Protocol
Tutte le procedure e protocolli sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Illinois a Chicago. Gli esperimenti qui descritti sono esperimenti acuti non di sopravvivenza, e non c'era l'uso di unguento oculare. Mantenimento delle condizioni sterili verifica solo quando strumenti chirurgici vengono lavati con etanolo al 70% in DIH 2 O. Sacrificio di ratti alla fine dell'esperimento verificato tramite sovradosaggio di IV ketamina / xilazina.
1. Preparazione degli strumenti e prodotti chimici
- Preparare soluzione madre di 0,05 M di 5-HT HCl in PBS. Poi diluire azione con PBS a una concentrazione finale 5-HT di 0,203 mm.
- Diluire dronabinol in olio di sesamo ad una concentrazione di 20 mg / mL.
- Tagliare lungo 20 cm di polietilene (PE) -50 tubo (ID 0,58 millimetri, OD 0,965 millimetri). Ad una estremità del tubo, tagliare una punta conica con forbici, e all'altra estremità quadrata, inserire un ago 23 g. Collegare questo 23 g ago per un 1 mlsiringa e riempirlo con 0,3 ml di 50 U / ml di eparina.
- Tagliate quattro pezzi di filo di seta 4-0 intrecciato e impostato sul lato.
- Sterilizzare forbici chirurgiche, 2 pinze Graefe curve e 3 micro pinze con il 70% di etanolo in diH 2 O.
2. cateterizzazione di vena femorale
Protocollo per la cateterizzazione è modificato da Jespersen et al. 21
- Anestetizzare un ratto Sprague-Dawley con intraperitoneale (IP) ketamina / xilazina (100 mg / kg: 10 mg / kg). Pizzicare la punta del ratto e osservare qualsiasi movimento per confermare un adeguato livello di anestesia. Radere l'aspetto ventrale della coscia sinistra, e l'aspetto ventrale del collo. Se necessario, dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale locale, applicare una pomata oculare per prevenire la secchezza.
- Rat sicura in posizione supina su un bordo chirurgica. Usare le forbici chirurgiche per tagliare via la pelle nella coscia posteriore sinistra.
- Utilizzando pinze, condotta dissectio smussaton del muscolo superficiali per esporre la vena femorale. Utilizzare le pinze per separare la vena dalla arteria femorale, e mettere 2 filetti intorno alla vena femorale.
- Utilizzare le pinze Graefe curve di pull-up la vena a fermare il flusso di sangue. Usando una G 22 della siringa, forare la vena femorale e poi inserire l'estremità smussata del tubo PE-50 nella vena.
- Controllare se il tubo PE-50 è stato inserito correttamente ritraendo lo stantuffo della siringa. Il sangue deve essere visto entrare il tubo PE-50. Tie 2 nodi intorno alla vena e PE-50 tubo utilizzando le 2 fili.
3. 5-HT-indotta Apnea via IV Infusion
- Posizionare un estensimetro piezoelettrico intorno al topo per misurare la respirazione.
- Modifica delle impostazioni per livello di amplificazione dell'amplificatore elettronico via software amplificatore computer: per amplificare (100x) e filtro passa-banda (1-10 Hz) i segnali respiratori ottenuti dal estensimetro, set "filtro highpas" at & #8220; AC @ 1 HZ "e" filtro passa-basso "a" 10 Hz ", e impostare l'amplificazione inserendo" 10 "per il" guadagno iniziale "e" 100 "per" Total Gain "..
- Modificare le impostazioni per frequenza di campionamento con l'apertura di "ingresso analogico" via software di registrazione sul computer. Per digitalizzare (500 Hz frequenza di campionamento) con un convertitore analogico-digitale, "campione" a "1.000 Hz" e "saltare" ogni altro punto di registrazione da "1" (frequenza di campionamento effettiva 500 Hz), e si registra il segnale utilizzando il software di registrazione.
- Rimuovere la siringa 1 ml dal catetere e inserire 500 microlitri siringa di vetro riempita con precisione 0,203 mM di 5-HT nel catetere.
- Posizionare il 500 microlitri siringa di vetro di precisione in una pompa per infusione. Infondere 12,5 mg / kg a 350 ml / kg di soluzione di 5-HT ad una velocità di 63 ml / h. Eseguire infusioni multiple e osservare apnea nel ratto, che si vede undello SA pausa nella respirazione (≥ 2,5 sec) nei segnali respiratori registrati sul monitor del computer.
