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सिगरेट के धुएं में उजागर चूहे में फेफड़े के वातस्फीति और लघु श्वासनली remodeling के स्वचालित माप

Published: January 16, 2015 doi: 10.3791/52236
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1,4
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 2Department of Respiratory Medicine, University of Cambridge - Addenbrooke's Hospital, 3Lung Transplant Program, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 4COPD and IPF Programs, Lovelace Respiratory Research Institute

Introduction

कोई मॉडल पूरी तरह से मानव रोग (2) के सभी सुविधाओं की नकल कर सकते क्योंकि सीओपीडी अध्ययन करने के लिए पशु मॉडल के उपयोग चुनौती दे रहा है। सबसे जांचकर्ताओं क्योंकि उनके फेफड़े के शरीर क्रिया विज्ञान, विकृति विज्ञान, जेनेटिक्स, और चयापचयों में चूहों और इंसानों के बीच समानता की सीओपीडी मॉडल करने के लिए चूहों का उपयोग करें। इसके अलावा, चूहों का अध्ययन करने के लिए अपेक्षाकृत सस्ती हैं, और वातस्फीति और छोटे airway के remodeling के दोनों सीएस जोखिम (5,7-9) के 6 महीने के भीतर विकसित करना।

सिगरेट के धुएं प्रेरित सीओपीडी: कई तरीकों चूहों में सीओपीडी के लिए प्रेरित कर सकते हैं। सबसे शोधकर्ताओं मानव सीओपीडी के लिए मुख्य etiologic कारक है जो सीएस, चूहों को बेनकाब। 6 महीने के लिए सीएस जोखिम वातस्फीति और चूहों में छोटे airway के remodeling के (एसएआर) के विकास का कारण बनता है, लेकिन प्रेरित किया जाता है कि बीमारी की गंभीरता का अध्ययन murine तनाव पर निर्भर करता है। AKR / जम्मू चूहों extremel रहे हैं, जबकि उदाहरण के लिए, NZWLacZ चूहों सीएस प्रेरित वातस्फीति के विकास के लिए प्रतिरोधी रहे हैंसंवेदनशील वाई (10)। सबसे जांचकर्ताओं के रूप में कई जीन-लक्षित चूहों इस तनाव में उपलब्ध हैं सीएस लोगों तक पहुंचाने के मॉडल में C57BL 6 / तनाव चूहों का अध्ययन। सीएस जोखिम, वातस्फीति और छोटे airway के फाइब्रोसिस के 6 महीने बाद जंगली प्रकार में विकसित (डब्ल्यूटी) C57BL / 6 चूहों, और दोनों के घावों गंभीरता (5,10) में अपेक्षाकृत हल्के होते हैं। नाक-केवल और पूरे शरीर जोखिम: शोधकर्ताओं ने सीएस लोगों तक पहुंचाने के दो प्रकार का उपयोग करें। 1) यह एक और अधिक श्रम प्रधान विधि है;: नाक-केवल जोखिम तकनीक के बड़े नुकसान कर रहे हैं कि और 2) चूहों जानवर (11) में एक तनाव प्रतिक्रिया और अतिताप पैदा कर सकते हैं, जो छोटे कक्षों में रोका जाना है। (इस के साथ साथ वर्णित) पूरे शरीर जोखिम के प्रमुख नुकसान है कि वे अपने फर साफ जब जानवरों निकोटीन और टार उत्पादों (के रूप में अच्छी तरह से श्वास के रूप में) निगलना कर सकते हैं। पूरे शरीर सीएस के संपर्क में चूहे भी कम carboxyhemoglobin स्तर है और नाक-केवल सीएस (12) के संपर्क में जानवर के साथ तुलना में जब शरीर के वजन के नुकसान को कम किया।

फेफड़े के कार्य परीक्षण (PFTS): फेफड़ों के अनुपालन और elastance के उपाय आमतौर पर C57BL 6 / जंगली प्रकार में इसी तरह के हैं (डब्ल्यूटी) की वजह से जब इस विकसित करता है कि अपेक्षाकृत हल्के वातस्फीति के लिए 6 महीने के लिए हवा या सीएस के संपर्क में चूहों तनाव सीएस (10) के संपर्क में है। Emphysematous विनाश और अधिक गंभीर है हालांकि, जब फेफड़ों के अनुपालन और दबाव मात्रा (पीवी) में छोड़ दिया पारियों में बढ़ जाती है छोरों पता लगाया जा सकता प्रवाह। उत्तरार्द्ध C57BL 6 / WT चूहों की तुलना में एक अधिक गंभीर वातस्फीति प्रकार है कि सीएस उजागर C57BL 6 / तनाव जीन-लक्षित चूहों में, सीएस के प्रभाव (10) के लिए अतिसंवेदनशील हैं कि murine उपभेदों में, उदाहरण के लिए, मनाया जा सकता है या सीएस के प्रभाव (14) के लिए अतिसंवेदनशील उन्हें प्रस्तुत करना है कि पर्यावरण परिवर्तन के अधीन सीएस उजागर चूहों में (13)। इस प्रोटोकॉल के ऊतकों में फेफड़ों की लोचदार हटना (quasistatic फेफड़ों के अनुपालन में बढ़ जाती है [सीएसटी] में कटौती और कटौती को मापने के लिए एक छोटा सा जानवर वेंटीलेटर का उपयोग करता हैelastance [एच]), पी.वी. प्रवाह छोरों, और anesthetized चूहों (15,16) में airway और ऊतक प्रतिरोध में परिवर्तन।

फेफड़े के वातस्फीति के उपाय: इसके वितरण स्थानिक विषम है क्योंकि सीएस उजागर C56BL / 6 तनाव चूहों में वातस्फीति विकास का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण है। कई अलग अलग तरीकों चूहों में हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा यों। इस्तेमाल पहली विधि (17) मतलब रैखिक अवरोधन (एल एम) था। हालांकि, एल एम विधि (फेफड़ों के सभी वर्गों के बेतरतीब ढंग से जांचा जाता है, जब तक) की बीमारी है और इसलिए विश्लेषण में पर्यवेक्षक पूर्वाग्रह परिचय हो सकता है इसके उपयोग की विविधता पर कब्जा नहीं कर सकता है, जो एक धीमी, मैनुअल प्रक्रिया है। विनाशकारी सूचकांक [डि, (18)] भी एक hematoxylin और eosin दाग फेफड़ों खंड की एक मुद्रित डिजीटल छवि पर रखा 50 समान रूप से वितरित अंक के साथ एक पारदर्शी चादर का उपयोग कर हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा quantifies। पीआई विधि स्कोर एक बिंदु एसी आसपास के क्षेत्र मेंहद के मुताबिक, जो इस क्षेत्र के भीतर वायुकोशीय नलिकाओं और वायुकोशीय दीवारों को नष्ट कर रहे हैं। डि विधि के मुख्य नुकसान यह समय लेने वाली और अन्य तरीकों (19,20) की तुलना में ज्यादा सटीक नहीं है।

