Protocol
Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Illinois, em Chicago animal Institucional. As experiências aqui descritas são experiências agudas não-sobrevivência, e não houve uso de pomada. Manutenção de condições estéreis só ocorre quando os instrumentos cirúrgicos são lavados com etanol 70% em DIH 2 O. Sacrifício de ratos no final da experiência ocorreu através de sobredosagem de IV cetamina / xilazina.
1. Preparação de Instrumentos e Produtos Químicos
- Preparar a solução de estoque de 0,05 M de 5-HT de HCl em PBS. Depois dilui-se estoque com PBS a uma concentração final de 5-HT de 0,203 mM.
- Diluir dronabinol em óleo de sésamo com uma concentração de 20 ug / uL.
- Corte de 20 cm de comprimento de polietileno (PE) -50 tubagem (ID 0,58 milímetros, 0,965 milímetros OD). Em uma extremidade do tubo, corte uma ponta bisel com uma tesoura, e na outra ponta quadrada, inserir uma agulha de 23 g. Ligue este 23 g agulha para um 1 mlseringa, e encha-o com 0,3 ml de 50 u / ml de heparina.
- Corte quatro pedaços de fio de seda 4-0 trançado e definido para o lado.
- Esterilizar tesouras cirúrgicas, 2 fórceps Graefe curvas, e 3 grampos de micro com etanol a 70% em DIH 2 O.
2. O cateterismo de veia femoral
Protocolo para o cateterismo é modificado a partir Jespersen et al 21.
- Anestesiar uma ratazana Sprague-Dawley com intraperitoneal (IP) de cetamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Aperte o dedo do pé do rato e observar qualquer movimento para confirmar um nível adequado de anestesia. Raspar o aspecto ventral da coxa esquerda, e do aspecto ventral do pescoço. Se necessário pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucional do local, aplicar pomada para evitar o ressecamento.
- Rat seguro em decúbito dorsal em uma placa cirúrgica. Utilize uma tesoura cirúrgica para cortar a pele na coxa posterior esquerda.
- Utilizando uma pinça, conduta dissectio contuson do músculo superficial para expor a veia femoral. Utilizar as pinças para separar a veia a partir da artéria femoral, e colocar dois segmentos em torno da veia femoral.
- Use a pinça Graefe curvas para puxar-up da veia para parar o fluxo de sangue. Usando uma seringa de agulha G 22, por punção da veia femoral e, em seguida, insira a ponta chanfrada do tubo PE-50 na veia.
- Verificar se o tubo PE-50 foi inserida correctamente por retracção do êmbolo da seringa. O sangue deve ser visto de entrar no tubo de PE-50. Amarre 2 nós ao redor da veia e PE-50 tubos usando as duas threads.
3. 5-HT induzido por Apnea via IV Infusion
- Coloque um medidor de tensão piezoelétrico em torno do rato para medir a respiração.
- Altere as configurações para o nível de amplificação do amplificador eletrônico via software amplificador no computador: para amplificar (100x) e filtro passa-banda (10/01 Hz), os sinais respiratórios obtidos a partir do medidor de tensão, ajuste "filtro highpas" at & #8220; AC @ 1 HZ "e" Filter Lowpass "at" 10 Hz ", e definir a amplificação através da introdução de" 10 "para o" ganho inicial "e" 100 "para" Total Gain "..
- Altere as configurações de taxa de amostragem, abrindo "Entrada Analógica" via software de gravação no computador. Para digitalizar (500 taxa de amostragem Hz) usando um conversor analógico-digital, "sample" at "1.000 Hz" e "pular" todos os outros pontos de gravação por "1" (taxa de amostragem eficaz 500 Hz), e depois gravar o sinal usando o software de gravação.
- Remover a seringa de 1 ml a partir do cateter e inserir uma seringa de vidro de 500 mL cheio com precisão de 0,203 mM de 5-HT no interior do cateter.
