Automatiserad Mätning av lungemfysem och Liten Airway Remodeling i cigarettrök exponerade möss

Introduction

Användningen av djurmodeller för att studera KOL är utmanande eftersom ingen modell kan mycket replikera alla funktioner i den mänskliga sjukdomen ^(2). De flesta utredare använder möss för att modellera KOL på grund av likheterna mellan möss och människor i deras lungfysiologi, patologi, genetik och metaboliter. Även möss är relativt billiga att studera, och båda emfysem och små luftvägar remodellering utvecklas inom sex månader från CS exponering ^(5,7-9).

Cigarettrök-inducerad KOL: Flera metoder kan framkalla KOL hos möss. De flesta forskare utsätter möss till CS, som är den viktigaste etiologiska faktorn för mänsklig KOL. CS exponering för 6 månader orsakar utvecklingen av emfysem och små luftvägar remodellering (SAR) i möss, men svårighetsgraden av den sjukdom som induceras varierar beroende på den murina stammen studerades. Exempelvis NZWLacZ möss är resistenta mot utvecklingen av CS-inducerad emfysem medan AKR / J-möss är extremely känsliga ^(10). De flesta utredare studerar C57BL / 6 stam möss i exponeringsmodellen CS så många gen inriktade möss är tillgängliga i denna stam. Efter 6 månaders CS exponering, emfysem och små luftvägar fibros utvecklas i vildtypen (WT) C57BL / 6 möss, och båda lesioner är relativt milda i svårighetsgrad ^(5,10). Forskare använder två typer av CS exponering: nose-only och hela kroppen exponeringar. De största nackdelarna med näsan enbart exponering tekniken är att: 1) Det är en mer arbetsintensiv metod; och 2) möss måste vara återhållsamma i små kammare som kan föranleda en stressreaktion och hypertermi hos djuren ^(11). Den största nackdelen med helkroppsexponering (beskrivs här) är att djuren kan inta (liksom andas) nikotin- och tjärprodukter när de rengör deras päls. Möss som utsätts för hela kroppen CS har också lägre hemoglobin nivåer och minskad förlust av kroppsvikt jämfört med djur utsätts för näsan enbart CS ^(12).

Lungfunktionstest (PFT): Åtgärder av lung efterlevnad och elastans är oftast lika i C57BL / 6 vildtyp (WT) möss som exponerats för luft eller CS i 6 månader på grund av den relativt milda emfysem som utvecklas när det stammen är utsatt för CS ^(10). När emellertid emfysematös förstörelse är allvarligare, ökar i lungcompliance och vänster skift i tryck-volym (PV) flödes slingor kan detekteras. Det senare kan observeras, till exempel i murina stammar som är mer mottagliga för effekterna av CS ^(10), i CS-exponerade C57BL / 6 stam gen inriktade möss som har en svårare emfysem typ än C57BL / 6 WT möss ^(13), eller i CS-exponerade möss som utsätts för miljöförändringar som gör dem mer mottagliga för effekterna av CS ^(14). Detta protokoll använder ett litet djur ventilator att mäta minskningar i den elastiska rekylen i lungorna (ökningar i kvasistatiska lung efterlevnad [Cst] och minskningar av vävnadelastans [H]), PV flödesslingor, och förändringar i luftvägarna och vävnadsmotstånd i sövda möss ^(15,16).

Åtgärder av lungemfysem: Analys av emfysem utveckling i CS-exponerade C56BL / 6 stam möss är en utmaning eftersom dess fördelning är spatialt heterogen. Flera olika metoder kvantifiera utvidgningen luftrummet i möss. Den första metoden var den genomsnittliga linjära intercept (L _m) ^(17). Dock är L _m metoden en långsam, manuell process som inte kan fånga heterogenitet av sjukdomen (såvida alla delar av lungan är slumpvis samplas) och dess användning kan därför införa observatörs partiskhet i analysen. Den destruktiva Index [DI, ^(18)] kvantifierar även utvidgningen luftrum använder ett transparent ark med 50 jämnt fördelade punkter placerade över en tryckt digitaliserad bild av ett hematoxylin och eosin-färgade lung sektion. PI-metoden poängen området kring varje punkt acligt den utsträckning i vilken de alveolära kanalerna och alveolära väggar inom detta område förstörs. Den huvudsakliga nackdelen med DI metoden är att den är tidskrävande och inte mer exakt än andra metoder ^(19,20).

