Abstract
Gibson montering (GA) kloning erbjuder en snabb, pålitlig och flexibelt alternativ till konventionella DNA kloningsmetoder. Vi använde GA att skapa anpassade plasmider för uttryck av exogena gener i möss embryonala stamceller (mESCs). Expression av exogena gener under kontroll av SV40 eller humant cytomegalovirus promotorer minskar snabbt efter transfektion in mESCs. En åtgärd för detta minskade uttrycket är att använda den humana förlängningsfaktor-1 alfa (hEF1α) promotorn för att driva genuttryck. Plasmidvektorer innehåller hEF1α är inte så tillgänglig som SV40- eller CMV-innehållande plasmider, särskilt de som även innehåller N-terminala 3xFLAG-taggar. Protokollet som beskrivs här är en snabb metod för att skapa plasmider som uttrycker FLAG-märkt CstF-64 och CstF-64 mutant under uttrycks reglering av hEF1α promotorn. GA använder en blandning av DNA-exonukleas, DNA-polymeras och DNA-ligas för att göra kloning av överlappande ändar av DNA-fragment möjlig.Baserat på de mall-DNA som vi hade tillgängliga, utformade vi våra konstruktioner som ska monteras till en enda sekvens. Vår design används fyra DNA-fragment: pcDNA 3.1 vektor ryggraden, hEF1α promotor del 1, hEF1α promotor del 2 (som innehöll 3xFLAG-tagg köpas som ett dubbelsträngat syntetiskt DNA-fragment), och antingen CstF-64 eller specifik CstF-64 mutant. Sekvenserna av dessa fragment matades in i en primer generation verktyg för att utforma lämpliga PCR-primrar för generering av DNA-fragment. Efter PCR, DNA-fragment blandades med vektorn som innehåller den selektiva markören och GA kloningsreaktionen sattes samman. Plasmider från enskilda transformerade bakteriekolonier isolerades. Initial skärm av plasmider gjordes genom restriktionsklyvning, följt av sekvensering. Sammanfattningsvis GA tillät oss att skapa anpassade plasmider för genuttryck i 5 dagar, inklusive konstruera skärmar och verifiering.
Introduction
Konventionella DNA-kloningsförfaranden förlitar sig på användningen av restriktionsenzymer för att klyva DNA och DNA-ligas för att förena DNA-fragmenten tillsammans. Generering av anpassade expressionskonstruktioner innehållande olika DNA-fragment är en sekventiell procedur som innefattar spaltning av DNA med ett och / eller flera restriktionsendonukleaser och efterföljande insättning av DNA-fragment genom ligering. Den stora nackdelen med detta förfarande är att lämpliga restriktionsenzymer för en av de DNA-fragment kan vara svårt att identifiera (dvs. kan ha flera klyvningsställen) gör framgångsrika DNA kloning av fullängdsprotein av omöjligt intresse. Därför generation av anpassade uttryckskonstruktioner under transkriptionsreglering av effektiv cell typspecifika promotorer med anpassade protein-taggar kräver mycket noggrann design. Det är också ett tids- och arbetskrävande teknik. Nyligen, flera rapporter beskrivna metoder för att montera Multiple olika syntetiska DNA-fragment i en kontinuerlig sekvens samtidigt i antingen en- eller två-stegsreaktioner utan användning av restriktionsenzymer 1-3. Den ett steg kloning reaktion (exklusive alla förberedande steg), beroende på användningen av en blandning av DNA-exonukleas, DNA-polymeras, DNA-ligas 2,3 och de överlappande ändarna av DNA-fragment (Figur 1). Eftersom det inte finns någon användning av restriktionsenzymer, kan DNA-fragment av vilken storlek som helst och sekvenskomposition (exklusive höggradigt repetitiva sekvenser) smältas samman i en sömlös konstruktion. Nyligen, ett kommersiellt kit (Gibson församling; GA) för enstegs kloning reaktioner blev tillgängliga. Detta kit möjliggör snabb och kostnadseffektiv montering av eventuella DNA-fragment i en enda vektor med skräddarsydda tagare och protein taggar.
