Mesure automatisée de l'emphysème pulmonaire et petites remodelage des voies aériennes dans la cigarette de fumée souris exposées

Introduction

L'utilisation de modèles animaux pour étudier la MPOC est difficile, car aucun modèle ne peut parfaitement répliquer toutes les caractéristiques de la maladie humaine ^(2). La plupart des chercheurs utilisent la souris pour modéliser MPOC en raison des similitudes entre les souris et les humains dans leurs pulmonaires physiologie, la pathologie, la génétique, et des métabolites. En outre, les souris sont relativement peu coûteux à étudier, et à la fois l'emphysème et la petite remodelage des voies aériennes se développent dans les 6 mois de l'exposition CS ^(5,7-9).

Cigarette BPCO induite fumée: Plusieurs méthodes peuvent induire la MPOC chez les souris. La plupart des chercheurs exposent souris au CS, qui est le principal facteur étiologique de la MPOC humaine. CS exposition pendant 6 mois provoque le développement de l'emphysème et la petite remodelage des voies aériennes (SAR) chez la souris, mais la gravité de la maladie qui est induite varie en fonction de la souche murine étudié. Par exemple, des souris NZWLacZ sont résistants au développement de l'emphysème induit par CS alors que les souris AKR / J sont extremely sensible ^(10). La plupart des chercheurs étudient C57BL / 6 souris de souche dans le modèle d'exposition CS autant de souris génétiquement ciblée sont disponibles dans cette souche. Après six mois de l'exposition CS, l'emphysème et la fibrose petite des voies respiratoires se développent dans de type sauvage (WT) souris C57BL / 6, et les deux lésions sont relativement doux dans la sévérité ^(5,10). Les chercheurs utilisent deux types de CS exposition: expositions nez seul et l'ensemble du corps. Les principaux inconvénients de la seule nez technique d'exposition sont les suivantes: 1) ce est une méthode plus de main-d'œuvre; et 2) les souris doivent être retenus dans de petites chambres qui peuvent induire une réponse au stress et l'hyperthermie chez les animaux ^(11). L'inconvénient majeur de l'exposition du corps entier (décrit ici) est que les animaux peuvent ingérer (ainsi que inhalent) nicotine et en goudrons produits quand ils nettoient leur fourrure. Souris exposées à l'ensemble du corps CS ont également des niveaux de carboxyhémoglobine inférieurs et réduit la perte de poids corporel par rapport à des animaux exposés à nez seulement CS ^(12).

test de la fonction pulmonaire (PFT): mesures de la compliance pulmonaire et élastance sont généralement similaires chez les souris C57BL / 6 de type sauvage (WT) les souris exposées à l'air ou CS pour six mois en raison de l'emphysème relativement doux qui se développe lorsque cette souche est exposé à CS ^(10). Toutefois, lorsque la destruction est plus sévère emphysémateux, l'augmentation de la compliance pulmonaire et des changements dans la gauche pression-volume (PV) se écoulent boucles peuvent être détectés. Celui-ci peut être observé, par exemple, dans des souches de souris qui sont plus sensibles aux effets de CS ^(10), chez les souris du gène ciblé CS-exposées C57BL / 6 souches qui ont un type d'emphysème plus sévère que / 6 souris WT C57BL ^(13), ni chez les souris CS-exposées soumises à des changements environnementaux qui les rendent plus sensibles aux effets de CS ^(14). Ce protocole utilise un petit ventilateur animal à mesurer les réductions dans le recul élastique du poumon (augmentations de la compliance pulmonaire quasi-statique [l'agent] et des réductions dans les tissusélastance [H]), boucles d'écoulement de PV, et les changements dans les voies aériennes et des tissus résistance chez la souris anesthésiés ^(15,16).

Mesures de l'emphysème pulmonaire: Analyse du développement de l'emphysème dans CS-exposée C56BL / 6 souris de souche est difficile parce que sa distribution est spatialement hétérogène. Plusieurs méthodes différentes quantifier l'élargissement de l'espace aérien chez la souris. La première méthode utilisée est le point d'intersection linéaire moyenne (L _m) ^(17). Cependant, la méthode L _m est un processus manuel lent qui ne peuvent pas capturer l'hétérogénéité de la maladie (si toutes les sections du poumon sont échantillonnées au hasard) et son utilisation peut donc introduire des biais de l'observateur dans l'analyse. L'indice destructive [DI, ^(18)] quantifie également l'élargissement de l'espace aérien à l'aide d'une feuille transparente avec 50 points également répartis placés sur une image numérisée d'un imprimé à l'hématoxyline et l'éosine section du poumon teinté. La méthode de PI scores la région entourant chaque point accordage à la mesure dans laquelle les canaux alvéolaires et des parois alvéolaires dans cette zone sont détruits. Le principal inconvénient de la méthode de DI est qu'il prend beaucoup de temps et pas plus précis que d'autres procédés ^(19,20).