- Coloque a 500 ul seringa de vidro de precisão em uma bomba de infusão. Infundir 12,5 ug / kg por 350 ul / kg de uma solução de 5-HT a uma taxa de 63 ml / hr. Executar várias infusões e observar apnéia em rato, que é visto umsa pausa na respiração (≥ 2,5 seg) nos sinais respiratórios gravados no monitor do computador.
- Antes de prosseguir com a cirurgia de pescoço, monitorar o padrão respiratório e verificar se há reflexo dor de toe pitada no rato. Se a respiração for irregular, ou se existe um reflexo dor de aperto do dedo do pé, administrar IP cetamina / xilazina (100 mg / kg: 5 mg / kg) e, em seguida, voltar a confirmar a um nível adequado de anestesia.
4. Neck Surgery para expor Nodoso Ganglia
- Rat seguro em decúbito dorsal em uma placa cirúrgica. Faça um corte longitudinal mediana usando uma tesoura cirúrgica no pescoço.
- Usando dissecção romba no músculo platisma (usando dois micro grampos para manter esse músculo clara do sítio cirúrgico), expor os músculos sternohyoideus e omohyoideus. Separe esses músculos para expor a artéria carótida interna e um de seus ramos, a artéria pterigopalatina.
- Observe o nervo vago, uma vez que corre ao longo da artéria carótida interna e, em seguida, ao longo th e pterygopalatine artéria. Observe como o nervo vago e artéria pterigopalatina, juntamente com o nervo glossofaríngeo (IX nervo craniano) e do nervo acessório (XI nervo craniano), digite o forame lacerados posteriores na base do crânio.
- Observe que o gânglio nodoso é exibido como um inchaço do nervo vago direito antes de entrar no forame posterior dilacerado. Note também que os ramos da faringe e da laringe nervosas saem os aspectos anterior e posterior, respectivamente, do gânglio nodoso. 5
- Usando a pinça Graefe, separar o nervo vago a partir das artérias, e coloque um pedaço de fio ao redor do nervo vago. Coloque um grampo na linha para aplicar uma leve tensão no nervo vago, e limpar o gânglio nodoso de qualquer tecido conjuntivo para proporcionar menor resistência ao injetar.
- Repita apnéia 5-HT induzido conforme previsto no ponto 3 para confirmar que nenhum dano foi feito para o gânglio nodoso.
- Encha a 10 ul precisão gastight seringa de vidro afixado com um 28 g de meia polegada agulha de seringa feito por encomenda com um 35 ° chanfradas ponta com 5 mL de dronabinol em óleo de gergelim.
- Coloque um grampo micro no segmento de aplicar uma leve tensão no nervo vago, e perfurar o gânglio nodoso tomando cuidado para não perfurar através dele. Pressione a seringa lentamente (≥ 60 seg) para injetar todo o conteúdo da seringa. Note-se que alguns dos conteúdos de seringas vai vazar para fora do gânglio.
- Apneia Repita 5-HT-induzida como indicado na seção 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 representa gravação respiração amostra em ratos que tinham infusão de 5-HT para provocar apneia antes e depois da injecção dos gânglios intranodose de dronabinol. 5-HT activa 5-HT3 sobre os gânglios nodosos que contribuem para o reflexo de Bezold-Jarisch de bradicardia, hipotensão, e apneia. 11,17-19 injecções gânglios Intranodose dronabinol de activar os receptores CB inibitórios, ou modula alostericamente 5-HT 3 receptores que inibem a excitação de 5-HT-induzida do nervo vago 16,17,20,22. Antes (Figura 1, painel superior) e depois (Figura 1, painel do meio) de infusão cirurgia pescoço de 5-HT (Figura 1 , indiciado pela linha vermelha) provoca uma resposta apneic visto como uma falta de movimento abdômen medido pelo medidor de tensão piezoelétrico. Após injecções gânglios intranodose de dronabinol (Figura 1, painel inferior), administração endovenosa de 5-HT não induziuuma resposta de apnéia. Após injecções de óleo de gergelim (dados não mostrados) em gânglios nodosos de ratos de controlo do veículo, administração endovenosa de 5-HT induziu uma resposta apneica comparável às linhas de base 17.