Detta protokoll åtgärder innebär alveolär kordalängd och alveolär område på paraffininbäddade lungsektioner färgade med Gills fläck. Morfometri program konverterar bilder av lungsektioner till binära bilder (i vilken vävnad är vit och luftrum är svart), och sedan överlagrar en enhetlig rutnät av horisontella och vertikala linjer (ackord) och programvaran kvantifierar då längden på varje ackord inom områden som programvara som luftrummet. Med användning av denna metod är det möjligt att mäta storleken av alveolerna i alla delar av lungan i en standardiserad och relativt automatiserad sätt ^(21).

Små luftvägs remodellering (SAR): Den ökade nedfallet av ECM-proteiner (speciellt interstitial kollagener) runt små luftvägar sker i CS-exponerade djur och bidrar till luftflöde obstruktion. Forskarna studerar inte SAR i djurmodeller av KOL så ofta som emfysem utveckling ^(22). För att kvantifiera SAR i CS-exponerade möss, använder samma protokoll bildanalysmjukvara att mäta tjockleken av skiktet av ECM-proteiner som är avsatt runt de små luftvägarna (luftvägarna har en medeldiameter mellan 300 och 899 m) i paraffininbäddade lungsektioner färgades med Massons trikrom-färgning.

Protocol

Protokollet tar ~ 25 veckor att slutföra. Protokollet exponerade möss till luft eller rök i 24 veckor. I slutet av rök exponeringar är protokollåtgärder lungfunktion i mössen, och lungor pumpade till ett fast tryck, fast, och tas bort på samma dag. Det behövs ytterligare tid för forskaren att bädda, klippa och färga lungsektionerna (2-3 dagar), och fånga och analysera bilderna (2-4 dagar beroende på antalet djur studerade). Detta protokoll kan också användas för att mäta åldersrelaterad utvidgningen luftrummet i möss.

Alla förfaranden som beskrivs i detta protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Brigham and Women sjukhus / Harvard Medical School.

1. hela kroppen Cigarett rök Exponering

1. Exponera möss att röka i ett rök exponeringsanordning hela kroppen (se figur 1) installerad i ett dragskåp.
   OBS: Enheten laddas automatiskt forsknings cigaretter i hjulet, lights cigaretterna, och samlar sidoström rök i sidoström rök uppsamlingskammare, och matar cigaretterna. Maskinen kombinerar sidoströmsrök med vanliga röken extraheras från cigaretten med en pump för att skapa en blandning av mainstream och sidoström rök. Fläkten i blandning och spädkammare blandar röken med omgivande luft och driver röken in i exponeringskammare.
2. Placera burar som innehåller mössen utan buren locken borttagna (Figur 1) i exponeringskammare. Låt mössen att röra sig fritt runt i sina burar och har tillgång till mat och vatten under hela röken exponeringen (~ 1,75 h).
3. Placera en hink fylld med vatten under cigarettkammaren att släcka utslungade cigaretter. Kör etanol (100%) genom pumpen och anslut den till enheten. Koppla på mikroprocessorelementet hos anordningen, vilket initierar automatiserad lastning av cigaretterna, puffning av pumpen, och uppvärmning av cigaretten lighting tråd.
4. Enheten laster, lampor och röker 10 cigaretter i taget och sedan matar de använda cigaretterna och ersätter dem med en ny sats av 10 cigaretter och upprepar denna process. Varje cykel tar 9 min.
5. Acklimatisera mössen att röka genom att utsätta dem för röken från 20 cigaretter på den första dagen, 40 cigaretter på den andra dagen, 60 cigaretter på den tredje dagen, 80 cigaretter på den fjärde dagen, och 100 cigaretter på den femte dagen. Under acklimatiseringsperiod, observera mössen noggrant för tecken på ångest.
6. Efter fem dagars acklimatisering, utsätta mössen till 100 cigaretter per dag, fem eller sex dagar per vecka under 6 månader. Det behövs Denna nivå av rök exponering för att inducera relativt måttlig utvidgning luftrummet i C57BL / 6 vildtyp möss (23,24). Exponera kontrollmössen till omgivande rumsluft för sex månader. Väg möss före rök acklimatisering och därefter varje vecka för att bedöma effekten av rök exponering på kroppsvikten.
7. Övervaka totala svävande partiklarmateria (TSPM) i exponeringskammare efter de första 60 cigaretter har rökt:
   1. Väg en filterpapper och placera den i en in-line filterhållare som är ansluten till en tidsinställd filterprovtagare och torr gasmätare. Den tidsinställda filterprovtagare drar luft från exponeringskammare genom filterpapper och gasmätare mäter luftflödet under provtagningen.
      OBS: Filtret fångar partiklar som 20 m ³ exponeringskammare luft passerar genom filtret (mätt på torr gasmätaren).
   2. Beräkna TPM räknas som förändringen i filter vikt före och efter provtagning (i mg) per ^m3 luft. Ideal TPM räknas är mellan 150 och 200 mg / m ^3.
8. Efter alla cigaretterna har rökt, ta burarna från exponeringskammare och observera mössen för tecken på ångest för 20 min.
9. Rengör pumpen med 100% etanol efter varje användning, och rengör alla portar och stavar i maskinen varannan vecka för att främjaluftcirkulation och förhindrar uppbyggnad av tjära.