Ce protocole de mesures signifient alvéolaire longueur de corde et de la zone alvéolaire sur les sections pulmonaires paraffine colorées avec la coloration de Gill. logiciel de Morphométrie convertit les images de sections du poumon à des images binaires (dans lequel le tissu est blanc et l'espace aérien est noir), puis superpose une grille uniforme de lignes horizontales et verticales (accords) et le logiciel quantifie alors la longueur de chaque accord dans les domaines identifiés par logiciel comme espace aérien. En utilisant cette méthode, il est possible de mesurer la taille des alvéoles dans toutes les régions du poumon d'une manière relativement uniforme et automatisé ^(21).

Petit remodelage des voies aériennes (SAR): Le dépôt accru de protéines ECM (surtout de intersticesl collagènes) autour de petites voies aériennes se produit chez les animaux exposés au CS et contribue à une obstruction. Les chercheurs ne étudient pas SAR dans des modèles animaux de la MPOC aussi souvent que le développement de l'emphysème ^(22). Pour quantifier SAR chez les souris CS-exposées, ce protocole utilise un logiciel d'analyse d'image pour mesurer l'épaisseur de la couche de protéines de la MEC qui se dépose autour des petites voies respiratoires (voies respiratoires ayant un diamètre moyen compris entre 300 et 899 m) dans des coupes de poumon inclus dans la paraffine colorées avec trichrome de Masson.

Protocol

Le protocole prend ~ 25 semaines pour terminer. Le protocole souris dans l'air ou de la fumée exposé pendant 24 semaines. A la fin de l'exposition à la fumée, les mesures de protocole de la fonction pulmonaire chez les souris, et les poumons sont gonflés à une pression fixe, fixes, et retirées sur le même jour. Un délai supplémentaire est nécessaire pour le chercheur d'intégrer, couper et colorer les sections pulmonaires (2-3 jours), et la capture et l'analyse des images (2-4 jours en fonction du nombre d'animaux étudiés). Ce protocole peut également être utilisé pour mesurer l'élargissement de l'espace aérien liée à l'âge chez les souris.

Toutes les procédures décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle au Brigham and Women 's Hospital / Harvard Medical School.

1. Whole-Body fumée de cigarette exposition

1. Exposer les souris de fumer dans un dispositif d'exposition à la fumée du corps entier (voir Figure 1) installé dans une hotte.
   NOTE: Le dispositif charge automatiquement cigarettes de recherche dans la roue, lDROITS les cigarettes, et recueille la fumée secondaire dans la chambre de collecte de fumée du courant latéral, et éjecte les cigarettes. La machine combine flux fumée latérale avec la fumée principale extraite de la cigarette par une pompe pour créer un mélange de grand public et la fumée secondaire. Le ventilateur de la chambre de mélange et la dilution de la fumée se mélange avec l'air ambiant et entraîne la fumée dans les chambres d'exposition.
2. La place des cages contenant les souris sans les couvercles de cage retirées (figure 1) dans la chambre d'exposition. Laisser la souris pour déplacer librement dans leurs cages et avoir accès à la nourriture et de l'eau pour la durée de l'exposition à la fumée (~ 1,75 h).
3. Placez un seau rempli d'eau sous la chambre de cigarette pour éteindre les cigarettes éjectés. Exécutez l'éthanol (100%) grâce à la pompe et le connecter à l'appareil. Mettre en marche l'élément de microprocesseur du dispositif, ce qui initie le chargement automatique de cigarettes, gonflement de la pompe, et le chauffage du ligh de cigarettesfil Ting.
4. Les charges de l'appareil, les lumières, et fume 10 cigarettes à un moment, puis éjecte les cigarettes utilisés et les remplace par un nouveau lot de 10 cigarettes et répète ce processus. Chaque cycle dure 9 min.
5. Acclimater souris de fumer en les exposant à la fumée de 20 cigarettes sur le premier jour, 40 cigarettes de la deuxième journée, 60 cigarettes sur le troisième jour, 80 cigarettes sur le quatrième jour, et 100 cigarettes sur le cinquième jour. Au cours de la période d'acclimatation, observer les souris attentivement les signes de détresse.
6. Après cinq jours d'acclimatation, exposer les souris à 100 cigarettes par jour, 5 ou 6 jours par semaine, soit pour six mois. Ce niveau d'exposition à la fumée est nécessaire pour induire l'élargissement de l'espace aérien relativement modeste / 6 souris de type sauvage C57BL (23,24). Exposer les souris de contrôle à l'air ambiant de la place pour six mois. Peser souris avant que la fumée acclimatation puis chaque semaine pour évaluer l'effet de l'exposition de la fumée sur le poids corporel.
7. Surveiller le total des particules en suspensionmatière (MPTA) dans les chambres d'exposition après les 60 premières cigarettes ont été fumées:
   1. Peser un papier filtre et le placer dans un porte-filtre en ligne qui est relié à un échantillonneur à filtre chronométré et compteur à gaz sec. L'échantillonneur à filtre chronométré aspire l'air de la chambre d'exposition à travers le papier filtre et les mesures de compteur de gaz le flux d'air lors de l'échantillonnage.
      NOTE: La matière particulaire des pièges de filtre 20 m ³ d'exposition chambre air passe à travers le filtre (mesurée sur le compteur à gaz sec).
   2. Calculer le nombre de TPM que la variation de poids de filtre avant et après l'échantillonnage (en mg) par m ³ d'air. Nombre de TPM idéales sont entre 150 et 200 mg / m ^3.
8. Après toutes les cigarettes ont été fumées, retirer les cages de la chambre d'exposition et d'observer les souris les signes de détresse pour 20 min.
9. Nettoyez la pompe avec 100% d'éthanol après chaque utilisation, et nettoyer tous les ports et les tiges dans la machine bi-hebdomadaire à promouvoirla circulation de l'air et à prévenir l'accumulation de goudron.