De allmänt tillgängliga plasmidexpressionsvektorer används för att uttrycka exogena proteiner i däggdjurscellodlingsmodeller är ofta under transkriptions reglering av det virala cytomegalovirus (CMV) eller simianvirus 40 (SV40) promotorer. Dessa virala promotorer ger robusta transient expression av de exogena proteinerna i de flesta däggdjurscellodlings baserade modeller. Dock är generering av cellinjer stabilt uttrycker exogena proteiner ofta misslyckas på grund av transkriptionstyst av CMV eller SV40 tagare under etableringsprocessen 4,5. Dessutom kommer de SV40 och CMV virala promotorer inte tillräckligt främja expressionen av exogena proteiner i celler från lymfoid härstamning eller embryonala stamceller 6,7. Lösningen på den inneboende begränsningen av virala promotorer är att använda starka konstitutiva icke-virala promotorer 8-10. En välkarakteriserad starka konstitutiva icke-viral promotor av humant ursprung är den elongeringsfaktor 1α (hEF1α) promotor (hEF1α är inblandad i katalysen av GTP-beroende association av aminoacyl-tRNA till ribosomer 11). Emellertidexpressionsvektorer innehållande hEF1α promotorn är inte lika allmänt tillgänglig som den virala-promotorn innehållande plasmider, speciellt sådana innehållande också 3 × FLAG vid den aminoterminala änden av proteinet av intresse.
Den 64.000 MW klyvning stimulering faktorproteinet (CstF-64) är inblandad i 3 'änden bearbetning av de flesta mRNA 12,13, inklusive replikationsberoende histon mRNA 14,15. CstF-64 uttrycks i alla somatiska vävnader 12. Dess RNA igenkänningsmotiv binder till GU-rika RNA-sekvenser på begynnande avskrifter nedströms klyvning och polyadenyleringsstället 16. Denna bindning av CstF-64 till pre-mRNA främjar effektiv endonukleolytisk klyvning av begynnande avskriften.
Här används en protokoll som beskrivits som använder PCR-amplifiering av DNA-fragmenten, till en Gibson monteringskloningskit (som inkluderar kemiskt kompetenta bakterieceller) producera anpassade vektorer 3xFLAG-taggade mOuse CstF-64 eller mutant CstF-64 till deras aminoterminaländen under uttrycket av hEF1α promotor 1.
Protocol
1. I Silico Design av plasmiden och Generation av Lappande Primers
NOTERA: Syftet med detta steg är att montera fullständiga nukleotidsekvensen av konstruktionen och designa primers som skall användas för att generera fragment med överlappande ändar för GA-kloning.
- Designa en kontinuerlig nukleotidsekvens att representera den slutliga plasmiden.
- Skaffa eller lista de faktiska plasmider och DNA-fragment som kommer att användas som mallar i PCR.
OBS: DNA-fragment som inte är lätt tillgängliga - som olika kombinationer av taggar och promotorer - kan beställas som en enda eller flera syntetiska dubbelsträngade DNA-fragment (sDNA). Dessa fragment är kommersiellt tillgängliga till relativt låg kostnad och kan vara upp till 2 kb i längd (se tabell of Materials). - Dividera den kontinuerliga nukleotidsekvensen av konstruktet samman i moment 1,1 till DNA-fragment som är lämpliga för PCR. Confirm att fragmenten matcha tillgängliga plasmider och sDNA fragment. Undvik DNA fragment mindre än 200 nt.
- Gå till primern generation verktyg (se tabell i Equipment). Välj menyn "Set Preferences". Välj lämpliga inställningar genom att klicka på "ÄNDRA Prefs" fliken i "Ändra Gibson Monterings Settings" pop-up fönster.
OBS: Primer design kan också utföras utan användning av primern generation verktyg. Emellertid har användningen av primern generation verktyg förenklar processen. - Börja bygga konstruktionen genom att välja menyn "Bygg Konstruera". Sätt in de delade DNA-fragmenten i primern generation verktyg sekventiellt från 5 'till 3' änden.
