에서 개질되었다. 17AU = 임의의 단위; RESP = 호흡.
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Discussion
nodose 신경절에 신경 화학 물질을 성공적으로 주입을위한 중요한 단계는 1) 식별하고 nodose 신경절 오프 결합 조직을 청소; 2) 주입하기 전에 nodose 신경의 무결성을 확인하는 단계; 3)과 섬세에 주입하는 작은 게이지 바늘을 사용하지만, 완전히, nodose 신경절을 통해 천공 없습니다.
미주 신경을 목에서 많은 복부 장기 innervates, 이러한 CNS 심박수, 혈압, 기관지 자극, 및 위장관 팽창으로 중요한 정보를 중계한다. 미주 신경의 nodose 신경절은 아미노산, 모노 아민, 신경 펩티드 및 기타 신경 화학 물질에 대한 수용체의 다양한 배열을 포함하고 있습니다. 그 수용체 신경 화학 물질의 1 Intranodose 신경절 주사를 미주 신경의 활동을 수정, 16, 17 전에 수행 된 주변 pharmacologi을 규명 할 수있는 훌륭한 실험 모델을 나타냅니다수면 무호흡증, 위 식도 역류 질환, 만성 기침 등의 질병을 수정할 수있는 미주 신경에 칼 효과. 2-4
nodose 신경을 노출하기 위해 목 수술을 실시하고, 목의 근육은 경동맥을 노출 구분됩니다. 미주 신경은 내부 경동맥과 pterygopalatine 동맥을 따라 실행 볼 수 있습니다. 유니 폴라 미주 신경의 세포 기관은 후방 찢 구멍으로의 두개골에 들어가기 전에 미주 신경의 부종으로 볼 수 있습니다 nodose와 petrosal 신경절에 위치하고 있습니다. (5)
nodose 신경의 조작은 nodose 신경과 미주 신경은 수술 중 손상되지하는 한 것이 중요하다. 부적절한 원유 수술 기술은 동맥과 다른 뇌신경과 함께 nodose 신경과 신경 가지를 손상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 미주 신경을 안정화하기 위해, 우리는 vagu에 약간의 장력을 제공한다실크 스레드를 통해의 신경은 마이크로 클립에 첨부. 이 적절가 더 어려워 nodose 신경절에 주입 할 수 있도록 수있는 결합 조직을 청소하는 우리를 할 수 있습니다. 또한, 우리는 nodose 신경절은 5-HT의 주입에 의해 무호흡을 유도하여 주입을 진행하기 전에 그대로 있는지 확인합니다. nodose 신경절에 주입하기 위해, 우리는 (28 G, OD 362 μm의) 정밀 유리 주사기에 부착 된 바늘 저렴 작은 게이지를 사용했다. 주사 부위의 깊이 nodose 신경절 통해 천공 방지 할 우려 때문에, 주사기의 끝이 경 사진 35 °의 지정 수 직각보다 만들었다이었다. 이것은 유리 마이크로 피펫을 사용하는 다른 기술 마이크로 인젝션 상이 8-10,14-16 유리 마이크로 피펫의 장점은 작은 선단 직경이다.; 그러나, 유리의 취약성에 절차를 수행하는 동안 끝을 파괴의 위험이 있습니다. 또한, 고가의 장비가없는 모든 실험실이 소유 할 수 있습니다 유리 마이크로 피펫을 끌어 필요. 주문 제작 바늘 파괴의 위험이 없다, 그들은 유리 마이크로 피펫 (20 ~ 100 μL)에 비해 더 큰 직경 (362 μm의) (17) 이었지만, 8,9,14-16 바늘 nodose 신경절 여전히 충분히 작았 주사. 또한, 이러한 바늘은 많은 실험 재사용했고, 마이크로 피펫을 추출하는 데 사용 장비에 비해 상당히 적은 비용이었다.
인해 nodose 신경절에 주입을 위해 사용 맞춤 니들 크기로, 그것은 nodose 신경절에 존재하는 경우, 손상을 평가하는 것이 중요하다. nodose 신경절 손상을 평가하는 하나의 방법은 신경절 nodose 학적 처리 및 현미경을 통해서이다. 6-9,13,15 심성 미주 신경 기능을 평가하기 위해,이 프로토콜에서 사용되는 제 2 방법은, 전기 생리 학적 또는 행동 사이의 결과를 비교한다 실험 및 제어 분사 그룹. 14 ~ 17 Dronabinol 주사는 C에 비해 5-HT 유도 가사를 감쇠하는 것으로 나타났다조작부 주사, 더 큰 직경의 정의 바늘에서 일부 피해가 발생했을 경우, dronabinol에 의해 억제되었다 아직 충분한 기능 nodose 신경절 세포가 있다고 의미 (17). 기능적 결과 (즉, 무호흡)이이 프로토콜의 중요한 메트릭 된 이후 이와 유사하게, 기름에 dronabinol의 5 μL의 확산의 정도를 정량화 할 필요가 없습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 부피는 nodose 신경절 주입 용액의 광범위한 확산을 보장하기 위해 선택되었다. 기타 유사한 프로토콜에 따라 볼륨이 너무 차이가 없었다 주입 0.1 ~ 3 μL에서였다. 8,9,14-16 오일 dronabinol의 확산의 정도는 5-HT에 의한 무호흡증 감쇠하기에 충분했다. (17)
이 프로토콜에 대한 수정이 가능합니다. nodose 신경 손상의 예방 필요성, 작은 게이지 바늘 (최소 33 G) 인 경우 첫째,이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 작은 GAU를 사용하는 단점GE의 바늘 : 1) 그들은 쉽게 부서 지거나 구부러 될 수있다 2) 이들은 내경은 참기름과 같은 점성 유체의 주입을 허용하기에는 너무 작다. 깊이 사이트 주입이 중요한 경우 또한, (45 °까지) 더 수직 각도 바늘을 구입하실 수 있습니다. 그러나, 더 수직의 각도는 더 어려워 nodose 신경절을 천공하도록 만들 것이다. nodose 신경절 주입 중에 미주 신경의 수정 장력은 다양한 크기의 마이크로 클램프를 배치함으로써 변경 될 수있다. 미주 신경 / nodose 신경 손상 후 작은 마이크로 클램프를 이용하여 방지 할 필요가있는 경우에 이상적이다. 마지막으로, 신경 화학 물질을 포함하는 유체의 주입은 볼륨과 유체의 농도 주입을 통해 수정 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 5 μl의 nodose 신경을 포화시키기에 충분했다.
이 프로토콜의 주요한 제한 nodose 신경절 통해 천공의 가능성이다. 이 경우, 다음 nodose 신경절 SHO의 무결성을 재 - 확인자민련은 할 수. nodose 신경절의 무결성이 확인되면, nodose 신경절 주입 반복 될 수있다. 의심 nodose 신경절에 대한 무결성이있는 경우에는, 새로운 다음 쥐 실험이 완료되어야한다. (17)
nodose 신경절에 수용체의 다양성은 증가 또는 구 심성 신경 활성을 억제 할 수있다. 증가 증거는 구 심성은 결코 활동이 인간의 질병에 중요한 역할을 없음을 의미한다. 2-4,23이 프로토콜은 구 심성 신경 활동에 미치는 영향을 연구하기 위해 nodose 신경절에 신경 화학 물질의 지방 행정의 저렴한 방법을 제공한다.
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Acknowledgments
이 연구는 국립 보건원 (부여 1UM1HL112856)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
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