Figura 1:. Gravações de exemplo de experiências de apneia aguda da 5-HT-indudced antes e depois de 100 ug dronabinol em 5 mL de óleo de sésamo injecções para o gânglio nodoso do nervo vago 17 gravações respiratórias foram tomadas antes da cirurgia (painel de cima), após a cirurgia ( o painel do meio), e depois da injecção dos gânglios nodosos (painel inferior). Linha vermelha significa IV infusão de 5-HT para induzir a apnéia. Após injecções de óleo de gergelim (dados não mostrados) em gânglios nodosos de ratos de controlo do veículo, administração endovenosa de 5-HT induziu uma resposta apneica comparável às linhas de base. 17 Esta figura foi modificado a partir Calik et al. 17UA = unidades arbitrárias; RESP = respiratória.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os passos críticos para o sucesso da injecção de neurotransmissores na gânglios nodosos são: 1) a identificação e a limpeza do tecido conjuntivo fora do gânglios nodosos; 2) confirmando a integridade do gânglio nodoso antes da injecção; 3) e usando uma agulha de calibre pequeno para injectar delicadamente em, mas não completamente, através de punção, os gânglios nodosos.
O nervo vago inerva muitos órgãos no pescoço e abdômen, e transmite informações importantes, tais como a freqüência cardíaca, pressão arterial, irritação broncopulmonar e distensão gastrointestinal para o SNC. Os gânglios nodosos do nervo vago contém uma série diversa de receptores para aminoácidos, monoaminas, neuropéptidos e outros neurotransmissores. 1 Intranodose injecções gânglios de neurotransmissores para esses receptores para modificar a actividade do nervo vago foram feitas antes, 16,17 e representam um excelente modelo experimental para elucidar pharmacologi periféricaefeitos cal sobre o nervo vago que pode modificar doenças como a apnéia do sono, doença do refluxo gastroesofágico, ou tosse crônica 2-4.
Para expor o gânglios nodosos, a cirurgia é conduzida pescoço e músculos do pescoço são separadas para expor a carótida interna. Os nervos vagos são vistos correndo ao longo da carótida interna e as artérias pterigopalatino. Os corpos celulares dos nervos vagos unipolares estão localizados no nodosos e gânglios petrosal, que são vistos como um inchaço dos nervos vagos antes de entrar no crânio no forames posteriores lacerado. 5
Manipulações dos gânglios nodosos são importantes na medida em que o gânglios nodosos e nervos vagos não sejam danificados durante a cirurgia. Técnica cirúrgica inadequada e crua pode danificar o gânglios nodosos e suas ramificações nervosas, juntamente com as artérias e os outros nervos cranianos. Neste protocolo, para estabilizar o nervo vago, nós fornecemos uma leve tensão para o vagus nervo via fio de seda anexado a um clipe micro. Isso nos permite limpar adequadamente qualquer tecido conjuntivo que pode tornar mais difícil para injetar no gânglio nodoso. Além disso, confirmamos que os gânglios nodosos estão intactas antes de prosseguir com a injeção através da indução de apnéia por infusão de 5-HT. Para injetar no gânglio nodoso, usamos pequeno calibre barato (28 G, OD 362 mm) agulhas ligadas a uma seringa de vidro de precisão. Desde profundidade no local da injecção para evitar a perfuração através do gânglios nodosos era uma preocupação, as pontas chanfradas das seringas foram personalizados com um ângulo mais vertical de 35 °. Isso é diferente de outras técnicas de microinjeção em que micropipetas de vidro são usados 8-10,14-16 A vantagem de micropipetas de vidro é um diâmetro da ponta menor.; No entanto, existe o risco de quebrar a ponta durante o processo devido à fragilidade do vidro. Além disso, o equipamento caro é necessário para retirar a micropipeta de vidro, que não possuem todos os laboratórios pode. As agulhas feitos sob medida não tem nenhum risco de quebrar, e se fossem de maior diâmetro (362 mm) 17 em comparação com micropipetas de vidro (20-100 ul), 8,9,14-16 as agulhas ainda eram pequenos o suficiente para gânglios nodosos injecções. Além disso, essas agulhas eram reutilizáveis para muitos experimentos e foram consideráveis menos despesa do que o equipamento usado para puxar micropipetas.