- Prima di procedere con la chirurgia del collo, monitorare modello di respirazione e controllare il dolore riflesso dal pizzico punta nel ratto. Se la respirazione è irregolare, o se c'è un riflesso dolore pizzico punta, amministrare IP ketamina / xilazina (100 mg / kg: 5 mg / kg) e poi ri-confermare un adeguato livello di anestesia.
4. Neck Surgery per esporre nodose gangli
- Rat sicura in posizione supina su un bordo chirurgica. Fare un taglio longitudinale mediana con le forbici chirurgiche al collo.
- Utilizzando smussa sul muscolo platisma (utilizzando 2 micro pinze per mantenere questo muscolo chiara del sito chirurgico), esporre i muscoli sternohyoideus e omohyoideus. Separare questi muscoli per esporre l'arteria carotide interna e uno dei suoi rami, l'arteria pterigopalatino.
- Osservare il nervo vago come corre lungo l'arteria carotide interna e poi lungo th e pterygopalatine arteria. Osservare come il nervo vago e arteria pterygopalatine, insieme con il nervo glossofaringeo (IX nervo cranico) e il nervo accessorio spinale (cranico XI nervo), entrano nel forame posteriori lacerati alla base del cranio.
- Si noti che il ganglio nodoso è visualizzato come un rigonfiamento del nervo vago giusto prima che entri i posteriori lacerato forame. Si noti inoltre che i faringei e nervo laringeo rami si staccano gli aspetti anteriore e posteriore, rispettivamente, del ganglio nodose. 5
- Utilizzando le pinze Graefe, separare il nervo vago dalle arterie, e mettere un pezzo di filo intorno al nervo vago. Posizionare un morsetto sul filo di applicare una leggera tensione sul nervo vago, e pulire il ganglio nodose di qualunque tessuto connettivo di fornire meno resistenza quando l'iniezione.
- Ripetere apnea-5-HT indotta come indicato nella sezione 3 per confermare che nessun danno è stato fatto ai gangli nodose.
- Riempire un 10 microlitri siringa di vetro di precisione a tenuta di gas apposto con 28 g di mezzo pollice ago della siringa su misura con un 35 ° smussato punta con 5 ml di dronabinol in olio di sesamo.
- Inserire un micro pinza sul filo di applicare leggera tensione sul nervo vago, e forare il ganglio nodoso facendo attenzione a non forare attraverso di essa. Premere la siringa lentamente (≥ 60 sec) per iniettare l'intero contenuto della siringa. Si noti che alcuni dei contenuti della siringa si fuoriuscire del ganglio.
- Apnea Ripeti 5-HT-indotta come indicato al punto 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figura 1 rappresenta registrazione respirazione campione in ratti che avevano infusione di 5-HT per indurre apnea prima e dopo le iniezioni gangli intranodose di dronabinol. 5-HT attiva 5-HT 3 recettori sulla gangli nodose che contribuiscono al riflesso Bezold-Jarisch di bradicardia, ipotensione, e apnea. 11,17-19 Intranodose iniezioni gangli di dronabinol attivano recettori CB inibitori, o modula allostericamente 5-HT 3 recettori che inibiscono l'eccitazione-5-HT indotta del nervo vago. 16,17,20,22 prima (figura 1, pannello superiore) e dopo (figura 1, pannello centrale) chirurgia del collo infusione di 5-HT (Figura 1 , incriminato dalla linea rossa) suscita una risposta apneic visto come una mancanza di movimento dell'addome misurato dal estensimetro piezoelettrico. Dopo iniezioni gangli intranodose di dronabinol (Figura 1, pannello inferiore), IV 5-HT infusione non ha provocatouna risposta apneic. Dopo le iniezioni di olio di sesamo (dati non riportati) in gangli nodose di ratti di controllo del veicolo, IV 5-HT infusione ha suscitato una risposta apneic paragonabile a linee di base. 17
Figura 1:. Registrazioni di esempio da esperimenti apnea acuta 5-HT-indudced prima e dopo 100 mg dronabinol a 5 iniezioni di olio di sesamo microlitri nel gangli nodose dei nervi vaghi 17 registrazioni respiratorie sono state prese prima della chirurgia (pannello superiore), dopo l'intervento chirurgico ( pannello centrale), e dopo le iniezioni gangli nodose (pannello inferiore). La linea rossa indica IV 5-HT infusione per indurre apnea. Dopo le iniezioni di olio di sesamo (dati non riportati) in gangli nodose di ratti di controllo del veicolo, IV 5-HT infusione ha suscitato una risposta apneic paragonabile a linee di base. 17 Questo dato è stato modificato da Calik et al. 17AU = unità arbitrarie; RESP = respiratoria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le fasi critiche per l'iniezione di sostanze neurochimiche successo nella gangli nodosi sono: 1) identificare e pulizia del tessuto connettivo off gangli nodosi; 2) confermando l'integrità dei gangli nodosi prima dell'iniezione; 3) e utilizzando un ago piccolo per iniettare delicatamente in, ma non completamente attraverso la puntura, gangli nodoso.
