Protocol
全ての手順およびプロトコルはイリノイ大学シカゴ校の制度動物実験委員会によって承認された。ここに記載の実験は、急性非生存実験であり、眼軟膏の無駄がありませんでした。外科器具はDIH 2 O中70％エタノールで洗浄する際に無菌状態の維持にのみ発生実験の終了時にラットの犠牲は、IVケタミン/キシラジンの過剰摂取を経由して発生した。
楽器と化学物質の作製
- PBS中の5-HTのHClの0.05 Mのストック溶液を準備します。その後、0.203 mMの最終5-HT濃度にPBSで株式を希釈。
- を20μg/μlの濃度でごま油でドロナビノールを希釈します。
- （PE）-50チューブ（ID 0.58ミリメートル、外径0.965ミリメートル）ポリエチレン20cmの長さをカット。チューブの一端には、はさみを使ってベベルの先端を切断し、他の正方形の終わりに、23グラムの針を挿入します。この23グラムの針が1ミリリットルに接続します注射器、および50 U / mlのヘパリンの0.3ミリリットルでそれを埋める。
- 4-0編み絹糸の4枚をカットし、サイドに設定。
- のdiH 2 O中70％エタノールで2湾曲グレーフェ鉗子、及び3マイクロクランプを外科用ハサミを殺菌
大腿静脈の2カテーテル
カテーテル挿入のためのプロトコルは、イェスペルセンらから変更されている。21
- 腹腔内（IP）ケタミン/キシラジン（10 mg / kgを100ミリグラム/ kg）でのSprague-Dawleyラットを麻酔。ラットのつま先をつまんで麻酔の適切なレベルを確認するためにあらゆる動きを観察します。左大腿の腹側面、そして首の腹側面を剃る。地元の施設内動物管理使用委員会によって必要に応じて、乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。
- 外科ボード上の仰臥位でラットを固定します。左後肢大腿部に皮膚を切り取るために外科用ハサミを使用してください。
- 鉗子を使用して、行動鈍いdissectio表在筋のnは大腿静脈を露出させる。大腿動脈から静脈を分離し、そして大腿静脈を中心に2つのスレッドを配置するために鉗子を使用してください。
- プルアップ静脈の血流を停止するように湾曲したグレーフェ鉗子を使用してください。 22 G注射針を使用して、大腿静脈を穿刺した後、静脈にPE-50チューブの斜角の端を挿入します。
- PE-50チューブは、注射器のプランジャーを後退させることによって、正しく挿入されたかどうかを確認してください。血液はPE-50チューブに入っ見られるべきである。 2つのスレッドを使用して静脈とPE-50チュービング約2ノットを結ぶ。
IV注入を介して3. 5-HT誘発性無呼吸
- 呼吸を測定するためにラットを中心に、圧電ひずみゲージを配置します。
- コンピュータ上のアンプソフトウェアを介して電子増幅器の増幅レベル用の設定を変更します：（100倍）を増幅し、バンドパスフィルタ（1-10 Hz）のひずみゲージから得呼吸信号、＆＃で「highpasフィルタ」を設定する8220; AC @ 1 HZ」と「10ヘルツ」の「ローパスフィルタ」と入力して増幅を "トータルゲイン」を「初期ゲイン」と「100」は「10」。
- コンピューター上の記録ソフトウェアを介して「アナログ入力」を開くことで、サンプリングレートの設定を変更します。 、アナログ - デジタル変換器を使用して（500 Hzのサンプリングレート）をデジタル化する「1000Hzの」の「サンプル」と「1」（有効サンプリングレートは500Hz）によって他のすべての記録点を「スキップ」を選択し、信号を記録する録音ソフトウェアを使用して。
- カテーテルから1ミリリットルの注射器を取り外し、カテーテルに5-HTの0.203 mMので満たされた500μlの精密ガラスシリンジを挿入します。
- 輸液ポンプに500μlの精密ガラス注射器を置きます。 63ミリリットル/時の速度で350μL/ 5-HT液の1kgあたり12.5μgの/ kgで注入する。見られているラットにおける複数回の注入を行い、観察する無呼吸、コンピューターのモニターに記録された呼吸信号に（≥2.5秒）、呼吸の一時停止SAの
- 首の手術を進める前に、呼吸パターンを監視し、ラットにおける足指のピンチから痛みの反射をチェックする。呼吸が不規則であるか、またはつま先ピンチ痛み反射がある場合、IPケタミン/キシラジン管理する場合（100mg / kgの5ミリグラム/ kg）をした後、麻酔の適切なレベルを再確認する。
4.頸部外科は節状神経節を露出させるために
- 外科ボード上の仰臥位でラットを固定します。首の外科用ハサミを使用して正中縦カットを行います。
- （手術部位の明確なこの筋肉を維持するために2マイクロクランプを使用して）広頸筋筋に鈍的切開を使用して、sternohyoideusとomohyoideus筋肉を公開します。内頸動脈とその分岐の1つ、翼口蓋動脈を露出させるためにこれらの筋肉を分離する。