इस प्रोटोकॉल के उपायों गिल की दाग ​​के साथ दाग आयल एम्बेडेड फेफड़ों वर्गों पर वायुकोशीय तार की लंबाई और वायुकोशीय क्षेत्र से मतलब है। Morphometry सॉफ्टवेयर द्विआधारी छवियों फेफड़ों वर्गों की छवियों धर्मान्तरित (जिसमें ऊतक सफेद है और हवाई क्षेत्र काला है), और फिर क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लाइनों (chords के) की एक समान ग्रिड superimposes और सॉफ्टवेयर फिर से पहचान क्षेत्रों के भीतर प्रत्येक तार की लंबाई quantifies हवाई क्षेत्र के रूप में सॉफ्टवेयर। इस विधि का प्रयोग, यह एक मानकीकृत और अपेक्षाकृत स्वचालित ढंग (21) में फेफड़ों के सभी भागों में alveoli के आकार को मापने के लिए संभव है।

लघु airway के remodeling के (एसएआर): ईसीएम प्रोटीन की वृद्धि बयान (विशेष रूप से interstitiaछोटे एयरवेज के आसपास एल कोलेजन) सीएस उजागर जानवरों में पाया जाता है और रुकावट airflow के योगदान देता है। शोधकर्ताओं वातस्फीति विकास (22) के रूप में अक्सर के रूप में सीओपीडी के पशु मॉडल में खोज एवं बचाव का अध्ययन नहीं करते। सीएस उजागर चूहों में खोज एवं बचाव यों, इस प्रोटोकॉल छोटे एयरवेज आयल एम्बेडेड फेफड़ों वर्गों में (एयरवेज 300 और 899 मीटर के बीच एक मतलब व्यास वाले) के आसपास जमा है कि ईसीएम प्रोटीन की परत की मोटाई मापने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है मैसन का Trichrome दाग के साथ दाग।

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Protocol

प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए 25 सप्ताह ~ लेता है। प्रोटोकॉल 24 सप्ताह के लिए हवा या धूम्रपान करने के लिए चूहों अवगत कराया। धुआं जोखिम के अंत में, प्रोटोकॉल उपायों फेफड़े के चूहों में समारोह, और फेफड़े, एक निश्चित दबाव को बढ़ा-चढ़ा कर तय की है, और एक ही दिन में हटा रहे हैं। अतिरिक्त समय (2-4 दिनों के पशुओं की संख्या के आधार पर अध्ययन), एम्बेड कटौती, और फेफड़ों के वर्गों (2-3 दिन), और कब्जा दाग और छवियों का विश्लेषण करने के शोधकर्ता के लिए आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल भी चूहों में उम्र से संबंधित हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग ब्रिघम पर समिति और महिला अस्पताल / हार्वर्ड मेडिकल स्कूल द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. पूरे शरीर सिगरेट का धुआँ एक्सपोजर

  1. एक धूआं हुड में स्थापित एक पूरे शरीर धूम्रपान जोखिम डिवाइस (चित्रा 1 देखें) में धूम्रपान करने के लिए चूहों को बेनकाब।
    नोट: डिवाइस स्वचालित रूप से पहिया, एल में अनुसंधान सिगरेट लोड करता हैसिगरेट ights, और पक्ष-स्ट्रीम धुआं संग्रह कक्ष में पक्ष-स्ट्रीम धुआं जमा करता है, और सिगरेट ejects। मशीन मुख्यधारा और पक्ष-धारा धूम्रपान का एक मिश्रण बनाने के लिए एक पंप से सिगरेट से निकाले मुख्यधारा धुएं के साथ साइड स्ट्रीम धुआं जोड़ती है। मिश्रण और गिराए कक्ष में प्रशंसक परिवेशी वायु के साथ धुआं घोला जा सकता है और लोगों तक पहुंचाने के कक्षों में धुआं ड्राइव।
  2. लोगों तक पहुंचाने के चैम्बर में हटा पिंजरे पलकों (चित्रा 1) के बिना चूहों युक्त प्लेस पिंजरों। चूहों उनके पिंजरों में चारों ओर आसानी से ले जाने और धूम्रपान जोखिम (~ 1.75 ज) की अवधि के लिए भोजन और पानी के लिए उपयोग करने की अनुमति दें।
  3. निकली सिगरेट बुझाने के लिए सिगरेट चैम्बर के नीचे पानी से भरी बाल्टी रखें। पंप के माध्यम से इथेनॉल (100%) चलाने के लिए और डिवाइस से कनेक्ट। सिगरेट ligh के स्वचालित सिगरेट की लोडिंग, पंप के puffing, और हीटिंग शुरू की जो डिवाइस के माइक्रोप्रोसेसर तत्व, पर स्विचting के तार।
  4. डिवाइस भार, रोशनी, और एक समय में 10 सिगरेट धूम्रपान करता है और फिर इस्तेमाल किया सिगरेट ejects और 10 सिगरेट का एक नया बैच के साथ उन की जगह है और इस प्रक्रिया को दोहराता है। प्रत्येक चक्र 9 मिनट लगते हैं।
  5. पहले दिन 20 सिगरेट, दूसरे दिन 40 सिगरेट, तीसरे दिन 60 सिगरेट, चौथे दिन 80 सिगरेट, और पांचवें दिन 100 सिगरेट से धूम्रपान करने के लिए उन्हें उजागर द्वारा धूम्रपान करने के लिए चूहों जलवायु के अनुकूल बनाना। दशानुकूलन अवधि के दौरान, संकट के संकेत के लिए ध्यान से चूहों निरीक्षण करते हैं।
  6. दशानुकूलन के 5 दिनों के बाद, प्रति दिन 100 सिगरेट, 5 या 6 दिन-प्रति-सप्ताह छह महीने के लिए करने के लिए चूहों को बेनकाब। धूम्रपान जोखिम का यह स्तर C57BL 6 / जंगली प्रकार चूहों में अपेक्षाकृत मामूली हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा (23,24) के लिए प्रेरित करने की जरूरत है। 6 महीने के लिए परिवेश कमरे में हवा को नियंत्रण चूहों को बेनकाब। शरीर के वजन पर धूम्रपान जोखिम के प्रभाव का आकलन करने के लिए साप्ताहिक उसके बाद धुआं दशानुकूलन से पहले चूहों वजन और।
  7. कुल निलंबित कण मॉनिटरपहले 60 सिगरेट के बाद लोगों तक पहुंचाने के कक्षों में मामला (TSPM) स्मोक्ड किया गया है:
    1. एक फिल्टर पेपर वजन और एक समय पर फिल्टर पारखी और सूखी गैस मीटर से जुड़ा है, जो एक में लाइन फिल्टर धारक में जगह। समयबद्ध फिल्टर पारखी फिल्टर पेपर और गैस मीटर उपायों नमूने के दौरान हवा के प्रवाह के माध्यम से लोगों तक पहुंचाने के चैम्बर से हवा खींचती है।
      नोट: लोगों तक पहुंचाने के चैम्बर हवा की 20 मीटर 3 के रूप में फिल्टर जाल बात कण (सूखी गैस मीटर पर मापा) फिल्टर के माध्यम से गुजरता है।
    2. पहले और एम 3 एयर प्रति (एमजी में) नमूने के बाद फिल्टर वजन में परिवर्तन के रूप में TPM गणना की गणना। आदर्श TPM मायने रखता है के बीच 150 और 200 मिलीग्राम / एम 3 रहे हैं।
  8. सिगरेट के सभी स्मोक्ड किया गया है के बाद, लोगों तक पहुंचाने के चैम्बर से पिंजरों को हटाने और 20 मिनट के लिए संकट के संकेत के लिए चूहों का पालन।
  9. प्रत्येक उपयोग के बाद 100% इथेनॉल के साथ पंप साफ है, और बढ़ावा देने के लिए मशीन द्वि-साप्ताहिक में सभी बंदरगाहों और छड़ साफहवा परिसंचरण और टार के निर्माण को रोकने के।