Il nervo vago innerva molti organi del collo e dell'addome, e trasmette le informazioni importanti come la frequenza cardiaca, la pressione sanguigna, irritazione broncopolmonare, e distensione gastrointestinale per il sistema nervoso centrale. La gangli nodose del nervo vago contengono una gamma diversificata di recettori per aminoacidi, monoamine, neuropeptidi e altre sostanze neurochimiche. 1 Intranodose iniezioni gangli di sostanze neurochimiche per tali recettori per modificare l'attività del nervo vago è stato fatto prima, 16,17 e rappresentano un ottimo modello sperimentale per chiarire pharmacologi perifericheeffetti CAL sul nervo vago che può modificare le malattie come l'apnea del sonno, malattia da reflusso gastroesofageo, o tosse cronica. 2-4
Per esporre i gangli nodosi, chirurgia del collo è condotto e muscoli del collo sono separati per esporre la carotide interna. I nervi vaghi sono visto correre lungo la carotide interna e le arterie pterigopalatino. I corpi cellulari dei nervi vaghi unipolari si trovano nella nodose e petroso gangli, che sono visti come un rigonfiamento dei nervi vaghi prima di entrare il cranio ai posteriori lacerato forami. 5
Manipolazioni dei gangli nodose sono importanti nella misura che i gangli nodose e nervi vaghi non vengono danneggiati durante l'intervento chirurgico. Tecnica chirurgica improprio e greggio può danneggiare i gangli nodosi e le sue diramazioni nervose, insieme alle arterie e altri nervi cranici. In questo protocollo, per stabilizzare il nervo vago, forniamo una leggera tensione alla vagus nervo via filo di seta attaccato ad un micro clip. Questo ci permette di pulire in modo adeguato qualsiasi tessuto connettivo che potrebbero rendere più difficile per iniettare nel ganglio nodoso. Inoltre, si conferma che i gangli nodose siano intatte prima di procedere con l'iniezione inducendo apnea da 5-HT infusione. Per iniettare nel ganglio nodoso, abbiamo usato piccolo calibro poco costoso (28 G, OD 362 micron) aghi collegati a una siringa di vetro di precisione. Dal profondità del sito di iniezione per evitare la puntura attraverso i gangli nodose era una preoccupazione, le punte smussati delle siringhe sono stati realizzati su misura con un angolo più verticale di 35 °. Ciò differisce da altre tecniche di microiniezione in cui vengono utilizzati micropipette di vetro 8-10,14-16 Il vantaggio di micropipette di vetro è una punta di diametro più piccolo.; Tuttavia, esiste il rischio di rottura della punta durante il procedimento a causa della fragilità del vetro. Inoltre, è necessaria costose attrezzature per tirare la micropipetta di vetro, che non tutti i laboratori può possedere. Gli aghi su misura non hanno rischio di rottura, e se fossero di diametro maggiore (362 micron) rispetto al 17 micropipette di vetro (20-100 mL), 8,9,14-16 gli aghi erano ancora abbastanza piccolo per gangli nodose iniezioni. Inoltre, questi aghi sono riutilizzabili per molti esperimenti e sono stati considerevoli spese meno di attrezzature utilizzate per tirare micropipette.
