Protocol
Alla förfaranden och protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Illinois i Chicago. Experiment som beskrivs här är akut icke-överlevnadsexperiment, och det fanns ingen användning av ögonsalva. Underhåll av sterila betingelser sker bara när kirurgiska instrument tvättas med 70% etanol i DIH 2 O. Offer av råttor vid slutet av experimentet skett via överdos av IV ketamin / xylazin.
1. Beredning av instrument och kemikalier
- Bered stamlösning av 0,05 M av 5-HT-HCl i PBS. Späd sedan lager med PBS till en slutlig 5-HT koncentration av 0,203 mM.
- Späd dronabinol i sesamolja i en koncentration av 20 ug / ul.
- Skär 20 cm längd av polyetylen (PE) -50-slang (ID 0,58 mm, YD 0,965 mm). I ena änden av röret, skär en avfasning spets med sax, och vid den andra fyrkantiga änden, infoga en 23 g nål. Anslut denna 23 g nål till en 1 mlspruta och fylla det med 0,3 ml 50 u / ml heparin.
- Skär fyra stycken 4-0 flätat silkestråd och ställ åt sidan.
- Sterilisera kirurgisk sax, två böjda Graefe pincett, och 3 mikro klämmor med 70% etanol i DIH 2 O.
2. Kateterisering av femoralven
Protokoll för kateterisering är modifierad från Jespersen et al. 21
- Bedöva en Sprague-Dawley-råtta med en intraperitoneal (IP) ketamin / xylazin (100 mg / kg: 10 mg / kg). Nyp tån på råtta och iaktta eventuella rörelser för att bekräfta en lämplig nivå av anestesi. Raka den ventrala aspekten av det vänstra låret, och den ventrala aspekten av halsen. Vid behov av den lokala Institutional Animal Care och användning kommittén, applicera ögonsalva att förhindra torrhet.
- Säker råttan i ryggläge på en kirurgisk ombord. Använd kirurgiska sax för att klippa bort hud i vänster bakben låret.
- Använd pincett, uppförande trubbigt dissection av den ytliga muskeln att exponera lårbensvenen. Använd pincett för att separera venen från lårbensartären, och placera 2 trådar runt lårbensvenen.
- Använd böjda Graefe pincett för att dra upp venen att stoppa blodflödet. Med hjälp av en 22 G sprutnål, punktera höftbensvenen och sedan in avfasade änden av PE-50 slang i venen.
- Kontrollera om PE-50 slang korrekt insatt genom att dra tillbaka sprutkolven. Blod bör ses in i PE-50 slang. Knyt 2 knop runt venen och PE-50 slang med hjälp av de 2 trådar.
3. 5-HT-inducerad Apnea via IV infusion
- Placera en piezoelektrisk töjningsmätare runt råttan att mäta andningen.
- Ändra inställningar för förstärkningsnivån för elektronisk förstärkare via förstärkare programvara på datorn: att förstärka (100x) och bandpassfilter (1-10 Hz) andnings signaler som erhålls från trådtöjningsgivare, ställ in "highpas filter" på & #8220; AC @ 1 HZ "och" lågpassfilter "på" 10 Hz "och ställ in förstärkningen genom att mata in" 10 "för" Initial Gain "och" 100 "för" Total Gain "..
- Ändra inställningar för samplingsfrekvens genom att öppna "Analog ingång" via inspelningsprogram på datorn. Att digitalisera (500 Hz samplingsfrekvens) använder en analog-till-digital-omvandlare, "prov" på "1000 Hz" och "hoppa" varannan inspelningspunkt med "1" (effektiv samplingsfrekvens 500 Hz), och sedan spela in signalen med hjälp av inspelningsprogram.
- Ta 1 ml sprutan från katetern och sätt en 500 pl precisionsglasspruta fylld med 0,203 mM av 5-HT i katetern.
- Placera precisionsglasspruta 500 l i en infusionspump. Infundera 12,5 ng / kg per 350 | il / kg av 5-HT-lösning vid en hastighet av 63 ml / h. Utför flera infusioner och observera apné hos råtta, som ses ensr paus att andas (≥ 2,5 sek) i inspelade andnings signaler på datorskärmen.
- Innan halskirurgi, övervaka andningsmönster och kontrollera smärtreflex från tå nypa i råtta. Om andningen är oregelbunden eller om det finns en smärtreflex från tå nypa, administrera IP ketamin / xylazin (100 mg / kg: 5 mg / kg) och sedan åter bekräfta en lämplig nivå av anestesi.
4. Neck Surgery att Expose KNUTIG Ganglia
- Säker råttan i ryggläge på en kirurgisk ombord. Gör en mittlinjen längsgående snitt med kirurgiska saxar i nacken.