2. pulmonaire Function Test (PFTS) et du poumon inflation

1. A la fin de l'exposition, anesthésier chaque souris en fournissant un cocktail de kétamine (100 mg / kg), xylazine (10 mg / kg) et d'acépromazine (3 mg / kg) par voie intrapéritonéale dans 200 ul de solution saline (USP grade) et d'utiliser la pommade vétérinaire sur les yeux pour les empêcher de se dessécher. Attendre jusqu'à ce que l'animal est dans un plan de l'anesthésie chirurgicale, évalue selon la méthode de pincement pincement.
2. Rasez la partie antérieure de la peau à la trachée, et désinfecter la région avec une solution contenant de l'iode, suivie par de l'éthanol. Faire une incision médiane à travers la peau et antérieure de tissu sous-cutané à la trachée avec des ciseaux autoclave, et séparer les muscles sternothyroid avec une pince pour exposer la trachée.
3. Passer une longueur de 2 pouces de suture de soie en arrière de la trachée, faire une trachéotomie sur la face antérieure de la trachée avec autoclavé tciseaux Racheal, insérer une canule trachéale (18 G) dans la trachéotomie, et fixez-le en place avec la suture.
4. Connectez la souris à l'Y-tube de l'adaptateur du ventilateur mécanique via la canule trachéale, et initier une ventilation mécanique en utilisant un volume courant de 10 ml / kg et une fréquence respiratoire de 150 respirations / min.
   NOTE: Il est important à ce stade de se assurer que la souris est anesthésié correctement pour obtenir des mesures précises de PFT. Re-dose de la souris avec des anesthésiques si l'animal ne est pas dans un plan de l'anesthésie chirurgicale. La durée totale de l'ensemble des manoeuvres de PFT est d'environ 7,5 min, de sorte qu'il ne est généralement pas nécessaire de réadministrer la souris avec des anesthésiques fois un plan chirurgical de l'anesthésie a été atteint. La durée totale de l'induction de l'anesthésie à l'euthanasie est ~ 20 minutes.
5. Gonfler les poumons à la capacité pulmonaire totale (CPT) trois fois pour un historique de volume pour mesurer la capacité inspiratoire (CI) et de réduire l'atélectasie des poumons. Ensuite, perform la fréquence unique forcé manoeuvre d'oscillation (SnapShot-150 perturbation) et d'évaluer la résistance dynamique (R), élastance (ERS) et de la conformité (Crs) du système respiratoire, suivi de la fréquence à large bande forcée oscillation manoeuvre (Quick Prime-3 perturbation ) et mesurer la résistance des voies aériennes central (R _n), la résistance du tissu (G), élastance tissulaire (H) et le rapport G / N (). Enfin, fiche respect quasic-statique (C _st) pendant les manoeuvres de débit volume pression.
6. Répétez chacun de ces manœuvres cinq fois (ou effectuer des mesures supplémentaires jusqu'à obtention de lectures identiques) et gonfler à TLC trois fois entre chaque série de mesures répétées. Enregistrez la valeur moyenne pour chaque paramètre pour chaque souris.
7. Retirer la souris du ventilateur mécanique et euthanasier avec narcose CO ₂ suivie par dislocation cervicale [cette méthode d'euthanasie est approuvé par notre institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité]. Coupez le diaphragme, open le thorax sur la ligne médiane, et enlever les côtes antérieures pour exposer les poumons. Disséquer la peau et du tissu sous-cutanée autour de la trachée et de passer une deuxième longueur de 2 pouces de suture de soie postérieure à la trachée.
8. Préparer l'équipement de l'inflation du poumon (figure 2):
   1. Remplissez un Erlenmeyer de 500 ml fiole conique ¾ avec du PBS stérile, le sceller avec un bouchon en caoutchouc, inverser, et de le suspendre sur un support de bague (tels que le ménisque de la solution saline tamponnée phosphate pH 7,4 (PBS) est de 25 cm au-dessus le coeur de la souris).
   2. Insérez une extrémité d'un don par voie intraveineuse mettre dans le PBS dans le flacon à travers le bouchon de caoutchouc. Insérer une longueur de 6 pouces d'une pipette sérologique plastique à travers le bouchon en caoutchouc de telle sorte que son ouverture se trouve au-dessus du ménisque du PBS pour permettre à l'air à la place de PBS laissant le flacon.
   3. Ouvrez la vanne de l'ensemble donnant et exécuter PBS si le système pour débusquer l'air de l'ensemble donnant.
9. Connectez le intravenous donner ensemble à la canule trachéale, ouvrir la vanne, et laisser se écouler PBS dans les poumons par gravité jusqu'à ce que les poumons se gonflent totalement. Fermez la vanne, attacher la trachée en utilisant la suture distale chirurgicale pour la canule trachéale, et enlever la canule.
10. Soulevez la trachée avec une pince, et couper la trachée proximale du nœud, et disséquer la partie postérieure du tissu conjonctif de la trachée et les poumons. Retirez délicatement les poumons (sans les entailler), et placer les poumons dans un tube contenant 10% de formol saline tamponnée. Fixer les poumons O / N à température ambiante, et le lendemain, les laver avec du PBS deux fois.
11. Incluez les poumons dans la paraffine, couper cinq sections um d'épaisseur, puis colorer les sections avec la coloration de Gill comme indiqué ci-dessous.