OBS: Det DNA-fragment som används som en plasmidryggrad kan lämpligen delas in i två stycken. I den slutliga PCR-produkten 5'-änden av denna första fragmentet och 3'-änden av det sista fragmentet är sammanlänkade i en kontinuerlig DNEtt fragment som representerar vektorryggraden. - Klistra första DNA-fragment som representerar 5 'änden av vektor-DNA i FASTA format (en textbaserad representation av nukleotidsekvensen) i "Enter Vector eller Insert Fragment" pop-up fönster. Namnge DNA-fragment. Välj lämpligt sätt för att erhålla DNA-fragment, antingen som PCR, RE Digest eller syntes. Klicka på fliken "FORTSÄTT".
- Om det finns ett behov av att lägga till extra nukleotider / restriktionsställen vid korsningen av den slutliga konstruktionen använda "framåt eller bakåt primer spacer" utrymmena i "Lägg en insats fragment till församlingen" fönstret. Lägg extra nukleotider / restriktionsställen till endast en av de DNA-fragment och inte till båda fragmenten. Klicka på "KLAR" -fliken.
- Upprepa för alla fragmenten tills konstruktionen är fullständig. Välj menyn "Visa Primers" och granska primersekvenserna.
- Upprepa för alla konstruktioner (vector backbones och skär), eller för DNA-fragment som skiljer sig.
2. Amplifiering av DNA-fragmenten med PCR med användning Hot Start Korrektur DNA Polymeras (2x Master Mix)
NOTERA: Syftet med detta steg är att erhålla tillräckligt med DNA för montering reaktionen med användning av PCR.
- Köp PCR primers utformade i föregående steg som avsaltad produkter och i minsta möjliga omfattning. Späd dem till 10 uM i vatten eller TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,9, 1 mM EDTA).
- Köp DNA-fragment som inte är lätt tillgängliga som sDNA fragment.
- Späd alla DNA-fragment, inklusive sDNA fragment som kommer att användas som mallar för de PCR till en ng / ul i vatten.
- Montera PCR-reaktioner vid rumstemperatur. I korthet använder 2,5 pl (från 10 ^ M förrådslösning) hos varje respektive primer av primerparet, 1 pl (från en ng / ul stamlösning) hos mall-DNA-fragmentet, 25 μl varmstart korrekturläsning DNA-polymeras (DNA pol; 2x Master Mix, se tabell för material) och 19 pl vatten. Blanda röret genom försiktig snärta och samla de vätskedroppar från kort centrifugering.
- Amplify samtidigt i separata rör DNA-fragment av liknande storlek enligt rekommendationerna för DNA pol. Utför 25-28 PCR-cykler eller bestämma antalet cykler som producerar tillräckligt med DNA avkastning.
- Kör 10% av PCR-reaktionsvolymen (5 | il) på en standard agarosgelelektrofores färgades med etidiumbromid (0,2 pg / ml slutlig koncentration). Säkerställ att en enda DNA-band som representerar PCR-produkten är synlig. Bestäm storlek och relativa mängden av DNA-fragment med användning av DNA-molekylviktsstandarder. Om nödvändigt, upprepa PCR för att erhålla tillräcklig mängd DNA-fragment.
3. Dpnl digerering av PCR-produkter
OBS: Syftet med detta steg är att Digest återstående plasmid-DNA-templat från PCR i avsnitt 2. Dpnl kommer smälta plasmid-DNA endast om det är metylerad, såsom sker till plasmid-DNA odlas i dam + bakteriestammar. Därför ska du inte behandla med Dpnl om plasmid-DNA kommer att användas som ett DNA-fragment i GA reaktionen.
- Lägg 2 pl av Dpnl restriktionsenzym till de 45 ul av PCR-produkterna som framställts i avsnitt 2. Inkubera vid 37 ° C under 1 h. Fortsätt med 4 § eller frysa vid -20 ° C tills det behövs.
4. Rening och Koncentration av DNA-fragmenten över DNA Purification Magnetic Beads
OBS: Syftet med detta steg är att rena och koncentrera de PCR-produkter som erhållits i avsnitt 2 och 3. Andra PCR reningsmetoder kan användas.