2. पल्मोनरी फंक्शन टेस्ट (PFTS) और फेफड़ों मुद्रास्फीति की दर

  1. जोखिम के अंत में, खारा के 200 μl में intraperitoneal मार्ग (खासियत द्वारा ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा), xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा), और acepromazine (3 मिलीग्राम / किग्रा) के एक कॉकटेल देने से प्रत्येक माउस anesthetize ग्रेड) और बाहर सुखाने से उन्हें रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सा मरहम का उपयोग करें। पशु, संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान में पैर की अंगुली चुटकी विधि का उपयोग का आकलन करने तक प्रतीक्षा करें।
  2. श्वासनली के लिए त्वचा पूर्वकाल दाढ़ी, और इथेनॉल के द्वारा पीछा एक आयोडीन युक्त समाधान के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित। Autoclaved कैंची का उपयोग श्वासनली के लिए त्वचा और चमड़े के नीचे ऊतक पूर्वकाल के माध्यम से एक मध्य रेखा चीरा, और ट्रेकिआ बेनकाब करने के लिए संदंश के साथ sternothyroid मांसपेशियों अलग।
  3. , श्वासनली के लिए रेशम सिवनी पीछे की एक दो इंच लंबाई दर्रा autoclaved टी के साथ ट्रेकिआ के पूर्वकाल पहलू पर एक ट्रेकिआटमी बनानेracheal कैंची, ट्रेकिआटमी में एक सांस की नली प्रवेशनी (18 जी) डालें, और सीवन के साथ उसे सही जगह पर।
  4. सांस की नली प्रवेशनी के माध्यम से मैकेनिकल वेंटीलेटर की एडाप्टर के वाई-ट्यूबिंग करने के लिए माउस कनेक्ट, और 10 मिलीग्राम / किलो का एक ज्वार की मात्रा और / मिनट 150 साँस के एक सांस की दर का उपयोग कर मैकेनिकल वेंटिलेशन आरंभ करें।
    नोट: यह माउस पर्याप्त रूप से सटीक PFT माप प्राप्त करने के लिए anesthetized है कि यह सुनिश्चित करने के लिए इस स्तर पर महत्वपूर्ण है। पशु संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान में नहीं है अगर एनेस्थेटिक्स के साथ माउस पुन खुराक। PFT युद्धाभ्यास के सभी की पूरी अवधि के बारे में 7.5 मिनट है, तो यह संज्ञाहरण के एक शल्य चिकित्सा विमान हासिल किया गया है एक बार एनेस्थेटिक्स के साथ चूहों redose करने के लिए आम तौर पर आवश्यक नहीं है। इच्छामृत्यु के लिए संज्ञाहरण की प्रेरण से कुल समय ~ 20 मिनट है।
  5. कुल फेफड़ों की क्षमता (टीएलसी) नि: श्वसन क्षमता (आईसी) को मापने और फेफड़ों की श्वासरोध कम करने के लिए एक मात्रा इतिहास के लिए तीन बार करने के लिए फेफड़ों में हवा। अगला, कामकाज, ब्रॉडबैंड आवृत्ति के लिए मजबूर दोलन पैंतरेबाज़ी (त्वरित प्रधानमंत्री -3 गड़बड़ी द्वारा पीछा श्वसन प्रणाली के elastance (नेताओं) और अनुपालन (सीआरएस), एकल आवृत्ति के लिए मजबूर दोलन पैंतरेबाज़ी (स्नैपशॉट-150 गड़बड़ी) एम और गतिशील प्रतिरोध (आर) का आकलन ) और केंद्रीय airway प्रतिरोध (आर एन), ऊतक प्रतिरोध (जी), ऊतक elastance (एच) और अनुपात जी के उपाय / एन ()। अंत में, मात्रा दबाव प्रवाह युद्धाभ्यास के दौरान रिकॉर्ड quasic स्थैतिक अनुपालन (सी एसटी)।
  6. इन युद्धाभ्यास के प्रत्येक पाँच बार दोहराएँ (या संगत रीडिंग प्राप्त कर रहे हैं जब तक अतिरिक्त उपाय प्रदर्शन) माप की प्रत्येक दोहराया सेट के बीच में तीन बार और टीएलसी को बढ़ा देते हैं। प्रत्येक माउस के लिए प्रत्येक पैरामीटर के लिए मतलब मूल्य रिकार्ड।
  7. मैकेनिकल वेंटीलेटर से माउस निकालें, और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 narcosis साथ यह euthanize [इस इच्छामृत्यु विधि हमारे संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है।] डायाफ्राम, सेशन कटmidline में छाती, और एन फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए पूर्वकाल पसलियों को हटा दें। श्वासनली के आसपास की त्वचा और चमड़े के नीचे ऊतक काटना और श्वासनली के लिए रेशम सिवनी पीछे की एक दूसरी 2 इंच की लंबाई से गुजरती हैं।
  8. फेफड़ों मुद्रास्फीति (चित्रा 2) के लिए उपकरण तैयार:
    1. बाँझ पीबीएस के साथ पूरा एक 500 मिलीलीटर शंक्वाकार Erlenmeyer फ्लास्क ¾ भरें एक रबड़ डाट के साथ इसे सील, इसे पलटना, और एक अंगूठी स्टैंड पर निलंबित (फॉस्फेट बफर खारा pH7.4 (पीबीएस) का meniscus के ऊपर 25 सेमी ऐसी है कि माउस के दिल)।
    2. रबड़ डाट के माध्यम से फ्लास्क में पीबीएस में सेट एक अंतःशिरा देने के एक छोर डालें। अपने उद्घाटन हवा कुप्पी छोड़ने पीबीएस को बदलने के लिए अनुमति देने के लिए पीबीएस के meniscus के ऊपर है कि इतनी रबड़ डाट के माध्यम से एक प्लास्टिक serologic पिपेट की एक 6 इंच लंबाई डालें।
    3. दे सेट के वाल्व खोलने और सिस्टम दे सेट से हवा बाहर निकलवाने के लिए हालांकि पीबीएस चलाते हैं।
  9. Intr कनेक्टसांस की नली प्रवेशनी avenous देने के सेट, वाल्व खुला है, और फेफड़ों को पूरी तरह से फुलाना तक पीबीएस गंभीरता से फेफड़ों में प्रवाह करने की अनुमति देते हैं। , वाल्व बंद सांस की नली प्रवेशनी के लिए शल्य सिवनी बाहर का उपयोग करते हुए ट्रेकिआ बंद टाई, और प्रवेशनी हटा दें।
  10. संदंश के साथ ट्रेकिआ लिफ्ट, और गाँठ को श्वासनली समीपस्थ कटौती, और श्वासनली और फेफड़ों के लिए संयोजी ऊतक पीछे काटना। ध्यान से (उन्हें nicking के बिना) फेफड़ों को हटाने, और 10% खारा बफर formalin युक्त एक ट्यूब में फेफड़ों जगह है। , फेफड़े हे / आरटी पर एन, और अगले दिन फिक्स दो बार पीबीएस के साथ उन्हें धोने।
  11. आयल में फेफड़ों एम्बेड, 5 माइक्रोन मोटी वर्गों में कटौती, और नीचे उल्लिखित के रूप में तो गिल की दाग ​​के साथ वर्गों दाग।

