Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

Introduction

El uso de modelos animales para estudiar la EPOC es un reto porque ningún modelo puede replicar perfectamente todas las características de la enfermedad humana ^(2). La mayoría de los investigadores utilizan ratones para modelar la EPOC debido a las similitudes entre los ratones y los seres humanos en sus pulmonares fisiología, patología, genética y metabolitos. Además, los ratones son relativamente baratos para estudiar, y tanto el enfisema y la remodelación de la vía aérea pequeña desarrollan dentro de los 6 meses de exposición CS ^(5,7-9).

Cigarrillos EPOC inducida por el humo: Varios métodos pueden inducir la EPOC en ratones. La mayoría de los investigadores exponen ratones para CS, que es el principal factor etiológico para la EPOC humano. La exposición CS durante 6 meses causa el desarrollo de enfisema y la remodelación de la vía aérea pequeña (SAR) en ratones, pero la gravedad de la enfermedad que es inducida varía dependiendo de la cepa murina estudiado. Por ejemplo, los ratones NZWLacZ son resistentes al desarrollo de enfisema inducido-CS mientras que AKR / J ratones son extremely sensible ^(10). La mayoría de los investigadores estudian C57BL / 6 ratones de la cepa en el modelo de exposición CS como muchos ratones de genes dirigidos están disponibles en esta cepa. Después de 6 meses de exposición CS, el enfisema y la fibrosis de la pequeña vía aérea a desarrollar en el tipo salvaje (WT) C57BL / 6 ratones, y ambas lesiones son relativamente leves en gravedad ^(5,10). Los investigadores utilizan dos tipos de exposición CS: sólo de la nariz y de todo el cuerpo exposiciones. Las principales desventajas de la única nariz técnica de exposición son que: 1) es un método más mano de obra; y 2) los ratones tienen que ser contenido en pequeñas cámaras que pueden inducir una respuesta de estrés y la hipertermia en los animales ^(11). La principal desventaja de exposición de cuerpo entero (que se describe en la presente memoria) es que los animales pueden ingerir (así como inhalar) nicotina y alquitrán productos cuando limpian su piel. Los ratones expuestos a todo el cuerpo CS también tienen niveles de carboxihemoglobina inferiores y pérdida de peso corporal reducido en comparación con los animales expuestos a la nariz de sólo CS ^(12).

prueba de función pulmonar (PFT): Las medidas de la distensibilidad pulmonar y elastancia suelen ser similares en ratones C57BL / 6 de tipo salvaje (WT) ratones expuestos al aire o CS durante 6 meses debido al enfisema relativamente leve que se desarrolla cuando este cepa se expone a CS ^(10). Sin embargo, cuando la destrucción enfisematosa es más grave, el aumento de la distensibilidad pulmonar y desplazamientos a la izquierda en la presión-volumen (PV) fluyen bucles pueden ser detectados. Este último se puede observar, por ejemplo, en las cepas murinas que son más susceptibles a los efectos de CS ^(10), en / 6 ratones de cepas de genes dirigidos expuestas-CS C57BL que tienen un tipo enfisema más severo que C57BL / 6 ratones WT ^(13), o en ratones expuestos-CS sometidos a cambios ambientales que las hacen más susceptibles a los efectos de CS ^(14). Este protocolo utiliza un pequeño ventilador para animales para medir la reducción en el retroceso elástico del pulmón (aumento de la distensibilidad pulmonar cuasiestático [Cst] y las reducciones en el tejidoelastancia [H]), los bucles de flujo de PV, y los cambios en la resistencia de las vías respiratorias y el tejido en ratones anestesiados ^(15,16).

Medidas de enfisema pulmonar: Análisis del enfisema en expuestos al CS C56BL / 6 ratones cepa es un reto, ya que su distribución es espacialmente heterogénea. Varios métodos diferentes cuantificar ampliación del espacio aéreo en los ratones. El primer método utilizado fue la media de intercepción lineal (L _m) ^(17). Sin embargo, el método L _m es un proceso lento, manual que puede no captar la heterogeneidad de la enfermedad (a menos que todas las secciones del pulmón se seleccionan aleatoriamente muestras) y su uso por lo tanto, puede introducir un sesgo de observador en el análisis. El índice de destrucción [DI, ^(18)] también cuantifica ampliación del espacio aéreo utilizando una lámina transparente con 50 puntos igualmente distribuidos colocados sobre una imagen digitalizada impresa de un hematoxilina y eosina sección de pulmón manchados. El método PI puntajes de la zona que rodea a cada punto de acacuerdo con el grado en que se destruyen los conductos alveolares y paredes alveolares dentro de esta área. La principal desventaja del método de DI es que es mucho tiempo y no más exacto que otros métodos ^(19,20).