- Använda dissektion på Platysma (med 2 mikro klämmor för att hålla denna muskel klart av operationsområdet), exponera sternohyoideus och omohyoideus muskler. Separera dessa muskler för att exponera inre halspulsådern och en av dess grenar, den pterygopalatine artär.
- Observera vagusnerven som det löper längs inre halspulsådern och sedan längs th e pterygopalatine artär. Observera hur vagusnerven och pterygopalatine artär, tillsammans med glossopharyngeus nerv (kranialnerven IX) och spinal tillbehörsnerven (kranialnerven XI), ange bakre sargade foramen vid basen av skallen.
- Observera att KNUTIG ganglion visas som en svullnad av vagusnerven precis innan det går in de bakre sargade foramen. Lägg också märke till att svalg och struphuvud nervgrenar lossna de främre och bakre delar, respektive, för KNUTIG ganglion. 5
- Använda Graefe pincett, separera vagusnerven från artärerna, och placera en bit tråd runt vagusnerven. Placera en klämma på tråden att tillämpa lätt spänning på vagusnerven, och rengör KNUTIG ganglion någon bindväv för att ge mindre motstånd när du injicerar.
- Upprepa 5-HT-inducerad apné som anges i avsnitt 3 för att bekräfta att ingen skada skedde på KNUTIG ganglierna.
- Fyll en gastät precisionsglasspruta 10 l försedda med en skräddarsydd 28 g halv tum spruta nål med en 35 ° avfasade spets med 5 pl dronabinol i sesamolja.
- Placera en mikro klämma på tråden att tillämpa lätt spänning på vagusnerven, och punktera KNUTIG ganglion se till att inte punktera genom den. Tryck sprutan långsamt (≥ 60 sek) för att injicera hela innehållet i sprutan. Observera att en del av sprutans innehåll kommer att läcka ut från ganglion.
- Upprepa 5-HT-inducerad apné som anges i avsnitt 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 representerar provandnings inspelning i råttor som hade infusion av 5-HT att inducera apné före och efter intranodose ganglia injektioner av dronabinol. 5-HT aktiverar 5-HT 3 receptorer på KNUTIG ganglier som bidrar till Bezold-Jarisch-reflexen av bradykardi, hypotoni och apné. 11,17-19 Intranodose ganglia injektioner av dronabinol aktiverar inhibitoriska CB-receptorer, eller allosteriskt modulerar 5-HT 3 receptorer som hämmar 5-HT-inducerad excitation av vagusnerven. 16,17,20,22 Före (Figur 1, övre panelen) och efter (Figur 1, mellersta panel) halskirurgi infusions av 5-HT (Figur 1 , åtalats av röd linje) framkallar en apnoisk svar ses som en brist på buken rörelse mäts av piezoelektriska töjningsgivare. Efter intranodose ganglierna injektioner av dronabinol (Figur 1, bottenpanel), gjorde IV 5-HT infusion inte framkallaen apnoisk respons. Efter sesamolja injektioner (data visas ej) i KNUTIG ganglier fordonskontrollråttor, IV 5-HT infusion framkallade en apnoisk svar jämförbar med baslinjer. 17
Figur 1:. Prov inspelningar från akut 5-HT-indudced apné experiment före och efter 100 ug dronabinol i 5 pl sesamolja injektioner i KNUTIG ganglierna av vagus nerver 17 Andnings inspelningar togs före operation (övre panelen), efter operation ( mellersta panel), och efter KNUTIG ganglierna injektioner (nedre panelen). Röd linje betecknar IV 5-HT infusion för att inducera apné. Efter sesamolja injektioner (data visas ej) i KNUTIG ganglier fordonskontrollråttor, IV 5-HT infusion framkallade en apnoisk svar jämförbar med baslinjer. 17 Denna siffra har modifierats Calik et al. 17AU = godtyckliga enheter; RESP = andnings.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska stegen för framgångsrik injektion av neurokemikalier till KNUTIG ganglierna är: 1) identifiera och rengöring av bindväv från KNUTIG ganglier; 2) bekräftar integriteten för KNUTIG ganglier före injektion; 3) och med användning av en liten gauge nål för att försiktigt injicera i, men inte fullständigt punktera igenom, den KNUTIG ganglierna.
