Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

Introduction

O uso de modelos animais para estudar a DPOC é um desafio, porque nenhum modelo pode perfeitamente replicar todas as características da doença humana ^(2). A maioria dos investigadores usar ratos para modelar DPOC causa das semelhanças entre ratos e seres humanos em suas pulmonares fisiologia, patologia, genética e metabólitos. Além disso, os ratos são relativamente baratos para estudar, e ambos enfisema e remodelação das vias aéreas pequenas desenvolver dentro de 6 meses de exposição CS ^(5,7-9).

Cigarro COPD induzida pelo fumo: Vários métodos podem induzir DPOC em camundongos. A maioria dos pesquisadores expor ratos para CS, que é o principal fator etiológico para a DPOC humano. CS exposição durante 6 meses faz com que o desenvolvimento de enfisema e remodelação das vias aéreas pequenas (SAR) em ratos, mas a gravidade da doença que é induzida varia dependendo da estirpe murina estudado. Por exemplo, ratinhos NZWLacZ são resistentes ao desenvolvimento de enfisema induzido por CS enquanto que os ratinhos AKR / J são extremely sensível ^(10). A maioria dos investigadores estudar camundongos C57BL / 6 tensão no modelo de exposição CS como muitos ratos alvo de genes estão disponíveis nesta estirpe. Após 6 meses de exposição CS, enfisema e fibrose das vias aéreas pequenas desenvolver no tipo selvagem (WT) murganhos C57BL / 6, e as duas lesões são relativamente leves em termos de gravidade ^(5,10). Pesquisadores usam dois tipos de exposição CS: nose-somente e de corpo inteiro exposições. As principais desvantagens do nariz só de técnica de exposição são de que: 1) é um método mais trabalhoso; e 2) os ratos têm que ser contido em pequenas câmaras que podem induzir uma resposta ao estresse e hipertermia nos animais ^(11). A principal desvantagem da exposição de todo o organismo (descrito aqui) é que os animais possam ingerir (bem como inspirar) nicotina e de alcatrão produtos quando eles limpar sua pele. Ratos expostos a todo o organismo CS também possuem níveis de carboxihemoglobina inferiores e perda de peso corporal reduzido quando comparados com animais expostos ao nariz só de CS ^(12).

teste de função pulmonar (TFP): Medidas de complacência pulmonar e elastância são geralmente semelhantes em camundongos C57BL / 6 do tipo selvagem (WT) camundongos expostos ao ar ou CS por 6 meses, devido ao enfisema relativamente suave que se desenvolve quando este estirpe é exposto a CS ^(10). No entanto, quando a destruição enfisematosa é mais grave, os aumentos da complacência pulmonar esquerda e mudanças na pressão-volume (PV) de fluxo laços podem ser detectados. Este último pode ser observado, por exemplo, em estirpes de murinos que são mais susceptíveis aos efeitos de SC ^(10), em ratinhos alvo de gene CS-expostos estirpe C57BL / 6 que têm um tipo de enfisema mais grave do que ratinhos C57BL / 6 WT ^(13), ou em ratos expostos CS-sujeitas a alterações ambientais que os tornam mais susceptíveis aos efeitos de SC ^(14). Este protocolo usa um ventilador para pequenos animais para medir reduções no recolhimento elástico dos pulmões (aumento da complacência pulmonar quasiestático [Cst] e reduções em tecidoelastância [H]), loops de fluxo PV, e as mudanças na resistência das vias aéreas e do tecido em ratos anestesiados ^(15,16).

Medidas de enfisema pulmonar: Análise do desenvolvimento enfisema em CS-exposta C56BL / 6 ratos estirpe é um desafio, porque sua distribuição é espacialmente heterogêneo. Vários métodos diferentes quantificar o alargamento do espaço aéreo em camundongos. O primeiro método usado foi a intercepção linear média (L _m) ^(17). No entanto, o método L, _m é um processo manual e lento que não pode captar a heterogeneidade da doença (a não ser que todas as secções do pulmão são amostrados aleatoriamente) e a sua utilização pode, por conseguinte, apresentar preconceito do observador para a análise. O índice destrutiva [DI, ^(18)], também quantifica o alargamento do espaço aéreo usando uma folha transparente com 50 pontos distribuídos igualmente colocados sobre uma imagem digitalizada impressa de uma secção do pulmão corado com hematoxilina-eosina e. O método PI pontuações a área ao redor de cada ponto de acgundo a medida em que as condutas alveolares e paredes alveolares dentro desta área sejam destruídos. A principal desvantagem do método DI é que é demorada e não mais preciso do que outros métodos ^(19,20).