Este protocolo mide significan longitud de la cuerda alveolar y zona alveolar de pulmón secciones incluidas en parafina teñidos con tinción de Gill. Software Morfometría convierte las imágenes de secciones de pulmón a imágenes binarias (en la que el tejido es de color blanco y el espacio aéreo es negro), y luego se superpone una rejilla uniforme de líneas horizontales y verticales (acordes) y el software entonces cuantifica la duración de cada acorde dentro de las áreas identificadas por software como espacio aéreo. Usando este método, es posible medir el tamaño de los alvéolos en todas las partes del pulmón de una manera estandarizada y relativamente automatizado ^(21).

La remodelación de la vía aérea pequeña (SAR): El aumento de la deposición de proteínas ECM (especialmente intersticiosl colágenos) alrededor de las pequeñas vías aéreas se produce en los animales expuestos al CS y contribuye a la obstrucción al flujo aéreo. Los investigadores no estudian SAR en modelos animales de EPOC con tanta frecuencia como el desarrollo de enfisema ^(22). Para cuantificar SAR en ratones expuestos-CS, este protocolo utiliza el software de análisis de imagen para medir el grosor de la capa de proteínas ECM que se deposita alrededor de las pequeñas vías respiratorias (vías respiratorias que tiene un diámetro medio entre 300 y 899 m) en secciones de pulmón incluidos en parafina teñidas con tricrómico de Masson.

Protocol

El protocolo tiene ~ 25 semanas en completarse. El protocolo expuso a ratones a la atmósfera ni fumar durante 24 semanas. Al final de las exposiciones de humo, las medidas del protocolo de la función pulmonar en los ratones, y los pulmones se inflan a una presión fija, fijos, y se retiran en el mismo día. Se necesita más tiempo para el investigador para empotrar, cortar y teñir las secciones de pulmón (2-3 días), y la captura y el análisis de las imágenes (2-4 días, dependiendo del número de animales estudiados). Este protocolo también se puede utilizar para medir ampliación del espacio aéreo relacionada con la edad en ratones.

Todos los procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el empleo en el Hospital Brigham y de Mujeres / Escuela de Medicina de Harvard.

1. Whole-Body El humo del cigarrillo exposición

1. Exponga ratones fumar en un dispositivo de la exposición al humo de todo el cuerpo (ver Figura 1) instalado en una campana de humos.
   NOTA: El dispositivo se carga automáticamente cigarrillos de investigación en la rueda, lERECHOS los cigarrillos, y recoge el humo de corriente lateral de la cámara de recogida de humo de corriente lateral, y expulsa los cigarrillos. La máquina combina humo de corriente lateral con humo de la corriente principal extraído del cigarrillo por una bomba para crear una mezcla de la corriente principal y de corriente lateral de humo. El ventilador en la cámara de mezcla y diluir el humo se mezcla con el aire ambiente y acciona el humo en cámaras de exposición.