3. वातस्फीति

  1. आयल एम्बेडेड फेफड़ों वर्गों के गिल की धुंधला
    1. एक प्लास्टिक की रैक में स्लाइड प्लेस और एक ओवन में 20-30 मिनट के लिए 70ºC पर उन्हें सेते हैं।
    2. स्लाइड डी-pariffinizexylene के चार परिवर्तनों में से प्रत्येक में 2 मिनट के लिए उन्हें incubating द्वारा।
    3. 95% इथेनॉल के दो परिवर्तन में से प्रत्येक में 2-3 मिनट के द्वारा पीछा 100% इथेनॉल के दो परिवर्तन, में से प्रत्येक में 2-3 मिनट के लिए उन्हें incubating द्वारा स्लाइड rehydrate, और फिर 2-3 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार स्लाइड धोने समाधान के प्रत्येक बदलाव के लिए।
    4. गिल की Hematoxylin का एक मिश्रण है और संशोधित हैरिस Hematoxylin: एक एक में 18-48 घंटे के लिए स्लाइड सेते हैं।
    5. आसुत जल के पांच परिवर्तनों में से प्रत्येक में 2 मिनट के लिए स्लाइड धो लें, और 95% इथेनॉल के दो परिवर्तन में से प्रत्येक में 2-3 मिनट के लिए फिर incubating द्वारा स्लाइड्स निर्जलीकरण, 100% की दो परिवर्तन में से प्रत्येक में 2-3 मिनट का पालन इथेनॉल।
    6. Xylene के चार परिवर्तनों में से प्रत्येक में 2 मिनट के लिए उन्हें incubating द्वारा स्लाइड को साफ़ करें।
    7. स्पष्ट बढ़ते मीडिया के साथ स्लाइड माउंट और बाद के विश्लेषण में बाधा है, जो शुरू करने बुलबुले, बिना एक coverslip जोड़ें।
  2. यादृच्छिक छवि अधिग्रहण:
    1. झगड़ा फ़ाइल के रूप में काले और सफेद छवियों का मोलएक माइक्रोस्कोप, एक 20 एक्स उद्देश्य है, और उच्च गुणवत्ता वाले डिजिटल छवियों को प्राप्त कर सकते हैं कि एक कैमरा और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहा है।
    2. फेफड़ों के तहत फुलाया क्षेत्रों से परहेज प्रयोगात्मक हालत के लिए अंधा पर्यवेक्षक, के साथ एक यादृच्छिक ढंग से माउस प्रति कैद ~ 20-30 छवियों (x 200 बढ़ाई),।
    3. स्लाइड पर एक माइक्रो स्लाइड क्षेत्र की खोज करने वाली टेप। क्षेत्र खोजक (ऊर्ध्वाधर दिशा में) एक पत्र के साथ चिह्नित कर रहे हैं कि चौकों की एक श्रृंखला से युक्त एक ग्रिड और (क्षैतिज दिशा में) एक संख्या है और प्रत्येक वर्ग के केंद्र में एक क्रॉस (+) है और एक पत्र द्वारा की पहचान की है और नंबर (जैसे, A1, A2, ...... Z25)।
    4. बेतरतीब ढंग से छवि पर कब्जा करने के लिए एक वर्ग का चयन करने के लिए एक यादृच्छिक क्षेत्र जेनरेटर एक्सेल स्प्रेडशीट का उपयोग करें। एक यादृच्छिक पत्र बनाने के लिए, स्प्रेडशीट में सेल B1 में EFGHJKLMNPQRSTU दर्ज करें (शोधकर्ता फेफड़ों overlie कि एक पत्र द्वारा की पहचान चौकों की रेंज को कवर करने के लिए यह पत्र सीमा समायोजित कर सकते हैं)। इसके बाद, सूत्र जोड़ें [= मध्य ($ बी $ 1,1 + INT(रैंड () * LEN ($ बी $ 1)] बेतरतीब ढंग यादृच्छिक पत्र के एक स्तंभ उत्पन्न करने के लिए सी 2, सी 3, सी 4 वगैरह में एक सी 1। कॉपी में पत्र और पेस्ट सी 1 का चयन करने के सी 1 सेल।
    5. (5-25 स्लाइड पर ऊतक के विशिष्ट रेंज है) आसन्न कॉलम में एक यादृच्छिक संख्या बनाने के लिए, डी 1 में सूत्र = RANDBETWEEN (5,25) टाइप करें। वैकल्पिक रूप से, फेफड़ों overlie कि एक नंबर से पहचाना चौकों की रेंज को कवर करने के लिए इस सीमा को समायोजित।
    6. डी 2, डी 3, D4 वगैरह में कॉपी और पेस्ट डी 1 अगले कि युक्त यादृच्छिक पत्र के लिए यादृच्छिक संख्या के एक स्तंभ उत्पन्न करने के लिए। इस प्रकार, प्रत्येक पंक्ति क्षेत्र की खोज करने में चौराहों पर लेबल के लिए इसी बेतरतीब ढंग से उत्पन्न पत्र और नंबर की एक जोड़ी होता है (उदाहरण के लिए, E17, H24 ...।)।
    7. खुर्दबीन पर स्लाइड रखें। 4X खुर्दबीन उद्देश्य का उपयोग क्षेत्र खोजक स्लाइड में इसी वर्ग लगता है (उदाहरण के लिए, E17, H24 ...) और माइक्रोस्कोप मैदान के मध्य में इस वर्ग की जगह है।
    8. सूक्ष्म के केंद्र संरेखितचयनित वर्ग के केन्द्र में '+' के साथ मैदान। , क्षेत्र खोजक निकालें 20X खुर्दबीन उद्देश्य का उपयोग फेफड़ों पर ध्यान केंद्रित करने और एक ग्रे पैमाने पर TIF फ़ाइल के रूप में छवि अधिग्रहण। फेफड़े के ऊतकों को शामिल किया गया <सूक्ष्म क्षेत्र का 50% है, तो अगले बेतरतीब ढंग से उत्पन्न-वर्ग का चयन करें। 20-30 छवियों प्रत्येक जानवर के लिए कब्जा कर रहे हैं ~ जब तक दोहराएँ। फ़ाइलों को पहचान करने के लिए मैक्रो एक्सेल रिपोर्ट के लिए आदेश में जानवर के टैग संख्या के साथ लेबल एक एकल फ़ोल्डर में प्रत्येक जानवर के लिए सभी छवियों को बचाने।