Este medidas de protocolo significa comprimento da corda alveolar e área alveolar em secções de pulmão embebidos em parafina coradas com a técnica de Gill. Morfometria software converte imagens de secções de pulmão para imagens binárias (em que o tecido é branco e do espaço aéreo é preto), e depois sobrepõe uma grade uniforme de linhas horizontais e verticais (cordas) e, em seguida, o software quantifica a duração de cada acorde dentro de áreas identificadas pelo software como o espaço aéreo. Usando este método, é possível medir o tamanho dos alvéolos em todas as partes do pulmão de uma forma padronizada e relativamente automatizada ^(21).

Remodelamento das vias aéreas Pequeno (SAR): O aumento da deposição de proteínas da MEC (especialmente interstitial colágenos) em torno de pequenas vias aéreas ocorre em animais CS-expostas e contribui para o fluxo de ar de obstrução. Os pesquisadores não estudam SAR em modelos animais de DPOC tão freqüentemente quanto o desenvolvimento do enfisema ^(22). Para quantificar SAR em ratinhos CS-expostos, este protocolo utiliza software de análise de imagem para medir a espessura da camada de proteínas da MEC que se deposita em volta das pequenas vias aéreas (vias respiratórias, com um diâmetro médio entre 300 e 899 m) em secções de pulmão embebidos em parafina corados com tricrômico de Masson.

Protocol

O protocolo tem ~ 25 semanas para ser concluído. O protocolo de ratinhos ao ar ou fumo expostos durante 24 semanas. No final das posições de fumo, as medidas de protocolo da função pulmonar nos ratos, e os pulmões são insuflados a uma pressão fixa, fixa, e retirados no mesmo dia. É necessário mais tempo para o pesquisador para incorporar, corte e coloração das secções de pulmão (2-3 dias), e captura e analisar as imagens (2-4 dias, dependendo do número de animais estudados). Este protocolo pode igualmente ser utilizado para medir relacionada com a idade em ratinhos alargamento do espaço aéreo.

Todos os procedimentos descritos neste protocolo ter sido aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional no Hospital Brigham and Women / Harvard Medical School.

1. de Corpo Inteiro Cigarette Smoke Exposure

1. Expor ratos para fumar em um dispositivo de exposição à fumaça de corpo inteiro (veja a Figura 1) instalado em um exaustor.
   NOTA: O dispositivo carrega automaticamente cigarros da investigação para a roda, lireitos os cigarros, e coleta de fumaça lateral-stream na câmara de coleta de fumaça lateral-stream, e ejeta os cigarros. A máquina combina fumo lateral com fumo principal extraído do cigarro por uma bomba para criar uma mistura de mainstream e side-stream fumaça. O ventilador na câmara de mistura e diluição da mistura de fumo com o ar ambiente e conduz o fumo em câmaras de exposição.