2. Coloque las jaulas con los ratones sin las tapas de jaula removidos (Figura 1) en la cámara de exposición. Permita que los ratones para moverse libremente alrededor de sus jaulas y tener acceso a alimentos y agua para la duración de la exposición al humo (~ 1.75 h).
3. Coloque un cubo lleno de agua debajo de la cámara de cigarrillos para extinguir los cigarrillos expulsado. Ejecutar etanol (100%) a través de la bomba y conectarlo al dispositivo. Encienda el microprocesador de elementos del dispositivo, lo que inicia la carga automática de los cigarrillos, inflamación en la bomba, y el calentamiento del ligh cigarrilloalambre ting.
4. Las cargas de dispositivos, luces y fuma 10 cigarrillos a la vez y luego expulsa los cigarrillos utilizados y los reemplaza con un nuevo lote de 10 cigarrillos y repite este proceso. Cada ciclo tiene 9 min.
5. Aclimatarse ratones de fumar mediante la exposición al humo de 20 cigarrillos en el primer día, 40 cigarrillos en el segundo día, 60 cigarrillos en el tercer día, 80 cigarrillos en el cuarto día, y 100 cigarrillos en el quinto día. Durante el período de aclimatación, observar a los ratones con cuidado en busca de signos de angustia.
6. Después de 5 días de aclimatación, exponer a los ratones a 100 cigarrillos al día, 5 o 6 días-por-semana durante 6 meses. Se necesita este nivel de exposición al humo de inducir relativamente modesta ampliación del espacio aéreo en C57BL / 6 ratones de tipo salvaje (23,24). Exponer los ratones de control a la atmósfera ambiente durante 6 meses. Pesar los ratones antes de la aclimatación humo y después semanalmente para evaluar el efecto de la exposición al humo en el peso corporal.
7. Monitorear suspendidas totales particuladomateria (TSPM) en las cámaras de exposición después de los primeros 60 cigarrillos han fumado:
   1. Pesar un papel de filtro y colocarlo en un soporte de filtro en línea que está conectada a un sampler filtro cronometrada y medidor de gas seco. El muestreador filtro cronometrada extrae el aire de la cámara de la exposición a través del papel de filtro y las medidas de metro de gas del flujo de aire durante el muestreo.
      NOTA: El filtro atrapa partículas de hasta 20 m ³ de aire de la cámara de exposición pasa a través del filtro (medido en el medidor de gas seco).
   2. Calcular el recuento de TPM como el cambio en el peso del filtro antes y después del muestreo (en mg) por m ³ de aire. Los recuentos de TPM ideales son entre 150 y 200 mg / m ^3.
8. Después de todos los cigarrillos han fumado, eliminar las jaulas de la cámara de la exposición y observar a los ratones para detectar signos de sufrimiento durante 20 minutos.
9. Limpie la bomba con etanol al 100% después de cada uso, y limpiar todos los puertos y varillas en la máquina dos veces por semana para promovercirculación del aire y evitar la acumulación de alquitrán.