3. emphysème

1. La coloration de Gill de sections pulmonaires paraffine
   1. Placer les lames dans un rack de plastique et incuber à 70 ° C pendant 20-30 min dans un four.
   2. De-pariffinize les diapositivesen les incubant pendant 2 min dans chacune des quatre changements de xylene.
   3. Réhydrater les lames en les incubant pendant 2 à 3 min dans chacune des deux changements d'éthanol à 100%, suivi par 2-3 min dans chacune des deux changements d'éthanol à 95%, puis laver les lames deux fois dans du PBS pendant 2-3 min pour chaque changement de solution.
   4. Incuber les lames pendant 18 à 48 h dans un mélange 1: 1 de l'hématoxyline de Gill et hématoxyline de Harris modifié.
   5. Laver les lames pendant 2 min dans chacune des cinq changements d'eau distillée, et déshydrater les lames puis en incubant pendant 2-3 min dans chacune des deux changements de 95% d'éthanol, suivie 2-3 min dans chacune des deux changements de 100% l'éthanol.
   6. Effacer les lames en les incubant pendant 2 min dans chacune des quatre changements de xylene.
   7. Monter les lames avec les médias de montage claires et ajouter une lamelle sans bulles introduction, qui sera entraver analyse ultérieure.
2. Acquisition d'image randomisée:
   1. Acquérir des images en noir et blanc en tant que fichier TIFFs en utilisant un microscope, un objectif de 20 X, et un appareil photo et un logiciel qui peut acquérir des images numériques de haute qualité.
   2. Capture ~ 20-30 images (X 200 grossissement) par souris de manière randomisée, à l'observateur impartial à l'état expérimental, en évitant les zones sous-gonflés du poumon.
   3. Collez un champ micro-finder-glisser sur la diapositive. Le détecteur de champ a une grille contenant une série de carrés qui sont marqués par une lettre (en direction verticale) et un certain nombre (dans la direction horizontale) et chaque case a une croix (+) dans le centre et est identifié par une lettre et le nombre (par exemple, A1, A2, ...... Z25).
   4. Utilisez un champ aléatoire tableur Excel Générateur de sélectionner au hasard un carré pour la capture d'image. Pour créer une lettre aléatoire, entrez EFGHJKLMNPQRSTU dans la cellule B1 dans le tableur (le chercheur peut ajuster cette plage de lettres pour couvrir la gamme de carrés identifiées par une lettre qui recouvrent les poumons). Ensuite, ajoutez la formule [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] à la cellule C1 à choisir au hasard une lettre dans C1. Copier et coller C1 en C2, C3, C4 et cetera pour générer une colonne de lettres aléatoires.
   5. Pour créer un nombre aléatoire dans la colonne adjacente, tapez la formule = RANDBETWEEN (5,25) dans D1 (où 5-25 est la gamme typique de tissu sur la diapositive). Eventuellement, régler cette gamme pour couvrir la gamme de carrés identifiés par un numéro qui recouvrent les poumons.
   6. Copiez et collez D1 en D2, D3, D4 et cetera pour générer une colonne de nombres aléatoires à côté de ce contenant des lettres aléatoires. Ainsi, chaque ligne contient une paire de lettres et de chiffres générés de façon aléatoire correspondant aux étiquettes sur les places dans le domaine viseur (par exemple, E17, H24 ....).
   7. Placer la lame sur le microscope. Utilisation de l'objectif du microscope 4X trouver la case correspondante dans la diapositive champ de viseur (par exemple, E17, H24 ...) et placer cette place dans le centre du champ de microscope.
   8. Alignez le centre de la microscopiqueterrain avec le "+" dans le centre de la place choisie. Retirez le détecteur de champ, se concentrer sur le poumon utilisant l'objectif du microscope 20X et d'acquérir l'image comme un fichier TIF de gris. Si couvertures de tissu pulmonaire <50% du champ microscopique, sélectionnez la case suivante généré aléatoirement. Répétez l'opération jusqu'à ~ 20-30 images sont capturées pour chaque animal. Enregistrer toutes les images pour chaque animal dans un seul dossier portant le numéro de l'étiquette de l'animal pour que le rapport macro Excel à reconnaître les fichiers.