- それは内頸動脈に沿って実行され、目に沿ってように迷走神経を観察 Eの翼口蓋動脈。どのように迷走神経と翼口蓋動脈を観察し、舌咽神経（脳神経IX）および脊髄副神経（脳神経XI）と一緒に、頭蓋骨の基部に後部裂傷孔を入力してください。
- 節状神経節は、それが後部引き裂か孔に入る直前に迷走神経の腫脹として表示されていることに注意してください。また、咽頭と喉頭神経枝は節状神経節の、それぞれ、前方および後方の側面を外れていることに注意してください。5
- グレーフェの鉗子を使用して、動脈から迷走神経を分離し、迷走神経の周りに糸の作品を配置。迷走神経に若干の緊張を適用するために、スレッド上のクランプを置き、注入少ない抵抗を提供するために、任意の結合組織の節状神経節をきれいに。
- 損傷が節状神経節に行われなかったことを確認するために、セクション3で述べたように、5-HT誘発性無呼吸を繰り返します。
- ごま油でドロナビノールの5μlの先端を斜めに35°のカスタムメイドの28グラム1/2インチ注射針を貼付10μlの気密精密ガラスシリンジを埋める。
- 迷走神経に若干の緊張を適用するために、スレッド上にマイクロクランプを置き、それを通して穿刺しないように注意しながら節状神経節を穿刺。注射器の内容全体を注入するために、ゆっくりと注射器（≥60秒）を押します。注射器の内容の一部は神経節の外に漏れ出すことに注意してください。
- 3章で述べたように、5-HT誘発性無呼吸を繰り返します。
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Representative Results
図1は、ドロナビノールのintranodose節注射の前と後の無呼吸を誘導するために5-HTの注入を有していたラットのサンプル呼吸記録を表す。 5-HTは、ドロナビノールの11,17-19 Intranodose神経節の注射は抑制性のCB受容体を活性化する。徐脈、低血圧、及び無呼吸のベツォルト-ヤーリッシュ反射に貢献節状神経節に対する5-HT 3受容体を活性化し、またはアロステリックに5-HTを変調（ 図1、上のパネル）の前と後の迷走神経の。16,17,20,22 5-HT誘発される興奮を抑制する3受容体（ 図1、中央のパネル）、5-HTのネック手術注入（ 図1 、赤線で起訴）圧電歪みゲージで測定腹部運動の欠如と見られ、無呼吸応答を誘発する。ドロナビノールのintranodose神経節注射（ 図1、下のパネル）の後、IVの5-HT注入は誘発しなかった無呼吸応答。ビヒクル対照ラットの節状神経節にごま油注射（データは示していない）した後、IV 5-HT注入はベースラインに匹敵する呼吸応答を誘発した。17
図1：迷走神経の節状神経節に5μlのごま油注射で100μgのドロナビノール前と後の急性5-HT-indudced無呼吸実験からのサンプルの録音が 17呼吸の記録は、（手術後、手術（上のパネル）の前に撮影された中央のパネル）、および結節神経節注射の後（下のパネル）。赤い線は無呼吸を誘導するためにIVの5-HTの注入を意味します。ビヒクル対照ラットの節状神経節にごま油注射（データは示していない）した後、IV 5-HT注入はベースラインに匹敵する呼吸応答を誘発した。17この図はCalik らから変更されている。17AU =任意の単位。 RESP =呼吸。
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Discussion
節状神経節への神経化学物質を正常に注入するための重要なステップは、1）特定し、節状神経節から結合組織を清掃する。 2）注入前の節状神経節の整合性を確認した。 3）と微妙に注入するための小さなゲージの針を用いて、しかし完全に、結節神経節を経て穿刺しない。
迷走神経は、首、腹部の多くの器官を神経支配、ならびにCNSへの心拍数、血圧、気管支肺の炎症、胃腸膨満などの重要な情報を中継する。迷走神経の節状神経節は、アミノ酸、モノアミン、神経ペプチド、および他の神経化学物質の受容体の多様な配列が含まれている。これらの受容体のための神経化学物質の1 Intranodose神経節注射を迷走神経の活性を変更するには、16,17の前に行われていると周辺pharmacologiを解明するための優れた実験モデルを表すそのような睡眠時無呼吸、胃食道逆流症、または慢性の咳などの疾患を変更することができ、迷走神経上のCALの影響。2-4
節状神経節を公開するには、首の手術が行われ、首の筋肉内頸動脈を露出させるために分離されている。迷走神経は内頸動脈と翼口蓋動脈に沿って見られている。ユニポーラ迷走神経の細胞体は、後部裂傷foramensで頭蓋骨に入る前に迷走神経の腫れと見られている結節や錐体神経節、に位置しています。5