2. Prueba de función pulmonar (PFP) y la inflación de pulmón

1. Al final de las exposiciones, anestesiar a cada ratón mediante la entrega de un cóctel de ketamina (100 mg / kg), xilazina (10 mg / kg) y acepromacina (3 mg / kg) por vía intraperitoneal en 200 l de solución salina (USP grado) y usar ungüento veterinario en los ojos para evitar que se sequen. Espere hasta que el animal se encuentra en un plano quirúrgico de anestesia, evalúa usando el método del dedo del pie-pinch.
2. Afeitarse la piel anterior a la tráquea, y desinfectar la zona con una solución que contiene yodo seguido por etanol. Hacer una incisión en la línea media a través de la piel y tejido subcutáneo anterior a la tráquea utilizando tijeras autoclave, y separar los músculos esternotiroideo con fórceps para exponer la tráquea.
3. Pasar una longitud de 2 pulgadas de sutura de seda posterior a la tráquea, hacer una traqueotomía en la cara anterior de la tráquea con autoclave ttijeras Racheal, insertar una cánula traqueal (18 G) en la traqueotomía, y seguro en su lugar con la sutura.
4. Conecte el ratón a la Y-tubo del adaptador del ventilador mecánico a través de la cánula traqueal, e iniciar la ventilación mecánica usando un volumen corriente de 10 ml / kg y una frecuencia respiratoria de 150 respiraciones / min.
   NOTA: Es importante en esta etapa para garantizar que el ratón se anestesia adecuada para obtener mediciones precisas PFT. Re-dosificar el ratón con anestésicos si el animal no está en un plano quirúrgico de anestesia. Toda la duración de todas las maniobras PFT es de aproximadamente 7,5 min, por lo que no suele ser necesario volver a administrar a los ratones con anestésicos una vez se ha logrado un plano quirúrgico de anestesia. El tiempo total desde la inducción de la anestesia a la eutanasia es de ~ 20 minutos.
5. Inflar los pulmones hasta la capacidad pulmonar total (TLC) 3 veces para una historia de volumen para medir la capacidad inspiratoria (IC) y reducir la atelectasis de los pulmones. A continuación, perform la frecuencia de oscilación forzada maniobra individual (SnapShot-150 perturbación) y evaluar la resistencia dinámica (R), elastancia (ERS) y el cumplimiento (CRS) del sistema respiratorio, seguido de la frecuencia de banda ancha forzada maniobra de oscilación (Quick Prime-3 perturbación ) y medir la resistencia de la vía aérea central (R _n), la resistencia del tejido (G), la elastancia del tejido (H) y la relación G / N (). Por último, el historial de cumplimiento-quasic estática (C _st) durante las maniobras de flujo de volumen-presión.
6. Repita cada una de estas maniobras de cinco veces (o llevar a cabo medidas adicionales hasta obtener resultados apropiados) e inflar a TLC tres veces entre cada serie repetida de mediciones. El valor medio de cada parámetro para cada ratón.
7. Retire el ratón del ventilador mecánico, y la eutanasia con CO ₂ narcosis seguido por dislocación cervical [este método de eutanasia es aprobado por nuestro Cuidado de Animales institucional y el empleo]. Corte el diafragma, open el tórax en la línea media, y retire las costillas anteriores para exponer los pulmones. Diseccionar la piel y el tejido subcutáneo alrededor de la tráquea y pasar una segunda longitud de 2 pulgadas de sutura de seda posterior a la tráquea.
8. Prepare el equipo para la inflación de pulmón (Figura 2):
   1. Llenar un matraz de 500 ml Erlenmeyer ¾ de su capacidad con PBS estéril, sellarlo con un tapón de goma, invertirlo, y suspenderlo en un soporte de anillo (tal que el menisco del pH 7,4 tampón fosfato salino (PBS) es de 25 cm por encima de el corazón del ratón).
   2. Inserte un extremo de un dar intravenosa establecido en el PBS en el matraz a través del tapón de goma. Inserte una longitud de 6 pulgadas de una pipeta serológica de plástico a través del tapón de goma de manera que su apertura se encuentra por encima del menisco de la PBS para permitir que el aire para reemplazar PBS dejando el matraz.
   3. Abra la válvula del conjunto dar y ejecutar PBS aunque el sistema para hacer salir el aire de la serie dando.
9. Conecte el intravenous dar conjunto a la cánula traqueal, abrir la válvula, y permitir que fluya PBS en los pulmones por la gravedad hasta que los pulmones se inflan completamente. Cierre la válvula, atar tráquea utilizando el distal sutura quirúrgica a la cánula traqueal, y retirar la cánula.
10. Levantar la tráquea con fórceps, y cortar la tráquea proximal del nudo, y diseccionar el tejido conectivo posterior a la tráquea y los pulmones. Retire con cuidado los pulmones (sin mellar ellos), y coloque los pulmones en un tubo que contiene 10% de formalina salina tamponada. Fijar los pulmones O / N a temperatura ambiente, y al día siguiente, lavarlos con PBS dos veces.
11. Insertar los pulmones en parafina, corte 5 micras de espesor secciones, y luego teñir las secciones con tinción de Gill como se indica a continuación.