4. Morphometry वातस्फीति उपाय

प्रोटोकॉल हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा का विश्लेषण करने के वंशज छवि और अनुकूलित मैक्रोज़ का उपयोग करता है। वंशज छवि Macintosh ऑपरेटिंग सिस्टम के अंतर्गत चलाता है, जो मूल एनआईएच छवि आवेदन की एक Windows- संगत संस्करण है। वंशज छवि Windows XP के अंतर्गत चलाता है और 'वंशज छवि' के लिए एक खोज के लिए लिंक करने के लिए उपयोगकर्ता निर्देशित करेंगे जहां Wikiversity.org, के माध्यम से ऑनलाइन अभी भी उपलब्ध हैवंशज छवि का मार्गदर्शन और बीटा 4.0.2 रिलीज। स्थापना और सॉफ्टवेयर आपरेशन ऑनलाइन पूरक पुस्तिका में विस्तृत और नीचे संक्षेप है। वायुकोशीय राग लंबाई मैक्रो एनआईएच छवि में उपलब्ध मैक्रो से अनुकूलित किया गया था।

  1. वंशज छवि विश्लेषण के लिए गिल की दाग ​​फेफड़ों अनुभाग का झगड़ा छवि तैयार:
    1. वंशज छवि प्रारंभ करें और ऑनलाइन पूरक में संकेत के रूप में मैक्रो को लोड। का चयन करें और छवि झगड़ा फ़ाइल को खोलने के लिए ओपन Brightfield छवि [1] मैक्रो का चयन करें। अगला, विश्लेषण के लिए छवि तैयार करने के लिए छवि संपादित करें उपकरण का उपयोग करें।
    2. हवाई क्षेत्र के रूप में या ऊतक के रूप में या तो इलाज किया जा हवाई क्षेत्र या वायुकोशीय दीवारों नहीं कर रहे हैं कि छवि के क्षेत्रों के लिए मजबूर करने के लिए पेंट-ब्रश उपकरण का उपयोग करें। वे ऊतक के रूप में विश्लेषण कर रहे हैं इतना है कि उदाहरण के लिए, काला ब्रांकाई और जहाजों रंग। वे हवाई क्षेत्र के रूप में विश्लेषण कर रहे हैं कि करने के लिए वायुकोष्ठिका सफेद में अंतरिक्ष कब्जे में भड़काऊ कोशिकाओं (या धूल) पेंट।
    3. पर माउस सूचक क्लिक करके पेंट ब्रश रंग का चयन करेंlut के खिड़की के नीचे स्थित शब्दों काला या सफेद। अगला, ब्रश उपकरण क्लिक करें। ब्रश उपकरण पर ब्रश आकार, डबल क्लिक करें बदलने के लिए और एक उचित ब्रश का आकार दर्ज करें। क्लिक करें और संरचनाओं चयनित रंग (ऊपर # 1 देखें) पेंट करने के लिए छवि पर माउस खींचें।
  2. हवाई क्षेत्र का मतलब ही राग लंबाई मापने
    1. [2] हवाई क्षेत्र डोरी लंबाई मापने के लिए मैक्रो तार की लंबाई एयर का चयन करें।
    2. थ्रेसहोल्ड तो दहलीज मूल्य (जानकारी विंडो में दिखाया गया है जो 0 और 255 के बीच एक नंबर,) को समायोजित करने के लिए ऊपर या नीचे माउस खींचें छवि के केंद्र के पास माउस क्लिक पहले से छवि,। माउस दहलीज मूल्य स्वीकार करने के लिए एक दूसरी बार क्लिक करें। मूल छवियों के रूप में वायुकोशीय दीवारों ही मोटाई बनाने के लिए दहलीज को समायोजित करें।
      नोट: यह शोधकर्ता नहीं दहलीज के तहत और इस तरह का उत्पादन होगा, जो मूल छवि में मौजूद नहीं है कि वायुकोशीय दीवारों में टूट जाता है पैदा करता है कि महत्वपूर्ण हैकृत्रिम रूप से उच्च राग लंबाई मूल्यों।
    3. प्रोग्राम स्वचालित रूप से एकल पिक्सेल (8 सफेद पिक्सल से घिरा हुआ एक काले पिक्सल) को हटा।
    4. > 4.2.4 उन्हें। उपयोगकर्ता के लिए फिर से दहलीज द्विआधारी छवि संकेत देता है जो एक खिड़की का निरीक्षण मैक्रो जारी है, या मैक्रो रद्द कर दें। फिर दहलीज, शीघ्र करने के लिए वाई के जवाब और ओके बटन का चयन करें।