4. Pour mesurer Morphométrie emphysème

Le protocole utilise Scion image et macros personnalisées pour analyser l'élargissement de l'espace aérien. Scion image est une version compatible Windows de l'application NIH Image originale qui fonctionne sous le système d'exploitation Macintosh. Scion image fonctionne sous Windows XP et est toujours disponible en ligne grâce Wikiversity.org, où une recherche pour 'Scion Image' va diriger l'utilisateur vers des liens vers ledéverrouillage manuel et bêta 4.0.2 de Scion Image. opération d'installation et de logiciels est détaillée dans le manuel de supplément en ligne et résumées ci-dessous. La longueur de la corde alvéolaire macro a été adapté à partir de la macro disponible dans NIH Image.

1. Préparer l'image TIFF de la section du poumon teinté de la Gill Scion analyse d'image:
   1. Lancer Scion image et charger les macros comme indiqué dans le supplément en ligne. Sélectionnez l'Open Brightfield Image [1] macro pour sélectionner et ouvrir le fichier image TIFF. Ensuite, utilisez les outils d'édition d'image pour préparer l'image pour l'analyse.
   2. Utilisez l'outil pinceau pour forcer zones de l'image qui ne sont pas l'espace aérien ou les murs alvéolaires à traiter soit comme espace aérien ou que le tissu. Par exemple, peindre les bronches et les vaisseaux noir, de sorte qu'ils sont analysés comme des tissus. Peinture cellules inflammatoires (ou la poussière) occupent des locaux dans le blanc alvéoles qu'ils sont analysés comme l'espace aérien.
   3. Sélectionnez la couleur de pinceau en cliquant sur le pointeur de la souris sur lemots noirs ou blancs au bas de la fenêtre LUT. Ensuite, cliquez sur l'outil pinceau. Pour changer la taille du pinceau, double-cliquez sur l'outil pinceau et entrez une taille de brosse appropriée. Cliquez et faites glisser la souris sur l'image pour peindre des structures la couleur sélectionnée (voir # 1 ci-dessus).
2. Mesure de la longueur corde moyenne de l'espace aérien
   1. Sélectionnez le Chord macro Longueur Air [2] pour mesurer les longueurs de l'espace aérien d'accords.
   2. Seuil de l'image d'abord, en cliquant la souris près du centre de l'image puis faites glisser la souris vers le haut ou vers le bas pour ajuster la valeur de seuil (un nombre entre 0 et 255, qui est affiché dans la fenêtre Info). Cliquez sur la souris une seconde fois pour accepter la valeur de seuil. Réglez le seuil de rendre les parois alvéolaires de la même épaisseur que dans les images originales.
      NOTE: Il est crucial que le chercheur ne pas sous-seuil et créer ainsi des ruptures dans les parois alvéolaires qui ne existent pas dans l'image originale qui va produireartificiellement valeurs de longueur de haute accords.
   3. Le programme supprime automatiquement les pixels individuels (simples pixels noirs entourés de huit pixels blancs).
   4. em> 4.2.4. Observez une fenêtre qui invite l'utilisateur à ré-seuil l'image binaire, continuer la macro, ou annuler la macro. Pour seuil, Y répondre à l'invite et sélectionnez le bouton OK.