3. El enfisema

1. Tinción de Gill de pulmón secciones incluidas en parafina
   1. Colocar los portaobjetos en una rejilla de plástico y los incuban a 70 ° C durante 20-30 minutos en un horno.
   2. De-pariffinize las diapositivasmediante su incubación durante 2 min en cada uno de cuatro cambios de xileno.
   3. Rehidratar las diapositivas mediante su incubación durante 2-3 min en cada uno de dos cambios de etanol al 100%, seguido de 2-3 min en cada uno de dos cambios de etanol 95%, y luego lavar los portaobjetos dos veces en PBS durante 2-3 min para cada cambio de solución.
   4. Incubar los portaobjetos durante 18 a 48 h en una mezcla 1: 1 de hematoxilina de Gill y modificado hematoxilina de Harris.
   5. Lavar los portaobjetos durante 2 min en cada uno de cinco cambios de agua destilada, y se deshidratan las diapositivas incubando a continuación durante 2-3 min en cada uno de dos cambios de etanol 95%, seguido de 2-3 min en cada uno de 2 cambios de 100% etanol.
   6. Desactive las diapositivas mediante su incubación durante 2 min en cada uno de cuatro cambios de xileno.
   7. Montar las diapositivas con los medios de montaje claras y añadir un cubreobjetos sin la introducción de burbujas, que pueden frenar su posterior análisis.
2. Adquisición de imágenes aleatorio:
   1. Adquirir imágenes en blanco y negro como archivo TIFFs utilizando un microscopio, un objetivo 20 X, y una cámara y software que puede adquirir imágenes digitales de alta calidad.
   2. Captura ~ 20-30 imágenes (X 200 aumentos) por ratón de una manera al azar y con el observador cegado a la condición experimental, evitando las zonas insuficientemente inflados del pulmón.
   3. Pegue un micro-slide campo del buscador en la diapositiva. El buscador de campo tiene una cuadrícula que contiene una serie de cuadrados que están marcados con una letra (en la dirección vertical) y un número (en la dirección horizontal) y cada cuadrado tiene una cruz (+) en el centro y está identificado por una letra y el número (por ejemplo, A1, A2, ...... Z25).
   4. Utilice un campo generador aleatorio hoja de cálculo Excel para seleccionar al azar una plaza para la captura de imágenes. Para crear una carta al azar, introduzca EFGHJKLMNPQRSTU en la celda B1 en la hoja de cálculo (el investigador puede ajustar este rango de letras para cubrir el rango de casillas identificadas por una letra que recubren los pulmones). A continuación, agregue la fórmula [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] a la celda C1 para seleccionar al azar una carta en C1. Copiar y pegar C1 a C2, C3, C4 et cetera para generar una columna de letras al azar.
   5. Para crear un número aleatorio en la columna adyacente, escriba la fórmula = RANDBETWEEN (5,25) en D1 (donde 5.25 es el rango típico de tejido en la diapositiva). Opcionalmente, ajuste este rango para cubrir el rango de casillas identificadas por un número que recubren los pulmones.
   6. Copiar y pegar en D1 D2, D3, D4 etcétera para generar una columna de números aleatorios junto a letras al azar que contienen. Por lo tanto, cada fila contiene un par de letras y números generados al azar correspondientes a las etiquetas de las plazas en el campo del buscador (por ejemplo, E17, H24 ....).
   7. Colocar el portaobjetos en el microscopio. Utilizando el objetivo del microscopio 4X encontrar la casilla correspondiente en la diapositiva buscador de campo (por ejemplo, E17, H24 ...) y coloque esta plaza en el centro del campo del microscopio.
   8. Alinear el centro de la microscópicacampo con el signo "+" en el centro de la plaza seleccionada. Retire el buscador de campo, se centran en el pulmón con el objetivo de microscopio 20X y adquirir la imagen como un archivo TIF de escala de grises. Si las tapas de tejido pulmonar <50% del campo microscópico, seleccione la siguiente casilla generada de forma aleatoria. Repita hasta ~ son capturados 20-30 imágenes para cada animal. Guardar todas las imágenes para cada animal en una sola carpeta rotulada con el número de la etiqueta del animal para que el Informe Macro de Excel para reconocer los archivos.

4. Morfometría Para Medir El enfisema

El protocolo utiliza Scion Image y macros personalizadas para analizar la ampliación del espacio aéreo. Scion Image es una versión compatible con Windows de la aplicación original de imagen NIH que corre bajo el sistema operativo Macintosh. Scion Image corre bajo Windows XP y que está disponible en línea a través Wikiversity.org, donde una búsqueda de "Scion Image 'dirigirá al usuario de una paradadesbloqueo manual y beta 4.0.2 de Scion Image. La operación de instalación y el software se detalla en el manual del suplemento en línea y se resume a continuación. La macro longitud de la cuerda alveolar es una adaptación de la macro disponible en NIH Image.