    5. > 4.2.5 उन्हें। 5 पिक्सल अलग मैक्रोज़ द्वारा बनाई गई लाइनों के साथ एक क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर ग्रिड खिड़की कल्पना। कार्यक्रम के हवाई क्षेत्र ओवरलैप कि क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर लाइनों की लंबाई के उपाय।
    6. किसी भी फ़ोल्डर में फ़ाइल सहेजें, लेकिन अन्यथा एक्सेल रिपोर्ट मैक्रोज़ प्रारूप हवाई क्षेत्र डोरी लंबाई के लिए "CLa.txt" के साथ संलग्न छवि का नाम है (फ़ाइल नहीं मिलेगा डिफ़ॉल्ट नाम बदल नहीं है।
      नोट: कार्यक्रम की माप करना नहीं है, तो दहलीज मूल्य भी कम हो सकता है (होना चाहिए> 1)। यह एक उच्च मूल्य का उपयोग करते हुए, शोधकर्ता पुनः थ्रेसहोल्ड छवि होती है।
    7. एम> 4.2.7। वायुकोशीय क्षेत्र मापन के लिए (अलावा लंबाई तार को), अतिरिक्त चलाने [4] और [5] मैक्रोज़ के रूप में अच्छी तरह से।
    8. > 4.2.8 उन्हें। छवियों के सभी विश्लेषण किया गया है जब तक जारी रखें।
  3. एक्सेल रिपोर्ट मैक्रो का उपयोग परिणामों का विश्लेषण
    1. ओपन एक्सेल रिपोर्ट 20x.xls। आवश्यक इस्तेमाल किया जा रहा Excel संस्करण में डिफ़ॉल्ट सुरक्षा सेटिंग के आधार पर यदि मैक्रो को मैन्युअल रूप सक्षम।
    2. मैक्रो खिड़की में मैक्रो की एक सूची का निरीक्षण (1 टेबल देखें)।
      नोट: CL_Air_1 एक भी जानवर (फ़ोल्डर) के लिए airspaces की डोरी लंबाई की रिपोर्ट। CL_Air_Multi कई जानवर (फ़ोल्डर) के लिए airspaces की डोरी लंबाई की रिपोर्ट। AP_No_Edge_1 .AP_No_Edge_Multi कई जानवर (फ़ोल्डर) के लिए बढ़त संपर्कों के बिना वायुकोष्ठिका के क्षेत्र की रिपोर्ट एक भी जानवर (फ़ोल्डर) के लिए बढ़त संपर्कों के बिना वायुकोष्ठिका के क्षेत्र की रिपोर्ट। AP_With_Edge_1 एक भी जानवर (फ़ोल्डर) के लिए बढ़त संपर्कों के साथ वायुकोष्ठिका के क्षेत्र की रिपोर्ट। AP_With_Edge_Multi बढ़त के साथ ग वायुकोष्ठिका के क्षेत्र की रिपोर्टएकाधिक फ़ोल्डर्स के लिए ontacts।
    3. कई चूहों से छवियों को इसी एकाधिक फ़ोल्डर्स के लिए वायुकोशीय राग लंबाई माप की रिपोर्ट करने CL_Air_Multi मैक्रो चुनें। कार्यक्रम चयनित फ़ोल्डर में _CLa.txt फ़ाइलों के सभी रिपोर्ट। वर्तमान फ़ोल्डर का कोई सबफ़ोल्डर के लिए यह चलती है या _CLa भाग का नाम बदलने से (जरूरत के रूप में) एक _CLa.txt फाइल न आना।
    4. फ़ाइल खिड़की से, (प्रोग्राम एक समय में एकाधिक चयन का समर्थन नहीं करता है) ठीक है का चयन तो फ़ोल्डर पर प्रकाश डाला द्वारा एक समय में एक फ़ोल्डर का चयन करें। प्रत्येक फ़ोल्डर चयन किया जाता है के रूप में, वर्कशीट पर यह निरीक्षण करते हैं। चुनें "रद्द" या जारी रखने के लिए फ़ाइल विंडो बंद करें।
      नोट: Excel के संस्करण पर निर्भर करता है, शोधकर्ता प्रत्येक फ़ोल्डर चयनित होने के बाद वापस एक फ़ोल्डर स्तर नेविगेट करने के लिए हो सकता है।
    5. सभी _CLa.txt फाइलों से संयुक्त राग लंबाई डेटा के लिए आँकड़े द्वारा पीछा प्रत्येक _CLa.txt फ़ाइल के लिए आंकड़े दिखा रहा है, प्रत्येक फ़ोल्डर के लिए एक अलग वर्कशीट का निरीक्षण करें।
    6. नाम बदलें और स्प्रेडशीट बचाने के लिए। डिफ़ॉल्ट फ़ाइल नाम _CLa.xls साथ संलग्न मूल फ़ोल्डर का नाम है। एक और मैक्रो को चुनने से पहले वर्कशीट बंद करें।