2. Lungfunktionstest (PFTS) Och Lung Inflation

1. I slutet av exponering, söva varje mus genom att leverera en cocktail av ketamin (100 mg / kg), xylazin (10 mg / kg), och acepromazin (3 mg / kg) intraperitonealt i 200 pl saltlösning (USP grade) och använda veterinär salva på ögonen för att hindra dem från uttorkning. Vänta till dess att djuret är i en kirurgisk plan av anestesi, bedömer med hjälp av toe-nypa metod.
2. Raka huden anterior till luftstrupen, och desinficera regionen med en jodinnehållande lösning följt av etanol. Gör en mittlinjen snitt genom huden och subkutan vävnad anterior till luftstrupen med hjälp autoklaveras sax, och separera sternothyroid musklerna med pincett för att exponera luftstrupen.
3. Passera en 2-tums längd av silkessutur posteriort trakea, gör en trakeotomi på den anteriora aspekten av trakea med autoklaverat tRacheal sax, infoga en trakealkanyl (18 G) i trakeotomi, och fäst den på plats med sutur.
4. Anslut musen till Y-slang av adaptern för den mekaniska ventilatorn genom trakealkanylen, och initiera mekanisk ventilation med användning av en tidalvolym på 10 ml / kg och en andningsfrekvens av 150 andetag / min.
   OBS: Det är viktigt i detta skede för att säkerställa att musen är tillräckligt sövda för att erhålla noggranna mätningar PFT. Åter dosera musen med anestetika om djuret inte är i en kirurgisk plan av anestesi. Hela den tid alla PFT manövrar är ca 7,5 min, så det är oftast inte nödvändigt att ge ny dos mössen med anestetika gång en kirurgisk plan av anestesi har uppnåtts. Den totala tiden från induktion av anestesi till dödshjälp är ~ 20 minuter.
5. Pumpa lungorna till total lungkapacitet (TLC) 3 gånger för en volym historia att mäta inandningskapacitet (IC) och minska atelektas av lungorna. Därefter utför litenm den enda frekvens tvångssvängningsmanöver (SnapShot-150 störning) och bedöma det dynamiska motståndet (R), elastans (ERS) och efterlevnad (CRS) i andningsorganen, följt av bredbandsfrekvens tvångssvängningsmanöver (Quick Prime-3 störning ) och mät centrala luftvägsmotstånd _(Rn), vävnadsmotståndet (G), vävnads elastans (H), och förhållandet G / N (). Slutligen rekord quasic statisk efterlevnad (C _st) under volymtryckflödes manövrar.
6. Upprepa varje av dessa manövrar fem gånger (eller utföra ytterligare åtgärder tills överensstämmande avläsningar erhålls) och blåsa till TLC tre gånger mellan varje upprepad uppsättning mätningar. Anteckna medelvärdet för varje parameter för varje mus.
7. Ta bort musen från mekanisk ventilator, och avliva den med _CO2 narkos följt av halsdislokation [denna dödshjälp metoden är godkänd av vår Institutional Animal Care och användning kommittén]. Skär membranet, opsv thorax i mittlinjen, och ta bort de främre revbenen att exponera lungorna. Dissekera huden och subkutana vävnaden runt luftstrupen och passera en andra två-tums längd av silkessutur posteriort trakea.
8. Förbered utrustningen för lung inflationen (Figur 2):
   1. Fyll en 500 ml konisk Erlenmeyerkolv ¾ fulla med steril PBS, försegla den med en gummipropp, invertera den och avbryta den på en ringstativ (så att menisken i fosfatbuffrad saltlösning pH 7,4 (PBS) är 25 cm över hjärtat av musen).
   2. Sätt ena änden av en intravenös ge inställd till PBS i kolven genom gummiproppen. Sätt i en sex tums längd av en plast serologisk pipett genom gummiproppen, så att dess öppning ligger ovanför menisken av PBS för att tillåta luft att ersätta PBS lämnar kolven.
   3. Öppna ventilen på att ge set och köra PBS om systemet för att spola ut luft från att ge uppsättningen.
9. Anslut intravenous ge set till trakealkanylen, öppna ventilen och låt PBS flöda in i lungorna genom gravitation tills lungorna helt blåsa. Stäng ventilen, fästa luftstrupen med den kirurgiska suturen distalt trakealkanylen, och ta bort kanylen.
10. Lyft luftstrupen med pincett, och skär luftstrupen proximalt knuten, och dissekera bindväv posterior till luftstrupen och lungorna. Försiktigt bort lungorna (utan nicking dem), och placera lungorna i ett rör innehållande 10% saltlösning formalin. Fäst lungorna O / N vid RT, och nästa dag, tvätta dem med PBS två gånger.
11. Bädda lungorna i paraffin, skär 5 um tjocka sektioner, och sedan färga sektioner med Gills fläck enligt nedan.