節状神経節の操作は節状神経節および迷走神経が手術中に損傷しない限りすることが重要である。不適切なと原油外科技術は、動脈や他の脳神経と一緒に節状神経節とその神経枝を、損傷する可能性があります。このプロトコルでは、迷走神経を安定化するために、我々はvaguにわずかな張力を提供するマイクロクリップに添付絹糸を経由しての神経。これは十分にそれがより困難に節状神経節に注入するために作る可能性のある結合組織をきれいにすることを可能に。また、私たちは、結節神経節は5-HTの注入によって無呼吸を誘導することにより、注入を続行する前に、完全な状態であることを確認する。節状神経節に注入するために、我々は（28 G、OD 362μm）の精密ガラス注射器に取り付けた針安価な小型のゲージを使用していました。節状神経節を通して穿刺防止するために、注射部位の深さが心配だったので、注射器の斜角の先端は、カスタム35°のより垂直角度を用いて作製した。これは、ガラスマイクロピペットが使用される他のマイクロインジェクション技術とは異なる8-10,14-16ガラスマイクロピペットの利点は、小さな先端径である。しかしながら、ガラスの脆弱性に起因する処置の間にチップを破壊するおそれがある。また、高価な設備がなく、すべてのラボが有することができるガラスマイクロピペットを、引っ張るために必要とされている。カスタムメイドの針が破損の危険性を持っていない、と彼らはガラスマイクロピペット（20〜100μL）に比べてより大きな直径（362μm）の17であったにもかかわらず、8,9,14-16針は節状神経節のためにまだ十分に小さかった注射。さらに、これらの針は、多くの実験のために再利用可能であり、マイクロピペットを引っ張るために使用される装置よりもかなり少ない費用であった。
いずれの場合による結節神経節に注入するために使用されるカスタム·針のサイズは、結節性神経節に、損傷を評価することが重要である。節状神経節の損傷を評価する1つの方法は、節状神経節の組織学的処理及び顕微鏡検査によるものである。6-9,13,15迷走神経求心性機能を評価するために、このプロトコルで使用される第2の方法は、間に電気生理学的または行動的治療成績を比較して実験および対照注入群14-17ドロナビノール注射は、cに比べて5-HT誘発性無呼吸を弱めることが示されているontrol注射、より大きな直径のカスタム針からいくつかの被害があった場合、ドロナビノールによって阻害された、まだ十分に機能的な結節神経節細胞があったことを意味する17。機能的転帰（ すなわち 、無呼吸）がこのプロトコルの重要なメトリックであったため同様に、油中のドロナビノールの5μLの拡散の程度を定量化する必要はありません。このプロトコルで使用される容量は、節状神経節に注入ソリューションの幅広い普及を保証するために選ばれました。他の同様のプロトコルでは、ボリュームが過度に異ならなかった注射し、0.1〜3μlの範囲であった。8,9,14-16油のドロナビノールの拡散の程度は、5-HT誘発性無呼吸減衰させるのに十分であった。17
このプロトコルへの変更が可能である。節状神経節の損傷防止が必要である場合、最初に、小さなゲージの針（最小33 G）は、このプロトコルで使用することができる。小さいGAUを使用することの欠点GE針は、次のとおりです。1）彼らは容易に破壊したり曲げたりすることができます。 2）それらは、内径がゴマ油のような粘性流体の注入を可能にするには小さすぎる。深サイト注入が重要である場合また、（45°まで）より垂直角度針を購入することができる。しかし、より多くの垂直角度はそれがより困難に節状神経節を穿刺するようになります。節状神経節の注入時に、迷走神経の修正張力は、様々なサイズのマイクロクランプを配置することによって変更することができる。迷走神経/節状神経節の損傷を防止する必要がある場合には、より小さなマイクロクランプを使用することは理想的である。最後に、神経化学物質を含む流体の注入は、注入される流体の体積及び濃度を介して変更することができる。このプロトコルでは、5μlを節状神経節を飽和するのに十分すぎるほどだった。
このプロトコルの主な制限は、節状神経節を通して穿刺の可能性である。この問題が発生した場合、その後結節神経節の笙の整合性の-確認を再行うことがULD。節状神経節の完全性が確認された場合、節状神経節に注射を繰り返してもよい。節状神経節の完全性について疑問がある場合は、その後新たなラットを用いた実験を完了する必要があります。17
節状神経節上の受容体の多様性が増加または求心性神経の活性を阻害することができる。増加する証拠は、求心性は決して活動がヒトの疾患において重要な役割を果たしていることを示唆している。2-4,23このプロトコルは、求心性神経活動への影響を研究するために節状神経節に神経化学物質の局所投与の安価な方法を提供します。
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Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所（グラント1UM1HL112856）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
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