5. लघु श्वासनली Remodeling

  1. धुंधला और छवि अधिग्रहण
    1. एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर मैसन का Trichrome दाग के साथ फेफड़ों वर्गों दाग और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    2. खुर्दबीन पर 20x उद्देश्य का उपयोग एक छवि क्षेत्र के भीतर (जमा कर रहे हैं कि ईसीएम प्रोटीन की परत है जो airway के बाहर नीले रंग की परत सहित) पूरी तरह से शामिल किया जा सकता है कि दोनों फेफड़ों में सभी एयरवेज की छवियों पर कब्जा।
      नोट: बड़ा एयरवेज सीएस उजागर चूहों में ईसीएम प्रोटीन की वृद्धि बयान के साथ संबद्ध नहीं हैं।
    3. जेपीईजी फ़ाइलें के रूप में रंग छवियों को बचाओ।
  2. छवि विश्लेषण: छवि फ़ाइल खोलेंछवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में।
    1. खोलें और माप रिकॉर्ड करने के लिए लॉग फ़ाइल नाम।
    2. एक लाइन ड्राइंग उपकरण का चयन करें। Airway के आकार को मापने के लिए airway के लुमेन (आंतरिक व्यास) को पार कर चार लाइनों ड्रा और केवल उन एयरवेज विश्लेषण में वांछित आकार वाले शामिल हैं। अगला, नीला दाग क्षेत्र के किनारे करने के लिए airway के बाहर abutting adventitial परत के किनारे से बढ़ा (एक घड़ी की संख्या को इसी airway में स्थिति पर) मोटाई मापने के लिए वायु-मार्ग 12 समान रूप से स्थान दिया गया है लाइनों घिरे आकर्षित airway के बाहर जमा ईसीएम प्रोटीन की परत के (चित्रा 5)। Airway के अन्य एयरवेज या जहाजों के साथ सूचना का आदान प्रदान क्षेत्रों में जहां मापने से बचें।
    3. तो पहले लॉग फ़ाइल में आंतरिक व्यास लाइनों के सभी रिकॉर्ड, और वायुमार्ग के आसपास नीले ईसीएम परत की मोटाई मापने कि 12 लाइनों रिकॉर्ड है।
    4. छवि तो अगली छवि को खोलने बंद करें।
      5. <पशुओं के लिए सभी छवियों को एक फोल्डर में लॉग इन किया गया है जब तक ली> इन चरणों को दोहराएँ।
    5. अगले पशु से फेफड़ों वर्गों पर कब्जा कर लिया छवियों में शामिल है, जो अगले फ़ोल्डर के लिए कदम 5.2 में शुरू। प्रयोग में पशुओं के सब से फेफड़ों वर्गों में वायुमार्ग के सभी का विश्लेषण पूरा करने के बाद कार्यक्रम से बाहर निकलें।
    6. 4 आंतरिक व्यास माप और एक एक्सेल स्प्रेडशीट में डेटा लॉग फाइल में प्रत्येक माउस के लिए प्रत्येक airway के लिए दर्ज 12 ईसीएम प्रोटीन की परत मोटाई माप दर्ज करें। प्रत्येक जानवर के लिए व्यास और ईसीएम प्रोटीन की परत मोटाई माप औसत।
    7. माइक्रोन के लिए पिक्सल से माप कन्वर्ट।
    8. समूह अपने आंतरिक व्यास आकार के अनुसार एयरवेज (उदा।, 300-399 माइक्रोन, 400-499 माइक्रोन आदि) धुएं से अवगत कराया चूहों बनाम हवा के लिए इसी तरह के आकार के होने एयरवेज के आसपास और तुलना ईसीएम प्रोटीन की परत मोटाई माप (उदाहरण के लिए।, 300-899 माइक्रोन की एक व्यास होने एयरवेज;
    9. (मध्य कोलेजन और तहखाने झिल्ली प्रोटीन सहित) व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए, immunostain फेफड़ों वर्गों की जरूरत है और इस पद्धति का उपयोग हित के प्रोटीन के जमाव यों के लिए एक समान विश्लेषण करते हैं।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल सीएस के लिए चूहों के पूरे शरीर प्रदर्शन के साथ शुरू होता है। पर्याप्त निरीक्षण और डिवाइस और TPM की निगरानी के रखरखाव लगातार धुआं जोखिम (चित्रा 1) सुनिश्चित गिना जाता है। शोधकर्ता मुद्रास्फीति डिवाइस का उपयोग फेफड़ों मुद्रास्फीति तकनीक प्रथाओं है कि यह महत्वपूर्ण है

इस प्रोटोकॉल सीएस के लिए चूहों के पूरे शरीर प्रदर्शन के साथ शुरू होता है। पर्याप्त निरीक्षण और डिवाइस और TPM की निगरानी के रखरखाव लगातार धुआं जोखिम (चित्रा 1) सुनिश्चित गिना जाता है। यह शोधकर्ता प्रथाओं ध्यान से मुद्रास्फीति डिवाइस (चित्रा 2) का उपयोग करने और फेफड़ों मुद्रास्फीति तकनीक हवाई क्षेत्र इज़ाफ़ा का सटीक विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से फुलाया फेफड़ों वर्गों को प्राप्त करने के क्रम में मुद्रास्फीति के बाद फेफड़ों को हटा महत्वपूर्ण है। 3B चित्रा एक खराब फुलाया फेफड़ों से पता चलता है, जबकि चित्रा 3A एक अच्छी तरह से फुलाया फेफड़ों से पता चलता है। चित्रा -3 सी thresholding के लिए तैयार एक फुलाया फेफड़ों खंड की एक छवि से पता चलता हैवायुकोशीय रिक्त स्थान में TEP (मैक्रोफेज सफेद चित्रित कर रहे हैं, और जहाजों और ब्रांकाई उत्पन्न करने के लिए काले रंग चित्रित कर रहे हैं। thresholding कदम वायुकोशीय अंतरिक्ष में सभी पिक्सल सफेद होते हैं जिसमें एक द्विआधारी छवि बनाता है और वायुकोष्ठिका फेफड़ों के क्षेत्रों में सभी पिक्सल नहीं कर रहे हैं, जो हैं काला (चित्रा 3 डी)। चित्रा 3E और 3F ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज वायुकोशीय राग मैक्रो को क्रमश: उत्पन्न कि लंबाई दिखा।

पल्मोनरी फंक्शन टेस्ट (6 महीनों के लिए सीएस से अवगत कराया C57BL 6 / WT चूहों में विकसित करता है कि हल्के वातस्फीति के साथ संगत फेफड़ों की लोचदार हटना के मामूली नुकसान को दर्शाती छोरों दबाव मात्रा (पीवी) में छोड़ दिया मामूली (और सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं) पाली दिखाने चित्रा -4 ए)। पीवी छोरों में महत्वपूर्ण बाईं पारियों में केवल सीएस की या सीएस उजागर C57BL 6 / WT चूहों की तुलना में एक अधिक गंभीर वातस्फीति फेनोटाइप होने सीएस उजागर जीन-लक्षित चूहों में प्रभाव के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं कि murine उपभेदों में मनाया जाता है।

अंजीरure 5 सीएस उजागर पशुओं में छोटे एयरवेज के आसपास ईसीएम प्रोटीन बयान में बढ़ जाती है illustrating 6 महीने के लिए हवा (चित्रा 5 ए) या ​​सीएस (चित्रा 5 ब) के संपर्क में C57BL 6 / WT चूहों की मैसन का Trichrome दाग फेफड़ों वर्गों। चित्रा प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है 5C एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम वांछित आंतरिक व्यास होने एयरवेज के आसपास ईसीएम प्रोटीन बयान quantifies दिखाता है कि कैसे। चित्रा 5D सीएस उजागर C57BL 6 / WT चूहों में 300-899 माइक्रोन की एक व्यास के साथ एयरवेज के आसपास ईसीएम प्रोटीन के जमाव के विश्लेषण से पता चलता है।