3. Emfysem

1. Gills färgning av paraffininbäddade lungsektioner
   1. Placera glasen i en plastställ och inkubera dem vid 70ºC under 20-30 min i en ugn.
   2. De-pariffinize glasengenom att inkubera dem under 2 min i var och en av fyra byten av xylen.
   3. Rehydrera glasen genom att inkubera dem under 2-3 min i var och en av två byten av 100% etanol, följt av 2-3 min i var och en av två byten av 95% etanol, och tvätta sedan objektglasen två gånger i PBS under 2-3 minuter för varje ändring av lösning.
   4. Inkubera glasen för 18-48 h på en 1: 1 blandning av Gills hematoxylin och ändrat Harris Hematoxylin.
   5. Tvätta bilderna under 2 min i vart och ett av fem byten av destillerat vatten, och dehydratisera glasen genom att inkubera sedan under 2-3 min i var och en av två byten av 95% etanol följt 2-3 min i var och en av två byten av 100% etanol.
   6. Rensa objektglasen genom att inkubera dem under 2 min i var och en av fyra byten av xylen.
   7. Montera glasen med tydliga monteringsmedier och lägg på ett täck utan att införa bubblor, vilket kommer att hindra efterföljande analys.
2. Randomiserad bild förvärv:
   1. Förvärva svartvita bilder som TIFF-fils använder ett mikroskop, en 20 X objektiv och en kamera och programvara som kan få digitala bilder med hög kvalitet.
   2. Capture ~ 20-30 bilder (X 200 förstoring) per mus i en randomiserad sätt, med observatör blind för försöksbeting, undvika att under uppblåsta områden i lungan.
   3. Tejpa en mikro-slide fält finder till bilden. Fält finder har ett rutnät som innehåller en serie fyrkanter som är märkta med en bokstav (i vertikal riktning) och ett nummer (i horisontell riktning) och varje kvadrat har ett kors (+) i mitten och identifieras genom en bokstav och nummer (t.ex. A1, A2, ...... Z25).
   4. Använd en Random Field Generator Excel-ark för att slumpmässigt välja en kvadrat för bildfångst. För att skapa en slumpmässig bokstav, skriv EFGHJKLMNPQRSTU i cell B1 i kalkylbladet (forskaren kan justera detta brev intervall för att täcka de olika rutor som identifieras av en bokstav som ligger över lungorna). Lägg sedan formeln [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] till cell C1 att slumpmässigt välja en bokstav i C1. Kopiera och klistra C1 till C2, C3, C4 et cetera för att generera en kolumn med slumpmässiga bokstäver.
   5. För att skapa ett slumptal i den intilliggande kolumnen skriver formeln = SLUMP.MELLAN (5,25) i D1 (där 5-25 är den typiska utbud av vävnad på bilden). Eventuellt justera detta intervall för att täcka de olika rutor som identifieras med ett nummer som ligger över lungorna.
   6. Kopiera och klistra D1 till D2, D3, D4 et cetera för att generera en kolumn med slumptal bredvid den som innehåller slumpmässiga bokstäver. Således innehåller varje rad ett par slumpmässigt genererade bokstäver och siffror som motsvarar etiketterna på rutorna på fältet-finder (t.ex. E17, H24 ....).
   7. Placera bilden på mikroskopet. Använda mikroskopobjektivet 4X hitta motsvarande torget i fältet finder slide (t.ex. E17, H24 ...) och placera detta torg i mitten av mikroskopfält.
   8. Rikta mitten av mikroskopiskafältet med "+" i mitten av den valda rutan. Ta fältet finder, fokus på lungan med hjälp av mikroskopobjektiv 20X och hämta bilden som en gråskala TIF-fil. Om lungvävnad omslag <50% av den mikroskopiska fältet, välja nästa slumpgenererade torget. Upprepa tills ~ 20-30 bilder är tagna för varje djur. Spara alla bilder för varje djur i en enda mapp märkt med taggen antalet djuret för att den Excel-rapport makrot att känna igen filerna.