Devido ao tamanho das mercadorias-agulhas usadas para injecção em gânglios nodosos, é importante para avaliar os danos, se os houver, para os gânglios nodosos. Um método de avaliação dos danos ao gânglios nodosos é através do processamento histológico e microscopia do gânglios nodosos. 6-9,13,15 Um segundo método, que é usado neste protocolo, para avaliar a função vagais aferentes é comparar os resultados eletrofisiológicos ou comportamentais entre grupos experimentais e de controlo de injecção. 14-17 dronabinol injecções foram mostrados para atenuar 5-HT-induzida em comparação com apneia cONTROLE injeções, 17 significando que, se houve algum dano das maiores agulhas personalizados diâmetro, havia células nodosos funcionais ainda suficientes gânglios que foram inibidas por dronabinol. Da mesma forma, a quantificação do grau de difusão do 5 ul de dronabinol em óleo não é necessário uma vez que os resultados funcionais (ou seja, de apneia) foram a métrica importante deste protocolo. O volume utilizado neste protocolo foi escolhido para garantir a ampla difusão da solução injetada no gânglios nodosos. Em outros protocolos semelhantes, os volumes injectados não eram excessivamente diferente e variou de 0,1 a 3 mL. 8,9,14-16 A extensão da difusão de dronabinol de óleo foi suficiente para atenuar 5-HT induzido por apneia. 17
Modificações deste protocolo são possíveis. Em primeiro lugar, se a prevenção de danos para os gânglios nodosos é uma necessidade, agulhas de menor calibre menor (33 L) pode ser utilizado no presente protocolo. A desvantagem de se utilizar um gau menoragulhas GE é: 1) eles podem ser facilmente quebrada ou dobrada; 2) que o diâmetro interno é muito pequeno para permitir a injecção de fluidos viscosos tais como o óleo de sésamo. Além disso, se o local de injecção profundidade é importante, mais agulhas verticais angulares (até 45 °) podem ser adquiridos. No entanto, um ângulo mais vertical fará com que seja mais difícil de perfurar os gânglios nodosos. Durante a injecção de gânglios nodosos, modificando a tensão do nervo vago pode ser alterada colocando micro pinças de vários tamanhos. Se o dano ao nervo vago / gânglios nodosos deve ser evitada, em seguida, usando micro pinças de pequena dimensão é ideal. Por fim, a injecção de fluidos contendo neurotransmissores pode ser modificado por via do volume e concentração de fluido injectado. Neste protocolo, 5 jul era mais do que suficiente para saturar o gânglios nodosos.
Uma das principais limitações deste protocolo é a possibilidade de perfurar através do gânglios nodosos. Se isto ocorre, em seguida, re-confirmação da integridade da sho gânglios nodososuld ser feito. Se a integridade do gânglios nodosos é confirmada, em seguida, gânglios nodosos de injecção pode ser repetida. No entanto, se houver dúvida sobre a integridade do gânglios nodosos, em seguida, uma experiência com um novo rato deve ser concluída. 17
A diversidade de receptores na gânglios nodosos pode aumentar ou inibir a actividade do nervo aferente. Uma evidência crescente sugere que nunca aferente actividade desempenha um importante papel em doenças humanas. 2-4,23 Este protocolo fornece um método barato de administração local de neurotransmissores para o gânglios nodosos de estudar o seu efeito sobre a actividade do nervo aferente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pelo National Institutes of Health (Grant 1UM1HL112856).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog. Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Carley, D. W., Radulovacki, M. Pharmacology of vagal afferent influences on disordered breathing during sleep. Respir. Physiol. Neurobiol. 164 (1-2), 197-203 (2008).