- Jämvikta DNA renings magnetiska pärlorna till rumstemperatur. Återuppslamma kulorna av en kort vortex.
- Överför PCR pre-smält with Dpnl till en 1,5 ml rör och tillsätt 81 ìl av DNA renings magnetiska kulor till varje rör. Inkubera blandningen vid rumstemperatur under 10 min.
- Placera rören på magnet kollektor för cirka två minuter. Kassera den klara vätskan med hjälp av en pipett. Tvätta två gånger med 200 | il av 80% etanol för 30 sek.
- Låt pellets torka. Håll locket av rören öppna, med rören placerade på den magnetiska kollektorn.
- Återsuspendera de torkade pärlorna i 10 ^ il 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Inkubera vid rumstemperatur under två minuter. Spin kort att samla vätskan i botten av rören.
- Placera rören på magnetsamlaren i 2 min. Ta 8,5-10 il av den klara lösningen och placera den i en ny pre-märkta rör. Bestäm koncentrationen av DNA-fragment av UV-spektroskopi (se tabell i Equipment).
5. Montering Kloning Reaktion och Transformation av produkter i E. coli
<p class = "jove_content"> NOTERA: Syftet med detta steg är att beräkna 3: 1 förhållande av insert: vektor och utföra monteringen reaktionen.- Använd minst 100 ng DNA-fragment som representerar vektor ryggraden eller DNA-fragment som bär den selektiva markör. Beräkna 3-faldigt molärt överskott för de DNA-fragment som kommer att användas som inlägg.
- Konvertera molar-överskott i ng behövs för varje särskild insats.
OBS: Ett bekvämt sätt att göra beräkningarna är att använda en webbaserad applikation (se tabell i Equipment). - Blanda beräknade mängder DNA-fragment i en PCR-rör, justera volymen till 10 pl. Tillsätt 10 ìl av GA Master Mix (2x, se tabell för material). Inkubera reaktionen vid 50 ° C under 1 h för montering av 4 - 6 fragment eller 15 min för montering av 2-3 fragment i en PCR-termisk cykler.
- Fortsätt med omvandlingen av monteringsprodukten i kompetent E. coli eller frysa produkterna vid -20° C, tills det behövs.
- Följ transformationsförfarandet som åtföljer kemiska eller elektrokompetenta celler. Vanligtvis använder 2 pl av monteringsreaktionen per transformationsreaktion.
- Efter omvandlingen är klar, sprids de transformerade cellerna på agarplattor kompletterade med lämplig selektiv antibiotikum.
6. Plasmid Isolering, restriktionsenzymdigestion och sekvense
NOTERA: Syftet med detta steg är att isolera plasmid-DNA från E. coli, sedan att verifiera konstruktionen genom restriktionsdigerering och sekvensering.
- Propagera flera enstaka kolonier för mini preps och plasmid isolering. Använd 2-5 ml natten LB flytande kultur kompletterat med lämplig antibiotika. Isolera de motsvarande plasmider genom att följa det förfarande som beskrivs i mini prep kit som används.
- Bestäm mängden och koncentrationen av de plasmider som erhållits med användning av spektrofotometer.
- Utför restriktionsspjälkning med en eller flera restriktionsendonukleaser till ~ 0,5 pg av de renade plasmider. Använd restriktionsenzymer som ger distinkt mönster av matsmältningen karakteristiskt för DNA-konstruktioner.
- Bekräfta DNA kloning framgång genom DNA-sekvensering med användning av specifika eller standard primers. Analysera de sekvenseringsdata för noggrannhet.