A causa delle dimensioni degli aghi personalizzati utilizzati per l'iniezione in gangli nodosi, è importante valutare i danni eventuali ai gangli nodoso. Un metodo di valutazione del danno al gangli nodose è attraverso l'elaborazione istologica e microscopia dei gangli nodose. 6-9,13,15 Un secondo metodo, che viene utilizzato in questo protocollo, per valutare la funzione afferente vagale è confrontare i risultati elettrofisiologici e comportamentali tra gruppi iniezione sperimentali e di controllo. iniezioni 14-17 dronabinol hanno dimostrato di attenuare 5-HT-indotta apnea rispetto al control iniezioni, 17 a significare che se ci fosse qualche danno da grandi aghi di diametro personalizzati, c'erano abbastanza ancora funzionali cellule gangliari nodose che sono stati inibiti da dronabinol. Allo stesso modo, quantificare il grado di diffusione del 5 ml di dronabinol in olio non è necessaria in quanto esiti funzionali (ad esempio, apnea) erano l'importante metrica di questo protocollo. Il volume usato in questo protocollo è stato scelto per garantire un'ampia diffusione della soluzione iniettata nel gangli nodoso. In altri protocolli simili, iniettati volumi non erano troppo diversi e variava da 0.1 a 3 microlitri. 8,9,14-16 Il grado di diffusione del dronabinol di olio era sufficiente per attenuare 5-HT-indotta apnea. 17
Modifiche a questo protocollo sono possibili. In primo luogo, se la prevenzione danni ai gangli nodosi è una necessità, aghi calibro più piccole (più piccola 33 G) può essere utilizzato in questo protocollo. Lo svantaggio di utilizzare un Gau più piccoloaghi ge è: 1) possono essere facilmente rotti o piegati; 2) hanno il diametro interno è troppo piccolo per consentire l'iniezione di fluidi viscosi come olio di sesamo. Inoltre, se al sito di iniezione profondità è importante, più aghi angolo verticale (fino a 45 °) possono essere acquistati. Tuttavia, un angolo più verticale renderà più difficile per forare la gangli nodose. Durante l'iniezione dei gangli nodosi, modificando la tensione del nervo vago può essere modificata inserendo micro morsetti di varie dimensioni. Se il danno al nervo vago / gangli nodose deve essere evitato, quindi utilizzando piccoli micro morsetti è l'ideale. Infine, l'iniezione di fluidi contenenti sostanze neurochimiche può essere modificato tramite il volume e la concentrazione di liquido iniettato. In questo protocollo, 5 microlitri è stato più che sufficiente per saturare gangli nodose.
Una limitazione importante di questo protocollo è la possibilità di pungere attraverso gangli nodoso. In questo caso, poi ri-conferma dell'integrità dei gangli sho nodoseULD essere fatto. Se l'integrità dei gangli nodosi viene confermata, allora iniezione gangli nodosi può essere ripetuta. Tuttavia, se vi è dubbio l'integrità dei gangli nodosi, poi un esperimento con un nuovo ratto dovrebbe essere completata. 17
La diversità dei recettori sulla gangli nodose può aumentare o inibire l'attività del nervo afferente. Crescente evidenza suggerisce che l'attività afferente non gioca un ruolo importante nelle malattie umane. 2-4,23 Questo protocollo fornisce un metodo economico di somministrazione locale di sostanze neurochimiche ai gangli nodosi di studiare il loro effetto sull'attività del nervo afferente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal National Institutes of Health (Grant 1UM1HL112856).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-HT HCl | MP Biomedicals | 215376591 | 12.5 µg/kg per 350 µl/kg |
| Dronabinol (Marinol) 10 mg Capsules (80 µg/µl) | AbbVie | NDC 0051-0023-21 | Dilute with sesame oil to 20 µg/µl |
| Sesame Oil | Sigma-Aldrich | S3547 | |
| Intramedic Polyethylene-50 | BD | 427411 | Ordered from VWR (Cat. # 63019-047) |
| Graefe Forceps | Roboz | RS-5138 | Two are needed |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz | RS-7441 | Three are needed |
| Piezoelectric Strain Gauge | Ambu | 813255-100 | |
| Data Acquisition USB Subsystems | DataWave Technologies | ||
| Sciworks Experimenter Software | |||
| CyberAmp | Axon Instruments | ||
| Syringe, 500 µl, Model 1750 TLL | Hamilton Company | 81220 | |
| Syringe, 10 µl, Model 1801 RN | 7659-01 | ||
| Needle, 28 G, Small Hub RN | 7803-02 | Point Style 4, Angle 35, Length 0.5 in |
References
- Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. Neurochemistry of the nodose ganglion. Prog. Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).
- Carley, D. W., Radulovacki, M. Pharmacology of vagal afferent influences on disordered breathing during sleep. Respir. Physiol. Neurobiol. 164 (1-2), 197-203 (2008).