1. Preparar la imagen TIFF de la sección de pulmón teñidas del Gill para el análisis de imágenes Scion:
   1. Iniciar Scion Image y cargar las macros como se indica en el suplemento en línea. Seleccione la imagen abierta Brightfield [1] macro para seleccionar y abrir el archivo de imagen TIFF. A continuación, utilice las herramientas de edición de imagen para preparar la imagen para su análisis.
   2. Utilice la herramienta de pincel para obligar a las áreas de imagen que no son del espacio aéreo o paredes alveolares ser tratados ya sea como espacio aéreo o como tejido. Por ejemplo, la pintura de los bronquios y los vasos negro de modo que se analizan como el tejido. Pinte las células inflamatorias (o polvo) que ocupan espacio en el blanco alvéolos para que se analizan como espacio aéreo.
   3. Seleccione el color del pincel de pintura haciendo clic en el puntero del ratón sobre elpalabras negras o blancas en la parte inferior de la ventana LUT. A continuación, haga clic en la herramienta de pincel. Para cambiar el tamaño del pincel, haga doble clic en la herramienta de pincel y escriba un tamaño de pincel adecuado. Haga clic y arrastre el cursor sobre la imagen para pintar estructuras del color seleccionado (vea el # 1 arriba).
2. Medición de longitud media cuerda del espacio aéreo
   1. Seleccione la Longitud de cuerda macro del aire [2] para medir las longitudes de cuerda espacio aéreo.
   2. Umbral de la imagen en primer lugar, haga clic en el ratón cerca del centro de la imagen a continuación, arrastre el ratón hacia arriba o hacia abajo para ajustar el valor umbral (un número entre 0 y 255, que se muestra en la ventana de información). Haga clic en el ratón una segunda vez para aceptar el valor umbral. Ajustar el umbral para hacer que las paredes alveolares el mismo grosor que en las imágenes originales.
      NOTA: Es fundamental que el investigador no bajo umbral y así crear rupturas en las paredes alveolares que no existen en la imagen original que produciráartificialmente los valores de longitud de alta de acordes.
   3. El programa elimina automáticamente píxeles individuales (píxeles negros individuales rodeadas de 8 píxeles blancos).
   4. em> 4.2.4. Observar una ventana que pide al usuario que vuelva a umbral de la imagen binaria, continuar la macro, o cancelar la macro. Para umbral de nuevo, conteste Y para el símbolo y seleccione el botón Aceptar.
   5. em> 4.2.5. Visualizar una ventana de rejilla horizontal y vertical con líneas 5 píxeles de distancia creados por macros. El programa mide las longitudes de líneas horizontales y verticales que se superponen espacio aéreo.
   6. Guarde el archivo en cualquier carpeta, pero no cambian el nombre por defecto de lo contrario las macros de Excel informe no se encuentran en el archivo (el formato es el nombre de la imagen que tiene "CLa.txt" de longitud de la cuerda del espacio aéreo.
      NOTA: Si el programa no hace mediciones, el valor umbral puede ser demasiado baja (debe ser> 1). Si esto ocurre, los investigadores re-umbrales de la imagen con un valor más alto.
   7. em> 4.2.7. Para mediciones de área alveolares (además de acorde longitudes), ejecute el adicional [4] y [5] macros también.
   8. em> 4.2.8. Continúe hasta que todas las imágenes han sido analizados.
3. Analizando los resultados utilizando Excel Report Macros
   1. Abrir Excel Report 20x.xls. Habilitar manualmente Macros si es necesario, dependiendo de la configuración de seguridad por defecto en la versión de Excel que se utiliza.
   2. Observe la lista de macros en la ventana Macro (ver Tabla 1).
      NOTA: CL_Air_1 informa longitud de la cuerda de los espacios aéreos para un solo animal (carpeta). CL_Air_Multi informa longitud de la cuerda de los espacios aéreos de varios animales (carpetas). AP_No_Edge_1 informa la zona de los alvéolos sin contactos borde para un solo animal (carpeta) .AP_No_Edge_Multi informa área de los alvéolos sin contactos borde de varios animales (carpetas). AP_With_Edge_1 informa área de los alvéolos con contactos de borde para un solo animal (carpeta). AP_With_Edge_Multi informa área de los alvéolos con el borde contactos para varias carpetas.
   3. Seleccione la macro CL_Air_Multi reportar mediciones de longitud acorde alveolares para varias carpetas correspondientes a las imágenes de varios ratones. El programa informa de todos los archivos _CLa.txt de las carpetas seleccionadas. Omita un archivo _CLa.txt (según sea necesario) moviéndolo a una subcarpeta de la carpeta actual o cambiar el nombre de la parte _CLa.
   4. Desde la ventana de archivo, seleccione una carpeta a la vez, poniendo de relieve la carpeta luego seleccionando OK (el programa no admite la selección múltiple a la vez). Al seleccionar cada carpeta, observarlo en la hoja de trabajo. Seleccione "Cancelar" o cerrar la ventana de archivos con el fin de continuar.
      NOTA: En función de la versión de Excel, el investigador puede tener que navegar de vuelta nivel en las carpetas después de seleccionar cada carpeta.
   5. Observar una hoja separada para cada carpeta, que muestra las estadísticas de cada archivo _CLa.txt seguido de estadísticas para los datos de longitud de cuerda combinados de todos los archivos _CLa.txt.
   6. Cambiar el nombre y guardar la hoja de cálculo. El nombre de archivo predeterminado es el nombre de la carpeta principal adjunto con _CLa.xls. Cierre la hoja de cálculo antes de seleccionar otra macro.