2. Coloque as gaiolas contendo os ratos sem as tampas removidas gaiola (Figura 1) na câmara de exposição. Permitir que os ratos para se movimentar livremente em suas gaiolas e ter acesso a alimentos e água para a duração da exposição à fumaça (~ 1,75 h).
3. Coloque um balde com água por baixo da câmara de cigarro para apagar os cigarros ejetado. Execute etanol (100%) através da bomba e conectá-lo ao dispositivo. Ligar o microprocessador de elementos do dispositivo, o qual inicia o carregamento automático dos cigarros, de tufagem da bomba, e o aquecimento do cigarro lighwire ting.
4. As cargas de dispositivos, luzes e fuma 10 cigarros por vez e depois ejeta os cigarros usados ​​e os substitui por um novo lote de 10 cigarros e repete este processo. Cada ciclo é de 9 min.
5. Aclimatar ratos para fumam, expondo-os à fumaça de 20 cigarros no primeiro dia, 40 cigarros no segundo dia, 60 cigarros ao terceiro dia, 80 cigarros no quarto dia, e 100 cigarros no quinto dia. Durante o período de aclimatação, observar os ratos cuidadosamente para sinais de perigo.
6. Após 5 dias de aclimatação, os ratos para expor 100 cigarros por dia, 5 ou 6 dias-por-semana durante 6 meses. É necessária Este nível de exposição à fumaça de induzir o alargamento do espaço aéreo relativamente modesto em camundongos C57BL / 6 do tipo selvagem (23,24). Expor os camundongos de controle para o ar ambiente por 6 meses. Pesar camundongos antes fumaça aclimatação e, semanalmente para avaliar o efeito da exposição à fumaça do peso corporal.
7. Monitorar a partículas totais suspensasmatéria (MPTA) nas câmaras de exposição após os primeiros 60 cigarros foram fumados:
   1. Pesar um papel de filtro e colocá-lo num suporte de filtro em linha que está ligado a um amostrador de filtro cronometrada e medidor de gás seco. O amostrador de filtro cronometrado puxa o ar da câmara de exposição através do papel de filtro e as medidas de medidor de gás do fluxo de ar durante a amostragem.
      NOTA: O armadilhas de filtro de partículas como 20 m ³ de exposição da câmara de ar passa através do filtro (medido com o medidor de gás seco).
   2. Calcula-se a contagem de TPM como a mudança no peso do filtro antes e após a amostragem (em mg) por m ³ de ar. Contagens TPM ideais são entre 150 e 200 mg / m ^3.
8. Depois de todos os cigarros foram fumados, remover as gaiolas da câmara de exposição e observar os ratinhos relativamente a sinais de sofrimento para 20 min.
9. Limpar a bomba com etanol a 100% depois de cada utilização, e limpar todas as portas e as hastes na máquina bi-semanal para promovercirculação do ar e evitar a acumulação de alcatrão.