Vagusnerven innervates många organ i halsen och buken, och förmedlar viktig information såsom hjärtfrekvens, blodtryck, bronkopulmonell irritation, och gastrointestinal buk till CNS. Den KNUTIG ganglierna av vagusnerven innehålla en mångfald av receptorer för aminosyror, monoaminer, neuropeptider och andra neurochemicals. 1 Intranodose ganglier injektioner av neurokemikalier för dessa receptorer för att modifiera aktiviteten av vagusnerven har gjorts förut, 16,17 och utgör en utmärkt experimentell modell för att belysa perifer pharmacological effekter på vagusnerven som kan modifiera sjukdomar såsom sömnapné, gastroesofageal refluxsjukdom, eller kronisk hosta. 2-4
Att exponera KNUTIG ganglierna, är halskirurgi bedrivs och musklerna i nacken är separerade för att exponera inre hals. Vagus nerver sett löper längs inre hals och pterygopalatine artärerna. Cell kroppar unipolära vagus nerverna finns i KNUTIG och petrosal ganglier, vilket ses som en svullnad av vagus nerverna innan de kommer till skallen på de bakre sargade foramens. 5
Manipulationer av KNUTIG ganglierna är viktiga i den mån att den KNUTIG ganglierna och vagus nerver inte skadas under operationen. Felaktig och rå kirurgisk teknik kan skada KNUTIG ganglierna och dess nervgrenar, tillsammans med artärer och de andra kranialnerver. I detta protokoll för att stabilisera vagusnerven, ger vi en liten spänning till vagus nerv via silkestråd kopplad till en mikro klipp. Detta gör att vi kan rengöra någon bindväv som kan göra det svårare att injicera i KNUTIG ganglion adekvat. Dessutom bekräftar vi att de KNUTIG ganglierna är intakt innan du fortsätter med injektion genom att inducera apné med 5-HT infusion. Att injicera i KNUTIG ganglion, använde vi billig liten mätare (28 G, OD 362 nm) nålar fästa vid en precisionsglasspruta. Eftersom injektionsstället djup för att förhindra punktering genom KNUTIG ganglierna var ett bekymmer, de fasade tips av sprutorna var skräddarsydd med en mer vertikal vinkel på 35 °. Detta skiljer sig från andra mikroinjektion tekniker där glasmikropipetter används 8-10,14-16 Fördelen med glasmikropipetter är en mindre spets diameter. finns det dock risk för att bryta spetsen under förfarandet på grund av skörhet av glas. Dessutom behövs dyr utrustning för att dra glasmikropipett, vilket inte varje labb kan ha. De skräddarsydda nålar har ingen risk för att bryta, och även om de var av större diameter (362 nm) 17 jämfört med glasmikropipetter (20-100 il), 8,9,14-16 nålarna var ändå tillräckligt liten för KNUTIG ganglier injektioner. Dessutom är dessa nålar var återanvändas för många experiment och var avsevärt lägre kostnad än utrustning som används för att dra mikropipetter.
På grund av storleken på de anpassade-nålar som används för injektion i KNUTIG ganglier, är det viktigt att bedöma skadorna, om någon, till KNUTIG ganglierna. En metod för att bedöma skador på KNUTIG ganglierna är genom histologisk bearbetning och mikroskopi av KNUTIG ganglierna. 6-9,13,15 En andra metod, som används i detta protokoll, för att bedöma vagala afferenta funktionen jämföra elektrofysiologiska eller beteende utfall mellan experiment- och kontrollinjektionsgrupperna. 14-17 dronabinol injektioner har visat sig dämpa 5-HT-inducerad apné jämfört med cKONTROLL injektioner, 17 vilket innebär att om det fanns några skador från de större anpassade diameter nålar, fanns det fortfarande tillräckligt funktionella KNUTIG ganglierna celler som hämmas av dronabinol. Likaså kvantifiera omfattningen av spridningen av 5 il dronabinol i olja är inte nödvändigt eftersom funktionella utfall (dvs, apné) var det viktigt mått av detta protokoll. Volymen används i detta protokoll har valts för att garantera bred spridning av lösningen injiceras i KNUTIG ganglierna. I andra liknande protokoll, injicerade volymerna var inte alltför olika och varierade från 0,1 till 3 | j, l. 8,9,14-16 Omfattningen av diffusion av dronabinol av olja var tillräcklig för att dämpa 5-HT-inducerad apné. 17
Ändringar av detta protokoll är möjliga. Först, om skador förebyggande till den KNUTIG ganglierna är en nödvändighet, mindre nålar (minsta 33 G) kan användas i detta protokoll. Nackdelen med att använda en mindre gauGE nålar är: 1) de lätt kan brytas eller böjas; 2) De innerdiametern är för liten för att medge injektion av viskösa fluider såsom sesamolja. Dessutom, om djupet site injektion är viktigt, flera vertikala vinkel nålar (upp till 45 °) kan köpas. Dock kommer en mer vertikal vinkel gör det svårare att punktera KNUTIG ganglierna. Under insprutningen av det KNUTIG ganglierna, kan modifiera spänningen av vagusnerven ändras genom att placera mikro klämmor av olika storlekar. Om skador på vagus nerver / KNUTIG ganglierna måste förhindras, sedan använda mindre mikro klämmor är perfekt. Slutligen kan injektion av vätskor som innehåller neurokemikalier modifieras via volym och koncentration av vätska injiceras. I detta protokoll 5 pl var mer än tillräckligt för att mätta KNUTIG ganglierna.