   5. em> 4.2.5. Visualisez une fenêtre de la grille horizontale et verticale avec des lignes 5 pixels en dehors créés par des macros. Le programme mesure les longueurs des lignes horizontales et verticales qui se chevauchent l'espace aérien.
   6. Enregistrez le fichier dans un dossier, mais ne pas changer le nom par défaut sinon les macros Excel Report ne seront pas trouver le fichier (le format est le nom de l'image accompagnée de "CLa.txt» pour la durée de l'espace aérien de la corde.
      NOTE: Si le programme ne fait pas de mesures, la valeur de seuil peut être trop faible (doit être> 1). Si cela se produit, le chercheur re-seuils l'image en utilisant une valeur plus élevée.
   7. em> 4.2.7. Pour les mesures de la région alvéolaire (en plus de chord longueurs), exécutez la supplémentaire [4] et [5] macros ainsi.
   8. em> 4.2.8. Continuez jusqu'à ce que toutes les images ont été analysées.
3. Analyser les résultats en utilisant des macros Excel Report
   1. Ouvrir Excel Report 20x.xls. Macros activer manuellement si nécessaire en fonction du réglage de sécurité par défaut dans la version Excel utilisée.
   2. Observez une liste de macros dans la fenêtre Macro (voir le tableau 1).
      REMARQUE: CL_Air_1 rapports longueur de corde des espaces aériens pour un seul animal (dossier). CL_Air_Multi rapports longueur de corde des espaces aériens pour plusieurs animaux (dossiers). AP_No_Edge_1 rapporte la région des alvéoles sans contacts de bord pour un animal unique (dossier) .AP_No_Edge_Multi rapporte zone des alvéoles sans contacts de pointe pour plusieurs animaux (dossiers). AP_With_Edge_1 rapporte domaine des alvéoles avec des contacts de pointe pour un seul animal (dossier). AP_With_Edge_Multi rapporte domaine des alvéoles avec le bord cONTACTS pour plusieurs dossiers.
   3. Choisissez la macro CL_Air_Multi signaler les mesures de longueur de corde alvéolaires pour plusieurs dossiers correspondant à des images de plusieurs souris. Le programme indique tous les fichiers _CLa.txt dans les dossiers sélectionnés. Omettre un fichier _CLa.txt (au besoin) en le déplaçant vers un sous-dossier du dossier en cours ou renommer la partie _CLa.
   4. De la fenêtre de fichier, sélectionnez un dossier à la fois en mettant en évidence le dossier puis en sélectionnant OK (le programme ne prend pas en charge la sélection multiple à la fois). Comme chaque dossier est sélectionné, l'observer sur la feuille de calcul. Sélectionnez «Annuler» ou fermer la fenêtre de fichier afin de continuer.
      REMARQUE: Selon la version d'Excel, le chercheur peut avoir à naviguer retour sur un fichier après chaque dossier est sélectionné.
   5. Observez une feuille séparée pour chaque dossier, présentant les statistiques de chaque fichier _CLa.txt suivie par les statistiques pour les données de longueur de corde combinés de tous les fichiers _CLa.txt.
   6. Renommer et enregistrer la feuille de calcul. Le nom de fichier par défaut est le nom du dossier parent annexé avec _CLa.xls. Fermez la feuille de calcul avant de choisir une autre macro.