2. Teste de Função Pulmonar (TFP) e da inflação Lung

1. No final das exposições, anestesiar cada rato através da apresentação de um cocktail de cetamina (100 mg / kg), xilazina (10 mg / kg), e acepromazina (3 mg / kg) por via intraperitoneal em 200 ul de solução salina (USP grau) e usar pomada veterinária sobre os olhos para evitar que sequem. Aguarde até que o animal está em um plano cirúrgico de anestesia, avalia usando o método toe-pinch.
2. Raspar a pele anterior à traquéia, e desinfectar a região com uma solução contendo iodo seguido por etanol. Fazer uma incisão na linha média através da pele e do tecido subcutâneo anterior à traqueia usando uma tesoura autoclavada, e separar os músculos esternotireóideo com fórceps para expor a traqueia.
3. Passe um comprimento de fio de seda posterior de 2 polegadas para a traquéia, fazer uma traqueotomia na face anterior da traquéia com autoclavada ttesoura racheal, inserção de uma cânula traqueal (18 G) na traqueotomia e prendê-lo no lugar com a sutura.
4. Conecte o mouse para a Y-tubo do adaptador do ventilador mecânico através da cânula traqueal, e iniciar ventilação mecânica com volume corrente de 10 ml / kg e uma freqüência respiratória de 150 ciclos / min.
   NOTA: É importante, nesta fase, para garantir que o mouse está devidamente anestesiados para obter medidas precisas PFT. Re-dosar o mouse com anestésicos se o animal não está em um plano cirúrgico de anestesia. A duração total de todas as manobras dos TFP é de cerca de 7,5 min, por isso não é normalmente necessário para redose os ratos com anestésicos uma vez atingido um plano cirúrgico de anestesia. O tempo total de indução de anestesia para eutanásia é ~ 20 minutos.
5. Encha os pulmões a capacidade pulmonar total (CPT) 3 vezes para um histórico de volume para medir a capacidade inspiratória (CI) e reduzir atelectasia dos pulmões. Em seguida, perforsou forçado a manobra de oscilação de frequência única (Instantâneo 150 perturbação) e avaliar a resistência dinâmica (R), elastância (ERS) e conformidade (CRS) do sistema respiratório, seguida pela frequência de banda larga forçado manobra oscilação (Quick Prime-3 perturbação ) e medir a resistência das vias aéreas centrais _(Rn), a resistência do tecido (G), Elastância tecido (H) e a relação de G / N (). Finalmente, recorde quasic-estático cumprimento (C _st) durante as manobras de fluxo de volume e pressão.
6. Repita cada uma dessas manobras cinco vezes (ou executar medidas adicionais até se obterem leituras idênticas) e inflar a TLC três vezes entre cada conjunto de medições repetidas. Registar o valor médio para cada parâmetro para cada mouse.
7. Remover o mouse do ventilador mecânico, e sacrificá-lo com narcose CO _2, seguido de luxação cervical [este método eutanásia é aprovado pelo nosso Animal Care Institucional e Comitê de Uso]. Corte o diafragma, open o tórax na linha média, e remover as nervuras anterior para expor os pulmões. Dissecar a pele e tecido subcutâneo ao redor da traquéia e passar por um segundo comprimento de fio de seda posterior de 2 polegadas para a traquéia.
8. Preparar o equipamento para a inflação do pulmão (Figura 2):
   1. Encher um balão de Erlenmeyer de 500 ml até ¾ cónica com PBS estéril, selá-lo com uma rolha de borracha, invertê-lo, e suspendê-lo sobre um suporte de anel (de modo que o menisco do pH 7,4 tampão fosfato salino (PBS) é de 25 cm acima o coração do rato).
   2. Insira uma extremidade de uma doação intravenosa definido para o PBS no balão através da rolha de borracha. Inserir um comprimento de uma pipeta serológica de plástico através da rolha de borracha de 6 polegadas de modo a que a sua abertura se encontra acima do menisco do PBS para permitir que o ar para substituir PBS deixando o frasco.
   3. Abra a válvula do conjunto dando e executar PBS embora o sistema para expulsar o ar do conjunto dando.
9. Conecte o intrdoação conjunto avenous à cânula traqueal, abra a válvula, e permitir que PBS a fluir para dentro dos pulmões por gravidade até os pulmões inflar completamente. Fechar a válvula, amarrar traquéia usando o distal sutura cirúrgica para a cânula traqueal, e remover a cânula.
10. Levante a traqueia com uma pinça, e cortar o proximal traquéia para o nó, e dissecar o posterior tecido conjuntivo para a traquéia e os pulmões. Remova cuidadosamente os pulmões (sem nicking eles), e coloque os pulmões em um tubo contendo formol a 10% tamponado com solução salina. Fixar a pulmões O / N à temperatura ambiente, e no dia seguinte, lavá-las com PBS duas vezes.
11. Incorporar os pulmões em parafina, cortados 5 mm de espessura, e, em seguida, manchar as seções com mancha de Gill, conforme descrito abaixo.