Representative Results
Ett arbetsflöde av protokoll som följdes visas i figur 2A. Vi ville att klona CstF-64 och muterade CstF-64 proteiner smält till 3xFLAG-tagg under uttrycks reglering av hEF1α promotor (Figur 2B och Figur 3). En plasmid innehållande hEF1α följt av 3xFLAG-taggen inte var tillgängliga för oss. Emellertid är följande plasmider var tillgängliga: pcDNA 3,1 myc-His (A; en generös gåva från Michaela Jansen), hEF1α innehållande plasmiden (en generös gåva från Mladen Yovchev) och mus CstF-64-plasmider 12 (figur 3). Hela sekvensen för konstruktionen (er) sattes ihop med hjälp av nukleotid och textredigeringsprogram (Figur 3, se tabell på utrustning). Därefter tillsattes sekvensen (er) delas i fyra bekväma bitar (figur 2B, röda block och Figur 3) som motsvarar de tillgängliga plasmid-DNA. Amplifiering primers utformades använda primer generation verktyg (se tabell i Equipment) med begränsningarna i 4 - 6 fragment med minimal överlappning av 25 nt, som inrättades i "Ändra Gibson Monterings Settings" pop-up fönster. Nhel och Notl restriktionsställen ingick i primer design för att identifiera korrekt monterade plasmider. Nhel Platsen ligger i primersekvensen mellan pcDNA 3,1 och 5 'änden av hEF1α promotorn. NotI Platsen ligger efter stoppkodonet (UGA) i CstF-64 och pcDNA 3.1 vektor ryggraden. Vid samtidig uppslutning med båda enzymerna DNA-fragment bestående av hEF1α promotor, 3xFLAG och CstF-64 eller mutant CstF-64 kommer att släppas (se nedan och figur 2B). Primers beställdes i minsta möjliga omfattning och avsaltades. Den andra delen av den hEF1α promotorn innehållande 3xFLAG-tagg DNA-fragment (490 bp, Figur 2B, Figur 3) köptes som en enda sDNA fragment (enee Tabell över Materials). DNA-fragment som används vid montering reaktionen förstärktes med hjälp av DNA pol (se tabell för material). DNA-fragment av hEF1α promotor del 1, hEF1α promotor del 2, full längd och mutant CstF-64 förstärktes samtidigt i ett separat rör för 28 cykler (Figur 4A), efter rekommendationer från leverantören av DNA pol (se tabell för material , för varje cykel denaturering var 7 sek vid 98 ° C, hybridisering 45 s vid 55 ° C, töjning 90 sek vid 72 ° C). Inledningsvis var pcDNA 3.1 ryggraden förstärks under 22 cykler (med samma villkor som ovan med undantag för förlängningstiden, som var satt till 3 min vid 72 ° C). Emellertid inte den resulterande DNA-utbytet var tillräcklig för att användas i ett aggregat reaktion (figur 4A). Därför gjordes en extra förstärkning utförs för att erhålla tillräcklig DNA.
PCR-produkter erhållaras från en plasmidmall måste spjälkas med Dpnl restriktionsenzym för att avlägsna plasmid-DNA, som annars skulle förorena de resulte montering reaktionsprodukter och kommer att producera falskt positiva läkemedelsresistenta bakteriekolonier. Därför var PCR-produkterna digererades med Dpnl restriktionsenzym, som klyver metylerat och hemi-metylerade plasmid-DNA isolerades från dam + E. coli-stammar. PCR-produkter som erhållits med hjälp av syntetiska DNA-fragment, som mallar behöver inte brytas ned med Dpnl sedan kemiskt syntetiserade DNA inte innehåller metylerade eller hemi-metylerade baser.
