Protocol
所有的程序和协议批准了伊利诺伊大学芝加哥分校的机构动物护理和使用委员会。这里描述的实验是急性非存活实验中，也没有使用眼软膏。无菌条件下维持，只有当外科手术器械在DIH 2 O洗涤，用70％的乙醇发生大鼠在实验结束时牺牲经由第IV氯胺酮/赛拉嗪的药物过量发生。
1.准备仪器和化学品
- 制备0.05M的5-羟色胺的盐酸在PBS原液。然后稀释股票与PBS到最终5-HT的0.203毫米的浓度。
- 稀屈大麻酚在芝麻油在20微克/微升的浓度。
- 切聚乙烯20厘米长（PE）的-50油管（ID0.58毫米，外径0.965毫米）。在管道的一端，切割用剪刀斜面尖端，而在另一方端，插入一个23克针。此23克针连接到1毫升注射器，并填写了0.3毫升50 U / ml肝素。
- 切成四片4-0编织丝线，并设置到侧。
- 消毒手术剪，2弯曲格雷夫钳，并用70％乙醇3微夹钳在DIH 2 O.
2.导管股静脉
协议导管从耶斯佩森等进行修改。21
- 麻醉一个的Sprague-Dawley大鼠腹膜内（IP）的氯胺酮/赛拉嗪（100毫克/公斤10毫克/公斤）。捏的大鼠的脚趾和观察到任何运动，以确认麻醉的一个适当的水平。剃左大腿的腹侧部分，而颈的腹面。如果由本地机构动物护理和使用委员会必要，应用眼膏，以防止干燥。
- 安全大鼠在手术板仰卧位置。用手术剪剪去皮肤左后肢大腿。
- 使用镊子，行为钝dissection个肤浅的肌肉暴露股静脉。使用镊子到静脉从股动脉中分离出来，并将其放置2个线程围绕股静脉。
- 使用弯曲格雷夫钳拉静脉阻止血液流动。用22克注射器针头，穿刺股静脉，然后插入PE-50管插入静脉的倾斜端。
- 检查是否在PE-50管材是由回缩注射器的柱塞正确插入。血液应被视为进入的PE-50管材。配合周围的静脉和PE-50管2节使用2个线程。
3.通过静脉输注5-HT引起的呼吸暂停
- 周围放置老鼠的压电应变计来测量呼吸。
- 用于经由放大器软件的电子放大器在计算机上的放大电平改变设置：扩增（100X）和带通滤波器（1-10赫兹）从所述应变仪获得的呼吸信号中，设置“highpas滤波器”在＆＃8220; AC @ 1 HZ“和”低通滤波器“，在”10赫兹“，并通过输入设定放大”10“为”初始增益“和”100“的”总收益“。
- 由通过录音软件的计算机上打开“模拟输入”更改设置采样率。以使用模拟 - 数字转换器，“样品”在“1000赫兹”和数字化（500赫兹的采样速率）“跳过”由“1”（有效抽样率500赫兹）每隔一个的记录点，然后记录该信号使用刻录软件。
- 取出1ml注射器从导管和插入一个500μl的精密玻璃注射器填充有0.203毫5-HT的进入导管。
- 放置500微升精密玻璃注射器插入输液泵。注入12.5微克/千克每350微升/ kg的5-羟色胺的溶液在63毫升/小时的速度。执行多个输液，观察呼吸暂停大鼠，这被看作一个SA暂停在计算机显示器上所记录的呼吸呼吸信号（≥2.5秒）。
- 在继续进行颈部手术，监测呼吸模式，并检查疼痛反射从脚趾捏在大鼠。如呼吸不规则，或如果从脚趾捏痛反射，管理IP氯胺酮/甲苯噻嗪（100毫克/公斤：5毫克/千克），然后再确定麻醉的适当水平。
4.头颈外科杂志揭露节状神经节
- 安全大鼠在手术板仰卧位置。使用手术剪在颈部正中纵向切。
- 在颈阔肌（使用2微夹具保持这一肌肉清晰的手术部位的）使用钝性分离，露出胸骨舌骨肌和omohyoideus肌肉。分开这些肌肉，露出颈内动脉及其分支之一，翼腭动脉。
- 观察的迷走神经，因为它沿内颈动脉运行，然后沿第 Ë翼腭动脉。观察一下迷走神经和翼腭动脉，随着舌咽神经（颅神经IX）与副神经（脑神经XI），进入后撕裂孔在颅底。