3. Enfisema

1. Coloração das secções de pulmão embebidos em parafina de Gill
   1. Colocar as lâminas em um rack de plástico e incubar a 70ºC por 20-30 minutos em um forno.
   2. De-pariffinize as lâminasatravés da sua incubação durante 2 min em cada uma de quatro mudanças de xileno.
   3. Re-hidratar as lâminas através da sua incubação durante 2-3 min em cada uma de duas mudanças de etanol a 100%, seguido de 2-3 min em cada uma de duas mudanças de etanol a 95%, e, em seguida, lavar as lâminas duas vezes em PBS durante 2-3 min para cada mudança de solução.
   4. Incubar as lâminas para 18-48 h em uma mistura 1: 1 de hematoxilina de Gill e modificado Harris hematoxilina.
   5. Lavam-se as lâminas durante 2 min em cada um dos cinco mudas de água destilada, e desidratar as lâminas em seguida por incubação durante 2-3 min em cada uma de duas mudanças de etanol a 95%, seguido de 2-3 min em cada uma de duas mudanças de 100% etanol.
   6. Limpar as lâminas através da sua incubação durante 2 min em cada uma de quatro mudanças de xileno.
   7. Montar as lâminas com meio de montagem claras e adicionar uma lamela sem bolhas de introdução, o que irá dificultar a análise posterior.
2. Aquisição de imagem Randomized:
   1. Adquirir imagens em preto e branco como arquivo TIFFs usando um microscópio, um objectivo de 20 X, e uma câmera e um software que pode adquirir imagens digitais de alta qualidade.
   2. Capturar ~ 20-30 imagens (X 200) por ampliação do mouse de forma randomizada, com o observador cego à condição experimental, evitando áreas sub-inflado do pulmão.
   3. Tape um micro-slide campo-finder para o slide. O localizador de campo tem uma grelha contendo uma série de quadrados que estão marcadas com uma letra (na direcção vertical) e um número (na direcção horizontal) e cada quadrado tem uma cruz (+) no centro e é identificado por uma letra e número (por exemplo, A1, A2, ...... Z25).
   4. Use um campo aleatório planilha Excel Generator para selecionar aleatoriamente um quadrado para captura de imagem. Para criar uma carta aleatória, digite EFGHJKLMNPQRSTU na célula B1 na planilha (o pesquisador pode ajustar esse intervalo de letras para cobrir a gama de quadrados identificados por uma letra que se sobrepõem os pulmões). Em seguida, adicione a fórmula [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] para a célula C1 para selecionar aleatoriamente uma carta em C1. Copie e cole em C1 C2, C3, C4 et cetera para gerar uma coluna de letras aleatórias.
   5. Para criar um número aleatório na coluna adjacente, escreva a fórmula = ALEATÓRIOENTRE (5,25) em D1 (5-25 em que é a gama típica de tecido na lâmina). Opcionalmente, ajustar esta gama para cobrir a gama de quadrados identificados por um número que se sobrepõem os pulmões.
   6. Copiar e colar D1 em D2, D3, D4 et cetera para gerar uma coluna de números aleatórios ao lado dessa letras aleatórias que contêm. Assim, cada linha contém um par de cartas geradas aleatoriamente e números correspondentes às etiquetas nas praças do campo-finder (por exemplo, E17, H24 ....).
   7. Colocar a lâmina no microscópio. Usando a objetiva do microscópio 4X encontrar o quadrado correspondente no slide campo localizador (por exemplo, E17, H24 ...) e coloque esta praça no centro do campo do microscópio.
   8. Alinhar o centro da microscópicacampo com o "+" no centro da praça selecionado. Retire o localizador de campo, o foco no pulmão usando a objetiva do microscópio 20X e adquirir a imagem como um arquivo TIF escala de cinza. Se capas de tecido pulmonar <50% do campo microscópico, selecione o próximo quadrado gerado aleatoriamente. Repita até ~ 20-30 imagens são capturadas para cada animal. Salvar todas as imagens para cada animal em uma única pasta etiquetada com o número da etiqueta do animal para que o Relatório Excel macro para reconhecer os arquivos.

4. A morfometria para quantificação do enfisema

O protocolo usa Scion Imagem e macros personalizadas para analisar o alargamento do espaço aéreo. Scion imagem é uma versão compatível com o Windows da aplicação Imagem NIH original, que é executado sob o sistema operacional Macintosh. Scion Imagem roda em Windows XP e ainda está disponível on-line através Wikiversity.org, onde uma pesquisa por "Scion Imagem 'irá direcionar o usuário para ligações àliberação manual e beta 4.0.2 do Scion Imagem. Instalação e operação de software é descrito no manual do suplemento on-line e resumidos a seguir. A macro comprimento da corda alveolar foi adaptado a partir do macro disponível em NIH Imagem.