5. La pequeña vía aérea Remodelación

1. Tinción y adquisición de imágenes
   1. Teñir cortes de pulmón con tricrómico de Masson utilizando un kit comercial y siga las instrucciones del fabricante.
   2. Captura de imágenes de todas las vías respiratorias en ambos pulmones que pueden ser acomodados por completo (incluyendo la capa azul fuera de la vía respiratoria que es la capa de proteínas ECM que se depositan) dentro de un área de imagen utilizando el objetivo 20X en el microscopio.
      NOTA: Ampliar las vías respiratorias no están asociados con un aumento de la deposición de proteínas ECM en ratones expuestos al CS.
   3. Guarde las imágenes en color como archivos JPEG.
2. Análisis de imágenes: Abra el archivo de imagenen el programa de software de análisis de imagen.
   1. Abra y el nombre del archivo de registro para registrar las mediciones.
   2. Seleccione una herramienta de dibujo de líneas. Dibuje 4 líneas que cruzan el lumen de las vías respiratorias (el diámetro interno) para medir el tamaño de la vía aérea y sólo incluyen las vías respiratorias que tiene el tamaño deseado en el análisis. A continuación, dibuje 12 líneas igualmente espaciadas (en la posición en la vía aérea correspondiente a los números de un reloj) que se extiende desde el borde de la capa adventicia de tope de la vía aérea hacia el borde de la región teñida de azul rodeada la vía respiratoria para medir el espesor de la capa de proteínas ECM depositados fuera de la vía aérea (Figura 5). Evite las áreas donde la vía aérea interactúa con otras vías respiratorias o los vasos de medida.
   3. Primer registro de todas las líneas de diámetro interno en el archivo de registro y, a continuación, registrar las 12 líneas que miden el espesor de la capa de ECM azul alrededor de las vías respiratorias.
   4. Cierre la imagen a continuación, abra la siguiente imagen.
   <li> Repita estos pasos hasta que todas las imágenes para que el animal se han registrado en una carpeta.
   5. Comience en el paso 5.2 para la siguiente carpeta que contiene las imágenes capturadas en secciones de pulmón de la siguiente animal. Salga del programa después de completar el análisis de todas las vías aéreas en secciones de pulmón de todos los animales en el experimento.
   6. Introduzca las 4 mediciones de diámetro interno y las mediciones de espesores de capa de proteínas ECM 12 registrados para cada vía aérea para cada ratón en los archivos de registro de datos en una hoja de cálculo Excel. La media de las mediciones de espesores de capa de diámetro y proteínas ECM para cada animal.
   7. Convertir las mediciones de píxeles para micras.
   8. Grupo de las vías respiratorias en función de su tamaño de diámetro interno (por ejemplo., 300-399 micras, 400-499 micras etc.) y comparar ECM mediciones de espesor de capa de proteínas alrededor de las vías respiratorias que tienen tamaños similares para el aire frente a los ratones expuestos al humo (por ejemplo., vías respiratorias tienen un diámetro de 300 a 899 micras;
   9. Si es necesario, las secciones de pulmón immunostain para proteínas individuales (incluyendo colágenos intersticiales y proteínas de la membrana basal) y llevar a cabo un análisis similar para cuantificar la deposición de proteínas de interés que utilizan este método.

Representative Results

Este protocolo comienza con la exposición de todo el cuerpo de los ratones para CS. Supervisión y mantenimiento del dispositivo y seguimiento de TPM adecuada recuentos garantizar exposiciones de humo consistentes (Figura 1). Es importante que el investigador practica la técnica de la inflación pulmonar usando el dispositivo de inflado

Este protocolo comienza con la exposición de todo el cuerpo de los ratones para CS. Supervisión y mantenimiento del dispositivo y seguimiento de TPM adecuada recuentos garantizar exposiciones de humo consistentes (Figura 1). Es importante que las prácticas investigador la técnica de la inflación pulmonar usando el dispositivo de inflado (Figura 2) y cuidadosamente elimina el pulmón después de la inflación a fin de obtener secciones de pulmón así inflados por un análisis preciso de la ampliación del espacio aéreo. Figura 3A muestra un pulmón bien hinchado mientras que la figura 3B muestra un pulmón mal inflados. La Figura 3C muestra una imagen de una sección de pulmón inflado preparado para la umbralización sTEP (macrófagos en los espacios alveolares están pintadas de blanco, y los vasos y bronquios están pintados de negro para generar. El paso de umbral crea una imagen binaria en la que todos los píxeles en el espacio alveolar son blancos y todos los píxeles en áreas del pulmón que no son alvéolos son de color negro (Figura 3D). Figura 3E y 3F muestran la cuerda alveolar vertical y horizontal longitudes de que las macros generan, respectivamente.

Pruebas de función pulmonar muestran cambios modestos (y no estadísticamente significativas) dejó en el volumen de presión (PV) bucles reflejando modesta pérdida de retracción elástica del pulmón consistente con el enfisema leve que se desarrolla en C57BL / 6 ratones WT expuestos a CS por 6 meses ( Figura 4A). Cambios significativos de izquierda en los bucles PV se observan sólo en cepas murinas que son muy sensibles a los efectos de CS o en ratones con genes dirigidos expuestas-CS tienen un fenotipo enfisema más severo que C57BL / 6 ratones WT expuestas-CS.