- 注意，结状神经节被显示为迷走神经在进入后撕裂孔权之前的膨胀。还要注意，咽和喉上神经分支来的结状神经节的断前部和后部方面，分别为5
- 使用格雷夫镊子，从动脉分开的迷走神经，并将其放置一块螺纹围绕迷走神经。放置在线程上的夹具上应用迷走神经轻微张力，和清洁任何结缔组织的结状神经节注入时提供较小的阻力。
- 重复5-HT引起的呼吸暂停在第3节规定，确认无损伤做是为了结状神经节。
- 补贴有特制28克半英寸的注射器针头斜面尖端5微升屈大麻酚的香油35°10微升气密精密玻璃注射器。
- 放置在线程上的微型钳施加于迷走神经张力轻微，并刺破结状神经节，注意不要刺穿它。压下注射器缓慢（≥60秒）注入注射器的全部内容。注意，某些在注射器内容将漏出的神经节。
- 在第3节规定，重复5-HT引起的呼吸暂停。
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Representative Results
图1表示在大鼠中有输注5-HT的前后intranodose神经节注射屈大麻酚诱导呼吸暂停呼吸样本记录。 5-HT的激活的5-HT 3受体上的结状神经节，有助于心动过缓，低血压和呼吸暂停的的Bezold-Jarisch反射。11,17-19 Intranodose神经节注射屈大麻酚的激活抑制性的CB受体，或变构调节5-HT的3受体抑制16,17,20,22的迷走神经。对5-HT诱导的激发前（ 图1，上图）和后（ 图1，中图）颈部手术输注5-HT（ 图1中由红线起诉）引发视为由压电应变仪测得的腹部缺乏运动的呼吸暂停响应。后intranodose神经节注射屈大麻酚（ 图1，下图），第IV 5-HT的输注没有引起一个呼吸暂停的响应。后芝麻油注射（数据未示出）进入的车辆控制大鼠结状神经节，第IV 5-HT的输注引起的呼吸暂停响应可比基准。17
图1：从之前和之后为100μg屈大麻酚于5μl芝麻注射到迷走神经的结状神经节油急性5-HT indudced呼吸暂停实验样本记录 17呼吸系统录音被采取手术（顶面板）前，手术后（中间面板），和节状神经节注射后（下图）。红线表示IV 5-HT输液诱发呼吸暂停。后芝麻油注射（数据未示出）进入的车辆控制大鼠结状神经节，第IV 5-HT的输注引起的呼吸暂停响应可比基准。17这一数字已经被修改Calik 等人 17AU =任意单位; RESP =呼吸。
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Discussion
的关键步骤成功注射神经化学物质的进节状神经节是：1）识别和清洁结缔组织断节状神经节; 2）确认注射前的结状神经节的完整性; 3）和使用小型量规针以微妙注入，但不能完全通过删截，所述结状神经节。
迷走神经支配许多器官在颈部和腹部，并传递重要的信息，如心脏速率，血压，支气管发炎，和胃肠膨胀到中枢神经系统。迷走神经的结状神经节包含受体氨基酸，单胺，神经肽和其他神经化学物质的多样化。1 Intranodose神经节注射神经化学物质的那些受体的修改的迷走神经的活性已经做过，16,17并代表一个很好的实验模型，以阐明外围pharmacologi上的迷走神经，可以修改的疾病，如睡眠呼吸暂停，胃食管反流病，或慢性咳嗽校准的效果。2-4
以暴露的结状神经节，颈部手术进行和颈部肌肉分开以暴露颈内。迷走神经被视为沿着颈内动脉和翼腭动脉运行状态。单极迷走神经的细胞体位于结状和岩神经节，这被看作是进入颅骨在后撕裂foramens前迷走神经的肿胀。5