DNA-fragment renades och koncentrerades över DNA-rening magnetiska pärlor (se tabell för material) såsom beskrivs i protokollet steget 4. PCR för pcDNA 3,1 vektorryggraden kombinerades tillsammans och mängden DNA renings magnetiska pärlor användes justerades i enlighet därmed. DNA utbytet bestämdesmed hjälp av en spektrofotometer (Tabell 1 och Tabell över Equipment). Reaktioner Monterings för CstF-64 och muterade CstF-64 konstruktioner monterade på is (tabell 1). En 3-faldigt molärt överskott av DNA-fragmenten som betraktas som "skär" användes (Tabell 1, Figur 3). Den slutliga volymen av de blandade DNA-fragmenten justerades till 10 | il med vatten och 10 ul av monteringshuvudblandning (2x) tillsattes. Reaktionerna blandades och inkuberades vid 50 ° C under 1 h. Positiv kontroll reaktionen också monteras enligt rekommendationen från GA kit manuella och inkuberas samtidigt med CstF-64 och muterade CstF-64 reaktioner. Som rekommenderas i protokollet, var 2 ìl av var och en av monterings reaktionerna omvandlas i kemiskt kompetent E. coli medföljer monteringskloningssats (se tabell för material). Omvandlingen genomfördes såsom beskrivs i satsenmanuell. Positiva kloner selekterades på ampicillin agar / LB-plattor. 6 kolonier per varje monteringsreaktion valdes slumpmässigt för att fortplantas. Plasmid-DNA isolerades med användning av en plasmid isolering mini kit (se tabell of Materials). In silico spjälkning av konstruktionerna med restriktionsenzymerna Nhel och Notl gav två fragment med storlekar av 4590 bp, 3032 bp för CstF-64 och 4590 bp, 2711 bp för CstF-64 mutant (Figur 2B och figur 4B). Uppslutning med restriktionsenzymerna Hindlll och NotI resulterade i tre fragment med följande storlekar: 5872 bp, 1005 bp och 745 bp (CstF-64) och 5872 bp, 1005 bp och 424 bp (mutant CstF-64, figur 2B och Figur 4C). Faktiskt, digerering av de isolerade plasmidema visade de förväntade karakteristiska mönster (figur 4B, C). Observera att 424 bp DNA-fragment som produceras genom digestion med Hindlll och NotI i CstF-64 mutantplasmider på figur 4C är svagt färgade på grund av sin ringa storlek. 2 ut ur de sex isolerade plasmiderna sändes för sekvensering. Vi sekvens den hEF1α promotorn och CstF-64 eller mutant CstF-64 delar konstruktionerna för att kontrollera att det inte finns några deletioner, insättningar eller substitutioner. Vi rekommenderar starkt sekvensering av DNA-konstruktioner som följer av detta eller något PCR-baserat protokoll. Sekvenser visade att en av varje sekvens plasmiden innehöll den förväntade sekvensen i regionen hEF1α, 3xFLAG-taggen och CstF-64 eller mutant CstF-64. Var och en av de andra plasmider hade en punktmutation introduceras under amplifiering av motsvarande DNA-fragmentet. Expression av plasmid innehållande CstF-64 i mus embryonala stamceller, producerade riklig mängd exogent protein jämförbar med vildtyp uttryck 17.
Figur 1. Schematisk representation av Gibson Assembly mekanismen. DNA-fragment med överlappande ändar isotermt monterade i en enda kontinuerlig sekvens. Överlappn slutar först tuggas tillbaka med 5 'exonukleas, vilket gradvis värma inaktiv. Följaktligen kommer olika DNA-fragment med överlappande ändar glödga isotermiskt. DNA-polymeras kommer att fylla i luckorna och värmestabilt DNA-ligas ligater de nicks. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. (A) Schematisk bild av det protokoll som beskrivits för montering kloning. (B) Representation av plasmiden, PGA-CstF-64 genereras med GA kit Röd - DNA-fragment som används vid montering reaktion:. PcDNA3,1; hEF1α promotor del 1 (hEF1a - 1); hEF1α promotor del 2 (hEF1a - 2) beställas som ett syntetiskt DNA; mus CstF-64 (mCstF-64). Blå - öppna läsramar. Violet - virala och icke-virala promotorer. Grön -. Cleavage och polyadenylerings regioner Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Design av Gibson monterings CstF-64 plasmiden. Svart rutor utgör DNA-fragment som fanns tillgängliga för att