HigoUre 5 muestra imágenes representativas secciones de pulmón tricrómico manchado de Masson de ratones C57BL / 6 ratones WT expuestas al aire (Figura 5A) o CS (Figura 5B) durante 6 meses que ilustran aumentos en ECM proteína de deposición alrededor de las pequeñas vías respiratorias en los animales expuestos-CS. La figura 5C ilustra cómo un programa de software de análisis de imagen cuantifica ECM deposición de proteína alrededor de las vías respiratorias que tiene el diámetro interno deseado. La Figura 5D muestra el análisis de proteínas ECM deposición alrededor de las vías respiratorias con un diámetro de 300 a 899 micras en ratones C57BL / 6 ratones WT expuestas-CS.

Figura 1. Una historieta de el sistema de exposición de todo el cuerpo del cigarrillo. Un dispositivo de exposición al humo está conectado a una cámara de exposición al humo. El humo se sale de la cámara de recogida de corriente lateral y el humo se extrae delos cigarrillos por la bomba, y ambas muestras de humo se mezclan y se diluye con aire ambiente en la cámara de mezcla y dilución (izquierda), y luego el humo fluye en la cámara de exposición. El investigador coloca ratones en sus jaulas en la cámara de exposición (a la derecha); ratones son capaces de moverse libremente en sus jaulas, y tener acceso a alimentos y agua para la duración de la exposición al humo.

Figura 2. La inflación de los pulmones murinos. El investigador llena un matraz con PBS estéril, lo sella con un tapón de goma, y la invierte y lo asegura una distancia de 25 cm por encima del corazón del animal con un soporte de anillo. Un conjunto entrega intravenosa proporciona la PBS a los pulmones a través de la cánula traqueal. Una pipeta serológica corte hacia abajo se inserta a través del tapón de goma y esto permite que el aire en el matraz para reemplazar el volumen de PBS que drena en el luNGS de los ratones por la gravedad.

Figura 3. Análisis de enfisema. (A) muestra una imagen representativa de Gill's-mancha infla secciones de pulmón de ratones expuestos a aire o CS durante 6 meses, las flechas negras indican un recipiente y los macrófagos alveolares. (B) muestra una imagen representativa de un pulmón poco inflados que no es adecuado para el análisis. (A) muestra el "antes" y (C) muestra el "después" de la imagen de una sección de pulmón representante que el investigador se prepara para la generación de una imagen binaria. Las flechas negras en (A) y (C) indican ya sea un recipiente (que el investigador pinta negro en (C)) o los macrófagos alveolares (que el investigador pinturas blancas en (C)). (D) < / Strong> muestra la imagen binaria después de que el investigador realiza el paso del umbral. (E) y (F) muestran el acorde alveolar horizontal y vertical longitudes de que el investigador genera, respectivamente. Ampliación de las imágenes es x barra 200. Escala representa a 400 micras se muestra en (A).

Figura 4. alveolar longitud de la cuerda y curvas de presión-volumen. (A) muestra un análisis típico de longitudes de cuerda alveolar en ratones C57BL / 6 ratones WT expuestos a aire (n = 13) o CS (n = 24) durante 6 meses. El asterisco indica p <0,001. (B) muestra los bucles PV típicos realizados en ratones C57BL / 6 ratones WT expuestos a aire (n = 13) o CS (n = 14) durante 6 meses. Los datos se expresan como media + SEM.

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Figura 5. remodelación de la vía aérea pequeña (SAR) evaluación. (A) y (B) muestran imágenes representativas de secciones de pulmón tricrómico manchadas de Masson de C57BL / 6 ratones WT expuestas al aire (A) o CS (B) durante 6 meses. (C) muestra cómo los análisis de software de análisis de imágenes SAR en ratones expuestos-CS. (D) muestra las mediciones típicas del espesor de la capa de proteína de la matriz extracelular depositada alrededor de las vías aéreas pequeñas con un diámetro de 300 a 899 m en ratones C57BL / 6 ratones WT expuestos a aire (n = 11) o CS (n = 16) para 6 meses. Los datos se expresan como media + SEM y asterisco indica p <0,05.

Las barras de escala se muestran en las imágenes de cada sección de pulmón.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032