5. Petit remodelage des voies aériennes

1. La coloration et d'acquisition d'image
   1. Colorer sections pulmonaires avec trichrome de Masson l'aide d'un kit commercial et suivez les instructions du fabricant.
   2. Capturer des images de toutes les voies dans les deux poumons qui peuvent être logés complètement (y compris la couche bleue à l'extérieur des voies aériennes qui est la couche de protéines de la MEC qui sont déposés) dans une zone d'image en utilisant l'objectif 20X de microscope.
      NOTE: Agrandir voies respiratoires ne sont pas associés à un dépôt accru de protéines ECM chez la souris CS-exposées.
   3. Enregistrez les images de couleurs sous forme de fichiers JPEG.
2. L'analyse d'image: Ouvrez le fichier d'imagedans le programme de logiciel d'analyse d'image.
   1. Ouvrez et nommez le fichier journal pour enregistrer les mesures.
   2. Sélectionnez un outil de dessin en ligne. Dessiner 4 lignes traversant le lumen de voies aériennes (diamètre interne) pour mesurer la taille de la voie aérienne et comprennent uniquement les voies aériennes ayant la taille désirée dans l'analyse. Ensuite, dessiner 12 lignes espacées de manière égale (à la position dans les voies aériennes correspondant aux numéros d'une horloge) se étendant depuis le bord de la couche adventice de butée des voies aériennes vers le bord de la zone colorée en bleu entouré les voies aériennes pour mesurer l'épaisseur de la couche de protéines de la MEC déposés à l'extérieur des voies aériennes (figure 5). Évitez les endroits où les voies respiratoires interagit avec d'autres voies respiratoires ou des navires mesure.
   3. Premier enregistrement toutes les lignes de diamètre interne dans le fichier journal, puis enregistrer les 12 lignes qui mesurent l'épaisseur de la couche d'ECM bleu autour des voies respiratoires.
   4. Fermer l'image puis ouvrez l'image suivante.
   <li> Répétez ces étapes jusqu'à ce que toutes les images pour l'animal ont été consignés dans un dossier.
   5. Commencez à l'étape 5.2 pour le prochain dossier qui contient les images capturées sur des coupes de poumons de l'animal suivant. Quittez le programme après avoir terminé l'analyse de l'ensemble des voies respiratoires dans les sections pulmonaires de tous les animaux dans l'expérience.
   6. Entrez les quatre mesures de diamètre interne et la couche de protéines mesures d'épaisseur 12 ECM enregistrées pour chaque voies aériennes pour chaque souris dans les fichiers journaux de données dans un tableur Excel. Calculer la moyenne des diamètres et des protéines ECM mesures d'épaisseur de couche pour chaque animal.
   7. Convertir les mesures de pixels pour microns.
   8. Groupe des voies respiratoires en fonction de leur taille de diamètre interne (par exemple., 300-399 um, 400-499 um etc.) et de comparer ECM épaisseur de couche de protéine mesures autour des voies aériennes ayant des tailles similaires pour l'air par rapport à des souris non-fumeurs exposés (par exemple., les voies respiratoires d'un diamètre de 300 à 899 um;
   9. Si nécessaire, des sections pulmonaires immunocoloration des protéines individuelles (y compris les collagènes interstitiels et sous-sol protéine membranaire) et effectuer une analyse similaire pour quantifier le dépôt de protéines d'intérêt en utilisant cette méthode.

Representative Results

Ce protocole commence par exposition du corps entier de souris pour CS. Une surveillance adéquate et la maintenance de l'appareil et le suivi de TPM Chiffres assurer exposition à la fumée cohérentes (Figure 1). Il est important que le chercheur pratique la technique de gonflement des poumons à l'aide du dispositif de gonflage

Ce protocole commence par exposition du corps entier de souris pour CS. Une surveillance adéquate et la maintenance de l'appareil et le suivi de TPM Chiffres assurer exposition à la fumée cohérentes (Figure 1). Il est important que les pratiques des chercheurs de la technique de l'inflation du poumon en utilisant le dispositif de gonflage (Figure 2) et soigneusement supprime le poumon après inflation afin d'obtenir des coupes pulmonaires bien gonflés pour une analyse précise de l'élargissement de l'espace aérien. La figure 3A montre un poumon ainsi gonflé tandis que la figure 3B montre un poumon mal gonflés. La figure 3C montre une image d'une section de poumon gonflé préparé pour le seuillage step (macrophages dans les espaces alvéolaires sont peints en blanc, et les vaisseaux et des bronches sont peints en noir pour générer. L'étape de seuillage crée une image binaire dans lequel tous les pixels de l'espace alvéolaire sont blancs et tous les pixels dans les zones du poumon qui ne sont pas alvéoles sont noirs (Figure 3D). Figure 3E et 3F montrent la corde alvéolaire verticale et horizontale longueurs que les macros génèrent respectivement.