चित्रा 1
चित्रा 1. पूरे शरीर सिगरेट जोखिम प्रणाली का एक कार्टून। ए धूम्रपान जोखिम डिवाइस एक धूम्रपान जोखिम कक्ष से जुड़ा है। धुआँ पक्ष-धारा संग्रह कक्ष से खींच लिया है और धुएं से खींच लिया हैपंप द्वारा सिगरेट, और दोनों धुआं नमूने मिश्रित और मिश्रण और कमजोर पड़ने के चैम्बर (बाएं) में परिवेशी वायु के साथ पतला कर रहे हैं, और फिर धूम्रपान जोखिम चेंबर में बहती है। शोधकर्ता जोखिम कक्ष (दाएं) में अपने पिंजरों में चूहों स्थानों; चूहों उनके पिंजरों में आसानी से ले जाने के लिए, और धूम्रपान जोखिम की अवधि के लिए भोजन और पानी के लिए उपयोग करने में सक्षम हैं।

चित्रा 2
Murine फेफड़ों की चित्रा 2. मुद्रास्फीति की दर। शोधकर्ता एक रबड़ डाट के साथ जवानों, बाँझ पीबीएस के साथ यह एक कुप्पी भर जाता है, और यह inverts और एक अंगूठी स्टैंड का उपयोग कर पशु के दिल के ऊपर यह 25 सेमी की दूरी सुरक्षित करता है। एक अंतःशिरा देने के सेट सांस की नली प्रवेशनी के माध्यम से फेफड़ों के लिए पीबीएस बचाता है। एक कट नीचे serologic पिपेट रबड़ डाट के माध्यम से डाला जाता है और इस लू में नालियों पीबीएस की मात्रा की जगह है कि करने के लिए कुप्पी में हवा की अनुमति देता हैगुरुत्वाकर्षण के द्वारा चूहों के NGS।

चित्रा 3
चित्रा 3. वातस्फीति विश्लेषण। (ए) Gill's-दाग़ के एक प्रतिनिधि छवि 6 महीने के लिए हवा या सीएस के संपर्क में चूहों से फेफड़ों वर्गों फुलाया पता चलता है, काला तीर एक पोत और वायुकोशीय मैक्रोफेज संकेत मिलता है। (बी) के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है कि एक के तहत फुलाया फेफड़ों के एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। (क) "से पहले" और (सी) से पता चलता है पता चलता है शोधकर्ता एक द्विआधारी छवि की पीढ़ी के लिए तैयार करता है कि एक प्रतिनिधि फेफड़ों खंड की छवि "के बाद"। (ए) और (सी) में काला तीर एक पोत या तो संकेत मिलता है (अनुसंधानकर्ता में काला पेंट, जो (सी)) या वायुकोशीय मैक्रोफेज (अनुसंधानकर्ता में सफेद पेंट, जो (सी))। (डी) < शोधकर्ता दहलीज कदम को निष्पादित करने के बाद / strong> के द्विआधारी छवि को दर्शाता है। (ई) और (च) क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर वायुकोशीय राग शोधकर्ता क्रमश: उत्पन्न करता है कि लंबाई दिखा। सभी छवियों की बढ़ाई 400 माइक्रोन (ए) में दिखाया गया है का प्रतिनिधित्व X 200 के स्केल बार है।

चित्रा 4
चित्रा 4. वायुकोशीय तार की लंबाई और दबाव मात्रा घटता। (ए) के 6 महीने के लिए हवा (एन = 13) या सीएस (एन = 24) के संपर्क में C57BL 6 / WT चूहों में वायुकोशीय राग लंबाई की एक ठेठ विश्लेषण से पता चलता है। तारक पी <0.001 इंगित करता है। (बी) के 6 महीने के लिए हवा (एन = 13) या सीएस (एन = 14) के संपर्क में C57BL 6 / WT चूहों पर प्रदर्शन ठेठ पी.वी. छोरों से पता चलता है। डाटा मतलब + SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है।

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चित्रा 5. लघु airway के remodeling के (एसएआर) का आकलन। (ए) और (बी) के 6 महीने के लिए हवा (ए) या ​​सीएस (बी) के संपर्क में C57BL 6 / WT चूहों से मैसन का Trichrome दाग फेफड़ों वर्गों के प्रतिनिधि छवियों को दिखाने के। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर सीएस उजागर चूहों में खोज एवं बचाव का विश्लेषण करती है कि कैसे (सी) से पता चलता है। (डी) (एन = 16) 6 के लिए (एन = 11) हवा के संपर्क में C57BL 6 / WT चूहों में 300-899 मीटर की एक व्यास वाले छोटे एयरवेज के आसपास जमा बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन की परत की मोटाई के विशिष्ट माप से पता चलता है या सीएस महीने। डाटा मतलब + SEM और तारक के रूप में व्यक्त कर रहे हैं पी <0.05 इंगित करता है।

स्केल सलाखों प्रत्येक फेफड़ों खंड की छवियों पर दिखाया जाता है।

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Acknowledgments

हम इस लेख में उनके योगदान के लिए फ्रांसिस्का Polverino एमडी, ब्रिघम पर एक रिसर्च फेलो और महिला अस्पताल का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और भी मोनिका याओ, बी, और केट Rydell, murine पशुपालन और सिगरेट के धुएं के चूहों को प्रकाश में लाने के साथ उनकी सहायता के लिए बी एस।

इस काम के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान अनुदान HL111835, HL105339, HL114501, उड़ान परिचारक चिकित्सा अनुसंधान संस्थान अनुदान # CIA123046, ब्रिघम और महिला अस्पताल-लोवेलास श्वसन अनुसंधान संस्थान कंसोर्टियम, और कैम्ब्रिज NIHR बायोमेडिकल द्वारा समर्थित किया गया रिसर्च सेंटर।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Whole-body smoke exposure device Teague Enterprise TE-10z Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette University of Kentucky 3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm Pall Corporation 7219 For measurement of TPMs
25 mm filter holder Pall Corporation
Filter sampler Intermatic Metal T100
Gas meter AEM Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge Labinvention Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator Scireq FlexiVent
Gill's hematoxylin solution  Sigma-Aldrich GSH316 For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified Sigma-Aldrich HHS16
Cytoseal-60 Thermo Scientific 8310-16
Micro-Slide-Field-Finder Andwin Scientific INC 50-949-582 For analysis of emphysema
Scion Image Program Scion Corporation
Mason's trichrome stain Sigma-Aldrich HT15 For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0 Molecullar Devices LLC 31032

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References

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Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice. J. Vis. Exp. (95), e52236, doi:10.3791/52236 (2015).

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