- Kuo, P., Holloway, R. H. Beyond acid suppression: new pharmacologic approaches for treatment of GERD. Curr. Gastroenterol. Rep. 12 (3), 175-180 (2010).
- Maher, S. A., Dubuis, E. D., Belvisi, M. G. G-protein coupled receptors regulating cough. Curr. Opin. Pharmacol. 11 (3), 248-253 (2011).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. , Hafner. (1963).
- Li, Y., Wu, X., Zhou, S., Owyang, C. Low-affinity CCK-A receptors are coexpressed with leptin receptors in rat nodose ganglia: implications for leptin as a regulator of short-term satiety. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (2), 217-227 (1152).
- Powley, T. L., et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Auton. Neurosci. 177 (2), 129-142 (2013).
- Neuhuber, W. L. Sensory vagal innervation of the rat esophagus and cardia: a light and electron microscopic anterograde tracing study. J. Auton. Nerv. Syst. 20, 243-255 (1987).
- Rogers, R. C., Nasse, J. S., Hermann, G. E. Live-cell imaging methods for the study of vagal afferents within the nucleus of the solitary tract. J. Neurosci. Methods. 150 (1), 47-58 (2006).
- Wan, S., et al. Presynaptic melanocortin-4 receptors on vagal afferent fibers modulate the excitability of rat nucleus tractus solitarius neurons. J. Neurosci. 28 (19), 4957-4966 (2008).
- Verberne, A. J., Lewis, S. J., Jarrott, B., Louis, W. J. Bezold-Jarisch reflex is inhibited by excitotoxin-induced destruction of vagal primary afferent neurons. Eur. J. Pharmacol. 139 (3), 365-367 (1987).
- Lewis, S. J., et al. Excitotoxin-induced degeneration of rat vagal afferent neurons. Neuroscience. 34 (2), 331-339 (1990).
- Wallick, D. W., Dunlap, M. E., Stuesse, S. S., Thames, M. D. Denervation of vagal cardiopulmonary receptors by injection of kainic acid into the nodose ganglia in dogs. Auton. Neurosci. 102 (1-2), 85-89 (2002).
- Muroi, Y., et al. Selective inhibition of vagal afferent nerve pathways regulating cough using Nav 1.7 shRNA silencing in guinea pig nodose ganglia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304 (11), 1017-1023 (2011).
- Kollarik, M., et al. Transgene expression and effective gene silencing in vagal afferent neurons in vivo using recombinant adeno-associated virus vectors. J. Physiol. 588 (21), 4303-4315 (2010).
- Zhang, Z., Zhang, C., Zhou, M., Xu, F. Activation of opioid mu-receptors, but not delta- or kappa-receptors, switches pulmonary C-fiber-mediated rapid shallow breathing into an apnea in anesthetized rats). Respir. Physiol. Neurobiol. 183 (3), 211-217 (2012).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. Intranodose ganglion injections of dronabinol attenuate serotonin-induced apnea in Sprague-Dawley rat. Respir. Physiol. Neurobiol. 190, 20-24 (2014).
- Yoshioka, M., Goda, Y., Togashi, H., Matsumoto, M., Saito, H. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine-induced apnea in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 260 (2), 917-924 (1992).
- Kopczynska, B., Szereda-Przestaszewska, M. 5HT2 and 5HT3 receptors' contribution to modeling of post-serotonin respiratory pattern in cats. Life Sci. 75 (19), 2281-2290 (2004).
- Fan, P. Cannabinoid agonists inhibit the activation of 5-HT3 receptors in rat nodose ganglion neurons. J. Neurophysiol. 73 (2), 907-910 (1995).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J. Vis. Exp. (59), (2012).
- Barann, M., et al. Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site. Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).
- Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).