1. Prepare a imagem TIFF de secção do pulmão corado do Gill para análise de imagens Scion:
   1. Comece Scion imagem e carregar as macros, como indicado no suplemento online. Selecione o Aberto Brightfield Imagem [1] macro para selecionar e abrir o arquivo de imagem TIFF. Em seguida, use as ferramentas de edição de imagem para preparar a imagem para análise.
   2. Use a ferramenta pincel para forçar áreas da imagem que não são do espaço aéreo ou paredes alveolares a ser tratada como espaço aéreo ou como tecido. Por exemplo, pintar brônquios e vasos preto de modo que eles são analisados ​​como tecido. Pinte células inflamatórias (ou poeira) que ocupam espaço no branco alvéolos para que eles são analisados ​​como espaço aéreo.
   3. Selecione a cor pincel clicando o ponteiro do mouse sobre opalavras pretas ou brancas na parte inferior da janela do LUT. Em seguida, clique na ferramenta pincel. Para alterar o tamanho do pincel, clique duas vezes sobre a ferramenta pincel e digite um tamanho adequado da escova. Clique e arraste o mouse sobre a imagem para pintar estruturas da cor selecionada (ver # 1 acima).
2. Medição do comprimento da corda média do espaço aéreo
   1. Selecione a macro Chord Corpo Air [2] para medir os comprimentos do espaço aéreo de acordes.
   2. Threshold a imagem em primeiro lugar, clicando com o mouse perto do centro da imagem, em seguida, arraste o mouse para cima ou para baixo para ajustar o valor limite (um número entre 0 e 255, que é mostrado na janela de informações). Clique do rato uma segunda vez para aceitar o valor de limiar. Ajustar o limiar para fazer as paredes alveolares da mesma espessura como nas imagens originais.
      NOTA: É fundamental que o pesquisador não under-limite e, assim, criar quebras nas paredes alveolares que não existem na imagem original, que produziráartificialmente valores de comprimento alta de acordes.
   3. O programa automaticamente remove pixels individuais (pixels pretos individuais rodeados por 8 pixels brancos).
   4. em> 4.2.4. Observar uma janela que solicita que o usuário re-limite a imagem binária, continuar a macro, ou cancelar a macro. Para limiar novamente, responda Y para o prompt e selecione o botão OK.
   5. em> 4.2.5. Visualize uma janela de grade horizontal e vertical com linhas de 5 pixels apart criados por macros. O programa mede os comprimentos das linhas horizontais e verticais que se sobrepõem espaço aéreo.
   6. Salve o arquivo em qualquer pasta, mas não alterar o nome padrão de outra forma as macros Relatório Excel não vai encontrar o arquivo (o formato é o nome da imagem anexada com "CLa.txt" para o comprimento do espaço aéreo acorde.
      NOTA: Se o programa não faz medições, o valor limite pode ser muito baixa (deve ser> 1). Se isso ocorrer, o re-limiares pesquisador a imagem usando um valor maior.
   7. em> 4.2.7. Para a medição da área alveolares (além de corda comprimentos), execute o adicional [4] e [5] macros também.
   8. em> 4.2.8. Continuar até que todas as imagens tenham sido analisados.
3. Analisando os resultados usando o Excel Relatório Macros
   1. Abrir relatório Excel 20x.xls. Habilitar manualmente Macros, se necessário, dependendo da configuração de segurança padrão na versão Excel sendo usado.
   2. Observe a lista de macros na janela Macro (ver Tabela 1).
      NOTA: CL_Air_1 relata comprimento da corda dos espaços aéreos para um único animal (pasta). CL_Air_Multi relata comprimento da corda dos espaços aéreos de vários animais (pastas). AP_No_Edge_1 relata a área dos alvéolos sem contatos de borda para um único animal (pasta) .AP_No_Edge_Multi relata área dos alvéolos sem contatos de borda para vários animais (pastas). AP_With_Edge_1 relata área de alvéolos com contatos de borda para um único animal (pasta). AP_With_Edge_Multi relata área de alvéolos com borda contactos para várias pastas.
   3. Escolha o macro CL_Air_Multi para relatar medidas de comprimento da corda alveolares para várias pastas correspondentes às imagens de vários ratos. O programa relata todos os arquivos _CLa.txt nas pastas selecionadas. Omitir um arquivo _CLa.txt (quando necessário), movendo-a para uma subpasta da pasta atual ou renomear a parte _CLa.
   4. Da janela do arquivo, selecione uma pasta de cada tempo, destacando a pasta, em seguida, selecionar OK (o programa não suporta a seleção múltipla de uma só vez). À medida que cada pasta é selecionada, observá-lo na planilha. Selecione "Cancelar" ou fechar a janela do arquivo, a fim de continuar.
      NOTA: Dependendo da versão do Excel, o pesquisador pode ter que navegar de volta um nível de pasta depois de cada pasta é selecionada.
   5. Observar uma planilha separada para cada pasta, mostrando as estatísticas de cada arquivo _CLa.txt seguido de estatísticas para dados de comprimento da corda combinados de todos os arquivos _CLa.txt.
   6. Renomeie e salve a planilha. O nome de arquivo padrão é o nome da pasta pai anexado com _CLa.xls. Feche a planilha antes de selecionar outra macro.