- Kuo, P., Holloway, R. H. Beyond acid suppression: new pharmacologic approaches for treatment of GERD. Curr. Gastroenterol. Rep. 12 (3), 175-180 (2010).
- Maher, S. A., Dubuis, E. D., Belvisi, M. G. G-protein coupled receptors regulating cough. Curr. Opin. Pharmacol. 11 (3), 248-253 (2011).
- Greene, E. C. Anatomy of the rat. , Hafner. (1963).
- Li, Y., Wu, X., Zhou, S., Owyang, C. Low-affinity CCK-A receptors are coexpressed with leptin receptors in rat nodose ganglia: implications for leptin as a regulator of short-term satiety. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300 (2), 217-227 (1152).
- Powley, T. L., et al. Vagal afferent innervation of the lower esophageal sphincter. Auton. Neurosci. 177 (2), 129-142 (2013).
- Neuhuber, W. L. Sensory vagal innervation of the rat esophagus and cardia: a light and electron microscopic anterograde tracing study. J. Auton. Nerv. Syst. 20, 243-255 (1987).
- Rogers, R. C., Nasse, J. S., Hermann, G. E. Live-cell imaging methods for the study of vagal afferents within the nucleus of the solitary tract. J. Neurosci. Methods. 150 (1), 47-58 (2006).
- Wan, S., et al. Presynaptic melanocortin-4 receptors on vagal afferent fibers modulate the excitability of rat nucleus tractus solitarius neurons. J. Neurosci. 28 (19), 4957-4966 (2008).
- Verberne, A. J., Lewis, S. J., Jarrott, B., Louis, W. J. Bezold-Jarisch reflex is inhibited by excitotoxin-induced destruction of vagal primary afferent neurons. Eur. J. Pharmacol. 139 (3), 365-367 (1987).
- Lewis, S. J., et al. Excitotoxin-induced degeneration of rat vagal afferent neurons. Neuroscience. 34 (2), 331-339 (1990).
- Wallick, D. W., Dunlap, M. E., Stuesse, S. S., Thames, M. D. Denervation of vagal cardiopulmonary receptors by injection of kainic acid into the nodose ganglia in dogs. Auton. Neurosci. 102 (1-2), 85-89 (2002).
- Muroi, Y., et al. Selective inhibition of vagal afferent nerve pathways regulating cough using Nav 1.7 shRNA silencing in guinea pig nodose ganglia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304 (11), 1017-1023 (2011).
- Kollarik, M., et al. Transgene expression and effective gene silencing in vagal afferent neurons in vivo using recombinant adeno-associated virus vectors. J. Physiol. 588 (21), 4303-4315 (2010).
- Zhang, Z., Zhang, C., Zhou, M., Xu, F. Activation of opioid mu-receptors, but not delta- or kappa-receptors, switches pulmonary C-fiber-mediated rapid shallow breathing into an apnea in anesthetized rats). Respir. Physiol. Neurobiol. 183 (3), 211-217 (2012).
- Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. Intranodose ganglion injections of dronabinol attenuate serotonin-induced apnea in Sprague-Dawley rat. Respir. Physiol. Neurobiol. 190, 20-24 (2014).
- Yoshioka, M., Goda, Y., Togashi, H., Matsumoto, M., Saito, H. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine-induced apnea in the rat. J. Pharmacol. Exp. Ther. 260 (2), 917-924 (1992).
- Kopczynska, B., Szereda-Przestaszewska, M. 5HT2 and 5HT3 receptors' contribution to modeling of post-serotonin respiratory pattern in cats. Life Sci. 75 (19), 2281-2290 (2004).
- Fan, P. Cannabinoid agonists inhibit the activation of 5-HT3 receptors in rat nodose ganglion neurons. J. Neurophysiol. 73 (2), 907-910 (1995).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J. Vis. Exp. (59), (2012).
- Barann, M., et al. Direct inhibition by cannabinoids of human 5-HT3A receptors: probable involvement of an allosteric modulatory site. Br. J. Pharmacol. 137 (5), 589-596 (2002).
- Bonaz, B., Picq, C., Sinniger, V., Mayol, J. F., Clarencon, D. Vagus nerve stimulation: from epilepsy to the cholinergic anti-inflammatory pathway. Neurogastroenterol. Motil. 25 (3), 208-221 (2013).