utforma en enda Gibson monterings CstF-64 in silico sekvens. Därefter sträcktes sekvens indelat i fyra DNA-bitar, som amplifierats med PCR. Observera att på grund av liten storlek 3xFLAG-taggen sekvensen var utformad som en sDNA tillsammans med hEF1α pr omoter del 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. PCR av DNA-fragment som används i kloningsreaktioner och representativa restriktionsenzymspjälkning av plasmider som erhållits (A) Representativa PCR med varmt börja high fidelity 2x Master Mix för DNA-fragment som används i monterings reaktioner:. (B) representant plasmider av hEF1α, CstF-64, pcDNA 3,1 konstruktion (PGA-CstF-64) full längd och hEF1α, mutant CstF-64, pcDNA 3,1 konstruktion (PGA-mutCstF-64) klövs med Nhel och Notl. (C) samma plasmider som i B med Hindlll och Notl enzymer."_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn av DNA-fragment | Förväntad storlek (bp) | Konc. (Ng / ul) | Utspädd till (ng / ul) | il användes i GA CstF-64 från Utspädd | l används i GA mutCstF-64, från Utspädd | Molförhållande (ins: vec) |
| pcDNA 3.1 (vektor) | 4618 | 158 | outspädd | 1 | 1 | |
| hEF1_ promotor del 1 | 825 | 213 | 75 | 1 | 1 | 3: 1 |
| hEF1_ promotor del 2 för CstF-64 | 516 | 229 | 50 | 1 | 3: 1 | |
| CstF-64 | 1796 | 161 | outspädd | 1 | 3: 1 | |
| hEF1_ promotor del 2 för CstF-64 mutant | 516 | 199 | 50 | 1 | 3: 1 | |
| mutant CstF-64 | 1.448 | 201 | 171 | 1 | 3: 1 |
Tabell 1. Utbyte av DNA-fragment efter koncentration på magnetiska pärlor, spädning och installation av monteringsreaktioner.
Discussion
Framgångsrik användning av GA kloning bör alltid föregås av en noggrann utformning av hela konstruktionen (Figur 2 och Figur 3).
Noggrann kontroll av primersekvenserna designade av primern generation verktyg är också rekommenderas. Primrar för GA kan genereras utan användning av primern generation verktyg. Dock är användningen av verktyget rekommenderar, eftersom det förenklar processen. Generellt måste primer för GA kloning har två funktionellt olika sekvenser. Den första sekvensen är DNA-fragment-specifik, och tillåter amplifiering av fragmentet med användning av PCR. Den andra sekvensen överlappar med den intilliggande fragmentet, vilket är nödvändigt för GA montering. En typisk DNA-fragment-specifika sekvensen skulle vara 18-22 nt i längd. DNA-fragment som specifika sekvenser användes för att amplifiera samma DNA måste ha liknande smälttemperaturer och GC-innehåll. Överlappande sekvens bör vara minst av 15nt i längd med en smälttemperatur av minst 48 ° C. Hopsättningen av mer än fyra DNA-fragment kommer att kräva den överlappande sekvensen att vara åtminstone 20 nt. Längre lappningar kommer att möjliggöra ökad specificitet för glödgning vilket resulterar i mer korrekt monterade DNA-fragment. Det rekommenderas att undvika sekvenser som är skeva i sin GC eller AT innehåll i utvecklingen lappande sekvenser, eftersom skeva sekvenser kan äventyra korrekt DNA montering.
Vi föreslår också att använda som en negativ kontroll, som inte bör ge några läkemedelsresistenta bakteriekolonier, bara det DNA-fragment som motsvarar vektor ryggraden i en GA reaktion. Alternativt kan en av de DNA-fragment som omfattar de "skär" kan utelämnas från GA reaktionen, vilket också bör resultera i några läkemedelsresistenta bakteriekolonier. Anledningen inga kolonier kommer att växa kommer att vara brist på överlappande ändarna av de angränsande DNA-fragment, vilket kommer att göra monteringen av en komplete plasmiden.
I beskrivna protokollet, överlappande sekvenser av 25 nt att alstra de primeruppsättningar användes, på grund av antalet av DNA-fragment användas (figur 3). Rekommendationen av primern generation verktyg webbplats (se tabell i Equipment) är att använda minst 20 nt lappande sekvenser att montera 4 - 6 DNA-fragment. Dessutom längre lappande sekvens kommer att säkerställa en korrekt komplettering av DNA-strängarna (se figur 1) öka antalet korrekt monterade produkter.