Reformas 5. Pequeno Airway

1. Coloração e aquisição de imagem
   1. Mancha secções de pulmão com o tricrômico de Masson, utilizando um kit comercial e siga as instruções do fabricante.
   2. Capturar imagens de todas as vias aéreas nos pulmões que podem ser acomodados por completo (incluindo a camada de azul fora da via aérea que é a camada de proteínas de ECM que são depositados) dentro de uma área de imagem utilizando a objectiva de 20X sobre o microscópio.
      NOTA: maior vias aéreas não estão associados com o aumento da deposição de proteínas de ECM em ratinhos CS-expostos.
   3. Salve as imagens em cores como arquivos JPEG.
2. A análise das imagens: Abra o arquivo de imagemno programa de software de análise de imagem.
   1. Abra e nomeie o arquivo de log para registrar as medições.
   2. Selecione uma ferramenta de desenho de linha. Desenhar 4 linhas que atravessam o lúmen da via aérea (o diâmetro interno) para medir o tamanho da via aérea e incluir apenas aqueles vias aéreas tendo o tamanho desejado na análise. Em seguida, desenhar linhas igualmente espaçadas 12 (na posição nas vias aéreas correspondente aos números de um relógio) que se estende a partir da aresta da camada adventícia da via aérea de encosto para a extremidade da região azul-coradas rodeado via aérea para medir a espessura da camada de proteínas de ECM depositados fora das vias respiratórias (Figura 5). Evite áreas onde as vias aéreas interage com outras vias aéreas ou vasos de medição.
   3. Primeiro registro de todas as linhas internas de diâmetro no arquivo de log, e depois gravar as 12 linhas que medem a espessura da camada de ECM azul ao redor das vias aéreas.
   4. Feche a imagem em seguida, abra a imagem seguinte.
   <li> Repita essas etapas até que todas as imagens para o animal ter sido registrado em uma pasta.
   5. Comece com a etapa 5.2 para a próxima pasta que contém as imagens capturadas em secções de pulmão a partir da próxima animal. Saia do programa após a análise de todas as vias aéreas em secções de pulmão a partir de todos os animais do experimento.
   6. Digite os quatro medições de diâmetro interno e as medições da espessura da camada de proteína 12 ECM registradas para cada via aérea para cada rato nos ficheiros de registo de dados em uma planilha do Excel. Em média, as medições da espessura da camada de diâmetro e proteína ECM para cada animal.
   7. Converter as medidas de pixels para microns.
   8. Grupo das vias aéreas, de acordo com o seu tamanho de diâmetro interno (por exemplo., 300-399 mm, 400-499 mm etc.) e comparar ECM medições da espessura da camada de proteína ao redor das vias aéreas com tamanhos semelhantes, para o ar contra os ratos expostos à fumaça (eg., vias aéreas com um diâmetro de 300-899 mm;
   9. Se necessário, os cortes de pulmão imunocoloração para proteínas individuais (incluindo colágenos intersticiais e proteína da membrana basal) e realizar uma análise semelhante para quantificar a deposição de proteínas de interesse, utilizando este método.

Representative Results

Este protocolo começa com a exposição de todo o organismo de camundongos para CS. Supervisão e manutenção do dispositivo e monitoramento de TPM adequada conta garantir exposições de fumaça consistentes (Figura 1). É importante que o investigador se pratica a técnica de insuflação pulmonar usando o dispositivo de insuflação

Este protocolo começa com a exposição de todo o organismo de camundongos para CS. Supervisão e manutenção do dispositivo e monitoramento de TPM adequada conta garantir exposições de fumaça consistentes (Figura 1). É importante que as práticas investigador a técnica de insuflação pulmonar usando o dispositivo de insuflação (Figura 2) e cuidadosamente remove o pulmão após a inflação, de modo a obter secções de pulmão bem insuflados para análise precisa de alargamento do espaço aéreo. A Figura 3A mostra um pulmão bem insuflado enquanto a Figura 3B mostra um pulmão mal inflado. A Figura 3C mostra uma imagem de uma secção do pulmão inflado preparado para o limiar step (macrófagos nos espaços alveolares são pintadas de branco, e os vasos e brônquios são pintados de preto para gerar. O passo limiar cria uma imagem binária em que todos os pixels no espaço alveolar são brancos e todos os pixels em áreas do pulmão que não são alvéolos são negros (Figura 3D). A Figura 3E e 3F mostram o acorde alveolar vertical e horizontal que os comprimentos de macros gerar, respectivamente.

Testes de função pulmonar mostram mudanças modestas (e não estatisticamente significativas) deixou no volume de pressão (PV) laços refletindo perda modesta de recolhimento elástico do pulmão consistente com o enfisema leve, que se desenvolve em camundongos C57BL / 6 WT expostos ao CS por 6 meses ( Figura 4A). Mudanças significativas esquerda nas ansas PV são observados somente em estirpes de murinos que são muito sensíveis aos efeitos da CS ou em ratinhos alvo de gene CS-expostas com um fenótipo enfisema mais grave do que CS-expostos ratinhos C57BL / 6 WT.