的结状神经节的操作是重要的，只要该结状神经节和迷走神经在手术过程中不被损坏。不当和粗手术技术能破坏结状神经节和其神经分支，随着动脉和其他脑神经。在这个协议中，以稳定所述迷走神经，我们提供了一个小的张力向vagu通过丝螺纹s神经附着到微剪辑。这使我们能够充分地清洁任何结缔组织，可能使之更难以注入结状神经节。此外，我们确认结状神经节是由5-HT输液引起呼吸暂停在进行注射前完好无损。注入到结状神经节中，我们使用廉价的小计（28克，外径362微米）附连到一个精密玻璃注射器针头。因为注射部位的深度，以防止通过节状神经节的穿刺是一个问题时，注射器的倾斜尖端被定义为35°的更垂直的角度进行。这不同于其中玻璃微用于其它显微注射技术8-10,14-16玻璃微量的优点是较小的尖端直径。然而，有在手术过程中的尖端断裂由于玻璃的脆性的危险。此外，昂贵的设备是需要拉玻璃微，这并不是每一个实验室可能拥有。量身定制针有突破的风险，虽然他们是大直径（362微米）17相比，玻璃微（20-100微升）的，8,9,14-16针仍足够小的结状神经节注射。此外，这些针头是可重复使用的许多实验和可观的费用不是用来拉微量的设备少。
由于用于注射入节状神经节的定制针的大小，它以评估损坏，如果有的话，对节状神经节是重要的。评估损坏的结状神经节中的一个方法是通过节状神经节的组织学处理和显微镜。6-9,13,15的第二种方法，它是用来在这个协议中，以评估迷走神经传入函数比较之间的电生理或行为结果实验组和对照组注射14-17屈大麻酚注射已经显示减弱5-HT诱导的呼吸暂停和C相比ONTROL注射，17标志着，如果有从大直径定制针一定的损伤，有由屈大麻酚受到抑制仍然不够实用结状神经节细胞。同样的，量化的5微升屈大麻酚油的扩散程度是没有必要的，因为功能性结果（ 即呼吸暂停）是本协议的重要指标。在这个协议中使用的体积被选择以保证注入的结状神经节的溶液的宽扩散。在其他类似的协议，注射体积为不会过度不同，从0.1到3微升之间。8,9,14-16油屈大麻酚的扩散的程度足以减弱5-HT诱导呼吸暂停。17
修改该协议是可能的。首先，如果预防损害结状神经节是必要的，更小的表针（最小33克），可以在这个协议中使用。的缺点，以利用较小GAUGE针是：1）它们可以容易地断裂或弯曲; 2）它们的内径太小，以允许注入粘性流体状香油。此外，如果深度部位注射是非常重要的，更多的垂直角度的针（高达45°）就可以买到。然而，更垂直角将使它更难刺穿结状神经节。在注射的结状神经节，迷走神经的张力改性可以通过将各种尺寸的微夹子来改变。如果损坏的迷走神经/节状神经节需要防止，则使用更小的微夹钳是理想的。最后，注射含有神经化学物质的液体可以通过体积和流体的浓度注射进行修改。在这个协议中，5微升了足够多的饱和结状神经节。
此协议的一个主要限制是通过节状神经节的穿刺的可能性。如果发生这种情况，则重新确认的结状神经节笑的完整性ULD完成。如果节状神经节的完整性得到证实，则节状神经节注射可以重复。但是，如果有疑问的结状神经节约的完整性，然后一个实验用一个新的大鼠应完成。17
受体的结状神经节的多样性会增加或抑制传入神经活动。越来越多的证据表明，传入从未活性在人类疾病中起重要作用。2-4,23该协议提供的神经化学物质的局部给药的一种廉价的方法，将节状神经节，以研究它们对传入神经 活动的效果。
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Acknowledgments
这项研究是由美国国立卫生研究院（批准1UM1HL112856）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
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