En viktig begränsning av detta protokoll är möjligheten att punktera genom KNUTIG ganglierna. Om detta inträffar, sedan åter bekräftelse på integritet KNUTIG ganglierna should göras. Om integriteten hos KNUTIG ganglierna bekräftas, därefter KNUTIG ganglierna injektion kan upprepas. Men om det råder tvivel om integritet KNUTIG ganglierna, sedan ett experiment med en ny råtta bör slutföras. 17
Mångfalden av receptorer på KNUTIG ganglierna kan öka eller hämma afferenta nervaktivitet. Ökande bevis föreslår att afferenta aldrig aktivitet spelar en viktig roll i mänskliga sjukdomar. 2-4,23 Protokollet ger en billig metod för lokal administrering av neurokemikalier till KNUTIG ganglierna att studera deras effekt på afferenta nervaktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Institutes of Health (Grant 1UM1HL112856).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog. Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Carley, D. W., Radulovacki, M. Pharmacology of vagal afferent influences on disordered breathing during sleep. Respir. Physiol. Neurobiol. 164 (1-2), 197-203 (2008).
- Kuo, P., Holloway, R. H. Beyond acid suppression: new pharmacologic approaches for treatment of GERD. Curr. Gastroenterol. Rep. 12 (3), 175-180 (2010).
- Maher, S. A., Dubuis, E. D., Belvisi, M. G. G-protein coupled receptors regulating cough. Curr. Opin. Pharmacol. 11 (3), 248-253 (2011).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. , Hafner. (1963).
- Li, Y., Wu, X., Zhou, S., Owyang, C. Low-affinity CCK-A receptors are coexpressed with leptin receptors in rat nodose ganglia: implications for leptin as a regulator of short-term satiety. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (2), 217-227 (1152).
- Powley, T. L., et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Auton. Neurosci. 177 (2), 129-142 (2013).
- Neuhuber, W. L. Sensory vagal innervation of the rat esophagus and cardia: a light and electron microscopic anterograde tracing study. J. Auton. Nerv. Syst. 20, 243-255 (1987).
- Rogers, R. C., Nasse, J. S., Hermann, G. E. Live-cell imaging methods for the study of vagal afferents within the nucleus of the solitary tract. J. Neurosci. Methods. 150 (1), 47-58 (2006).
- Wan, S., et al. Presynaptic melanocortin-4 receptors on vagal afferent fibers modulate the excitability of rat nucleus tractus solitarius neurons. J. Neurosci. 28 (19), 4957-4966 (2008).
- Verberne, A. J., Lewis, S. J., Jarrott, B., Louis, W. J. Bezold-Jarisch reflex is inhibited by excitotoxin-induced destruction of vagal primary afferent neurons. Eur. J. Pharmacol. 139 (3), 365-367 (1987).
- Lewis, S. J., et al. Excitotoxin-induced degeneration of rat vagal afferent neurons. Neuroscience. 34 (2), 331-339 (1990).
- Wallick, D. W., Dunlap, M. E., Stuesse, S. S., Thames, M. D. Denervation of vagal cardiopulmonary receptors by injection of kainic acid into the nodose ganglia in dogs. Auton. Neurosci. 102 (1-2), 85-89 (2002).
- Muroi, Y., et al. Selective inhibition of vagal afferent nerve pathways regulating cough using Nav 1.7 shRNA silencing in guinea pig nodose ganglia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304 (11), 1017-1023 (2011).
- Kollarik, M., et al. Transgene expression and effective gene silencing in vagal afferent neurons in vivo using recombinant adeno-associated virus vectors. J. Physiol. 588 (21), 4303-4315 (2010).
- Zhang, Z., Zhang, C., Zhou, M., Xu, F. Activation of opioid mu-receptors, but not delta- or kappa-receptors, switches pulmonary C-fiber-mediated rapid shallow breathing into an apnea in anesthetized rats). Respir. Physiol. Neurobiol. 183 (3), 211-217 (2012).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. Intranodose ganglion injections of dronabinol attenuate serotonin-induced apnea in Sprague-Dawley rat. Respir. Physiol. Neurobiol. 190, 20-24 (2014).
- Yoshioka, M., Goda, Y., Togashi, H., Matsumoto, M., Saito, H. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine-induced apnea in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 260 (2), 917-924 (1992).
- Kopczynska, B., Szereda-Przestaszewska, M. 5HT2 and 5HT3 receptors' contribution to modeling of post-serotonin respiratory pattern in cats. Life Sci. 75 (19), 2281-2290 (2004).
- Fan, P. Cannabinoid agonists inhibit the activation of 5-HT3 receptors in rat nodose ganglion neurons. J. Neurophysiol. 73 (2), 907-910 (1995).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J. Vis. Exp. (59), (2012).
- Barann, M., et al. Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site. Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).
- Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).