För närvarande flera system för sömlös kloning finns. Men vissa av dessa system fortfarande använda restriktionsenzymer (dvs, Golden Gate kloning 18). Andra använder egna blandningar av enzymer som bygger på vacciniavirus DNA-polymeras och enkelsträngat DNA-bindande protein från samma biologisk källa 19. Båda systemen är begränsade i jämförelse med GA av schorter längden av överlappande sekvenser. Eftersom kortare lappande sekvenser inte kan ge tillräcklig specificitet till glödgningssteget av intilliggande DNA-fragment, vilket gör den lämplig montering av mer än 23 DNA-fragment problematiska. Dessa brister är inte närvarande i den GA-systemet.
Storleken av DNA-fragmenten som skall förstärkas bör också vara så att den inte överstiger storleken tillförlitligt amplifierbara genom PCR (dvs mindre än 8 kbp i längd). Även med de förbättringar i funktionen av DNA-polymeraser under de senaste 10 åren kommer stora DNA-fragment amplifieras med mindre effektivitet och noggrannhet. Om det behövs kan större DNA-fragment erhållas från andra källor alternativa PCR, exempelvis genom att plasmid isolering och lämplig DNA uppslutning med restriktionsenzymer. Specifikt för det protokoll som beskrivs i den aktuella manuskriptet, vår rationellt att använda PCR baserat på storleken av de tillgängliga DNA-fragment, som var alla mindre än5 kbp. Om det finns fler än en PCR-produkt som identifieras med hjälp av agarosgelelektrofores, är gelrening av det önskvärda fragmentet storlek som rekommenderas användning av någon av de tillgängliga molekylärbiologiska tekniker eller lämpliga kit. I det nuvarande protokollet ett värmestabilt DNA-polymeras används (se tabell för material). Men någon DNA-polymeras som ger hifi och avkastning kommer att vara lämpliga att användas med detta protokoll. Om high-fidelity DNA-polymeraser annorlunda än beskrivs i protokollet finns, använd inrätta villkor som anges i respektive handböcker. I det nuvarande protokollet, kemiskt kompetent E. coli celler används som medföljer GA kit. Alternativt, kemiskt eller elektrokompetenta E. coli-stammar såsom DH5a eller DH10B kan användas.
Aggregatet kloning 2x Master Mix är lätt att använda med minimala praktisk tid. Emellertid är noggrann pipettering krävs på grund av de små volymer neEDED att blandas ihop. Bra molekylärbiologi teknik måste utövas på alla gånger också.
GA kloningen erbjuder obegränsade möjligheter för en konstruktion av DNA-fragment, plasmider och vektorer, som är längre än 3 kbp i storlek. Dessutom har den ett bredare genomslag inom syntetisk biologi, eftersom det tillåter syntes och montering av t.ex. en hel bakteriell (Mycoplasma mycoides) genomet eller en jäst (Saccharomyces cerevisiae) kromosom 20,21. Tekniken kan också tillämpas på konventionell kloning behöver för att alstra sömlösa konstruktioner.
Sammanfattningsvis erbjuder GA kloning snabbt, pålitligt och flexibelt alternativ till den konventionella DNA-kloningsförfarandet.
Acknowledgments
Vi vill tacka Michaela Jansen vid Texas Tech University Health Sciences Center, Lubbock, TX och Mladen Yovchev vid University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA för generöst ger pcDNA 3.1 myc-His (A) och hEF1α promotor som innehåller plasmider . Forskningen rapporteras i denna publikation stöddes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development av National Institutes of Health i utmärkelsen nummer R01HD037109 (till CCM). Ytterligare stöd kom från Laura W. Bush institutet för kvinnors hälsa (till CCM och PNG). Innehållet är ensamt ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
| DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP - PCR Purification system |
| Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
| DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix |
| DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
| NheI | New England BioLabs | R3131S | |
| NotI | New England BioLabs | R3189S | |
| HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
| EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
| NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
| NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |
References
- Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
- Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
- Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
- Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
- Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
- Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
- Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
- Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611 (2010).
- Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
- Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
- MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
- Sabath, I., et al. 3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
- Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
- Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
- Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing. Nucleic acids research. , (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647 (2008).
- Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
- Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
- Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).