Les épreuves fonctionnelles respiratoires montrent des changements modestes (et non statistiquement significative) gauche dans le volume de pression (PV) des boucles reflétant la perte modeste de recul élastique du poumon compatible avec l'emphysème légère qui se développe dans souris C57BL / 6 WT exposés à CS pour six mois ( Figure 4A). D'importantes variations de gauche dans les boucles PV sont observés que chez les souches murines qui sont très sensibles aux effets de CS ou de gènes chez la souris ciblées CS-exposée ayant un phénotype plus sévère que l'emphysème souris C57BL / 6 WT CS-exposées.

Figueure 5 montre des images représentatives. Les sections de poumon de trichrome teinté de Masson de souris C57BL / 6 WT exposées à l'air (figure 5A) ou CS (figure 5B) pendant 6 mois illustrant l'augmentation des ECM dépôt de protéines à travers des petites voies aériennes chez les animaux CS-exposées Figure 5C illustre la manière dont un logiciel d'analyse d'images permet de quantifier ECM dépôt de protéine dans les voies aériennes ayant le diamètre interne souhaité. La figure 5D montre l'analyse de l'ECM dépôt de protéine dans les voies respiratoires d'un diamètre de 300 à 899 um de souris C57BL / 6 WT CS-exposées.

Figure 1. Un dessin du système d'exposition de cigarettes du corps entier. Dispositif d'exposition à la fumée est reliée à une chambre d'exposition à la fumée. La fumée est tirée hors de la chambre de collecte du courant latéral et de la fumée est tiré à partir deles cigarettes de la pompe, et les deux échantillons de fumée sont mélangés et dilués avec de l'air ambiant dans la chambre de mélange et de dilution (à gauche), puis le flux de fumée dans la chambre d'exposition. Le chercheur met souris dans leurs cages dans la chambre d'exposition (à droite); souris sont capables de se déplacer librement dans leurs cages, et d'avoir accès à la nourriture et de l'eau pour la durée de l'exposition à la fumée.

Figure 2. L'inflation des poumons de souris. Le chercheur remplit un ballon avec du PBS stérile, joints avec un bouchon en caoutchouc, et inverse et sécurise une distance de 25 cm au-dessus du coeur de l'animal en utilisant un support d'anneau. Un don à perfusion délivre le PBS aux poumons par la canule trachéale. Une pipette sérologique de découpe vers le bas est insérée à travers le bouchon en caoutchouc, ce qui permet l'air dans le flacon pour remplacer le volume de PBS qui se écoule dans la luNGS des souris par gravité.

Figure 3. Analyse de l'emphysème. (A) montre une image représentative de Gill's-tache gonflé sections du poumon chez des souris exposées à l'air ou CS pour six mois, les flèches noires indiquent un navire et les macrophages alvéolaires. (B) montre une image représentative d'un poumon sous-gonflé qui ne est pas adapté à l'analyse. (A) montre le "avant" et (C) montre le "après" l'image d'une section de poumon représentant que le chercheur prépare pour la génération d'une image binaire. Les flèches noires dans (A) et (C) indiquent soit un navire (le chercheur qui peint noir (C)) ou les macrophages alvéolaires (laquelle le chercheur peint blanc (C)). (D) < / Strong> montre l'image binaire après le chercheur effectue l'étape de seuil. (E) et (F) correspond à la corde alvéolaire longueurs horizontale et verticale qui génère le chercheur, respectivement. Grossissement de toutes les images est x 200. barre d'échelle représente 400 um est représenté en (A).

Figure 4. Courbes alvéolaire de longueur de corde et pression-volume. (A) montre une analyse typique des longueurs des cordes alvéolaires chez les souris C57BL / 6 WT souris exposées à l'air (n = 13) ou CS (n = 24) pendant 6 mois. L'astérisque indique p <0,001. (B) montre les boucles PV typiques exercées sur souris C57BL / 6 WT exposées à l'air (n = 13) ou CS (n = 14) pendant 6 mois. Les données sont exprimées sous forme de moyenne + SEM.

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Figure 5. Petit remodelage des voies aériennes (SAR) évaluation. (A) et (B) montrent des images représentatives des sections pulmonaires de trichrome de Masson-taché de souris C57BL / 6 WT exposés à l'air (A) ou CS (B) pour six mois. (C) montre comment un logiciel d'analyse d'images analyse SAR CS chez les souris exposées. (D) montre des mesures typiques de l'épaisseur de la couche de protéines de la matrice extracellulaire déposée autour des petites voies aériennes ayant un diamètre de 300 à 899 m / 6 dans les souris WT C57BL exposées à l'air (n = 11) ou CS (n = 16) pour 6 mois. Les données sont exprimées sous forme de moyenne + SEM et l'astérisque indique p <0,05.

Barres d'échelle sont représentés sur les images de chaque section du poumon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032