Figoure 5 mostra imagens representativas cortes de pulmão manchada de Masson de camundongos C57BL / 6 WT expostos ao ar (Figura 5A) ou CS (Figura 5B) por 6 meses que ilustram aumentos na deposição de proteína ECM cerca de pequenas vias aéreas nos animais CS-expostas. Figura 5C ilustra a forma como um programa de software de análise de imagem quantifica a deposição de proteína da MEC redor das vias aéreas com o diâmetro interno desejado. A Figura 5D mostra a deposição de análise de proteína da MEC redor das vias aéreas com um diâmetro de 300-899 mm no CS-expostos ratinhos C57BL / 6 WT.

Figura 1. Um desenho do sistema de exposição de cigarro a todo o organismo. Um dispositivo de exposição ao fumo está ligado a uma câmara de exposição ao fumo. O fumo é retirado da câmara de recolha lateral-stream e fumaça é retiradoos cigarros por a bomba, e ambas as amostras de fumo são misturadas e diluídas com o ar ambiente na câmara de mistura e diluição (esquerda), e em seguida o fumo flui para a câmara de exposição. O pesquisador coloca ratos nas gaiolas na câmara de exposição (à direita); os ratos são capazes de mover-se livremente em suas gaiolas, e ter acesso a alimentos e água para a duração da exposição à fumaça.

Figura 2. A inflação de pulmões murinos. O pesquisador enche uma garrafa com PBS estéril, vedação com uma rolha de borracha, e inverte-a e fixa-o a uma distância de 25 cm acima do coração do animal utilizando um suporte anelar. Um conjunto de doação intravenosa entrega a PBS para os pulmões através da cânula traqueal. Uma pipeta de corte para baixo sorológico é inserida através da rolha de borracha e isto permite que o ar para dentro do frasco para substituir o volume de PBS que drena para o lungs dos ratinhos por gravidade.

Figura 3. Análise do enfisema. (A) mostra uma imagem representativa de Gill's-mancha inflado secções de pulmão de ratos expostos ao ar ou CS durante 6 meses, as setas pretas indicam um navio e macrófagos alveolares. (B) mostra uma imagem representativa de um pulmão inflado sob que não é adequado para análise. (A) mostra o "antes" e (C) mostra o "depois" imagem de uma secção representativa do pulmão que o investigador se prepara para a geração de uma imagem binária. As setas pretas em (A) e (C) indicar um recipiente (que o pesquisador pinta preta em (C)) ou macrófagos alveolares (que o investigador em tintas brancas (C)). (D) < / Strong> mostra a imagem binária após o pesquisador realiza a etapa limite. (E) e (F) mostram o acorde alveolar horizontal e vertical comprimentos que o investigador se gera, respectivamente. Ampliação de todas as imagens são x 200. Escala barra representa 400 um é mostrado em (A).

Figura 4. curvas alveolar comprimento da corda e pressão-volume. (A) mostra uma análise típica de comprimentos de acorde alveolares em ratos C57BL / 6 WT expostos ao ar (n = 13) ou CS (n = 24) durante 6 meses. O asterisco indica p <0,001. (B) mostra ciclos típicos PV realizadas em ratinhos C57BL / 6 WT expostos ao ar (n = 13) ou CS (n = 14) durante 6 meses. Os dados são expressos como média + EPM.

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Figura 5. remodelação das pequenas vias aéreas (SAR) avaliação. (A) e (B) mostra imagens representativas de secções de pulmão de Masson-coradas com tricromo de ratinhos C57BL / 6 WT expostos ao ar (A) ou CS (B) durante 6 meses. (C) mostra como o software de análise de imagem SAR análises em ratos CS-expostos. (D) mostra valores típicos da espessura da camada de proteína da matriz extracelular depositada em torno de pequenas vias aéreas com um diâmetro de 300-899 m em ratinhos C57BL / 6 WT expostos ao ar (n = 11) ou CS (n = 16) para 6 meses. Os dados são expressos como média + EPM e asterisco indica p <0,05.

Barras de escala são mostrados nas imagens de cada seção de pulmão.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032