4. morfometri To Measure Emfysem

Protokollet använder Scion Bild och anpassade makron för att analysera utvidgningen luftrum. Scion Image är en Windows-kompatibel version av den ursprungliga NIH Image applikation som körs under operativsystemet Macintosh. Scion Bild körs under Windows XP och är fortfarande tillgänglig på nätet via Wikiversity.org, där en sökning på "Scion Bild" kommer styra användaren till länkar tillmanuell och beta 4.0.2 utgåvan av Scion Image. Installation och programvara drift beskrivs i online komplettera manuella och sammanfattas nedan. Den alveolära kordalängd makro anpassades från makro finns i NIH Image.

1. Förbered TIFF bilden av Gills färgade lungavdelning för Scion bildanalys:
   1. Starta Scion Bild och ladda makron som anges i online tillägget. Välj Open Bright Bild [1] makro för att välja och öppna bild TIFF-filen. Nästa, använd bildredigeringsverktyg för att förbereda bilden för analys.
   2. Använd färgen-penseln för att tvinga delar av bilden som inte är luftrum eller alveolära väggar som skall behandlas antingen som luftrum eller som vävnad. Till exempel, måla bronker och kärl svarta så att de analyseras som vävnad. Måla inflammatoriska celler (eller damm) som upptar utrymme i alveolerna vita till att de analyseras som luftrummet.
   3. Välj pensel färg genom att klicka muspekaren påord Svart eller vit i botten av LUT fönstret. Klicka sedan på penseln. För att ändra penselstorlek, dubbelklicka på penseln och ange en lämplig penselstorlek. Klicka och dra musen över bilden för att måla strukturer den valda färgen (se # 1 ovan).
2. Mätning medel kordlängd av luftrummet
   1. Välj makro Chord Längd Air [2] för att mäta luftrummet ackordlängder.
   2. Threshold bilden genom att först, klicka med musen nära centrum av bilden och dra musen uppåt eller nedåt för att justera tröskelvärdet (ett tal mellan 0 och 255, som visas i Info-fönstret). Klicka med musen en andra gång för att acceptera tröskelvärdet. Justera tröskeln för att göra de alveolära väggarna samma tjocklek som i de ursprungliga bilderna.
      OBS: Det är viktigt att forskaren inte under tröskel och därmed skapa avbrott i alveolära väggar som inte finns i den ursprungliga bilden som kommer att produceraartificiellt höga ackordlängdvärden.
   3. Programmet tar automatiskt bort enstaka pixlar (enstaka svarta pixlar omgiven av åtta vita pixlar).
   4. em> 4.2.4. Observera ett fönster som uppmanar användaren att åter tröskeln den binära bilden, fortsätter makrot, eller avbryta makrot. Att tröskeln igen, svara Y till prompten och välj OK.
   5. em> 4.2.5. Visualisera en horisontell och vertikal fönstergaller med linjer 5 pixlar isär skapats av makron. Programmet mäter längderna av horisontella och vertikala linjer som överlappar luftrum.
   6. Spara filen i valfri mapp, men inte ändra standardnamnet annars Excel Rapportera makron inte hittar filen (formatet är namnet på den bild som bifogats "CLa.txt" för luftrummet kordalängd.
      OBS: Om programmet inte göra mätningar, kan tröskelvärdet vara för låg (måste vara> 1). Om detta inträffar, forskaren åter trösklar bilden med ett högre värde.
   7. em> 4.2.7. För alveolära mätningar i området (förutom ackord längder), kör ytterligare [4] och [5] makron också.
   8. em> 4.2.8. Fortsätt tills alla bilder har analyserats.
3. Analysera resultaten med hjälp Excel-rapport makron
   1. Öppna Excel-rapport 20x.xls. Aktivera manuellt Makron vid behov beroende på standardsäkerhetsinställningen i Excel-version som används.
   2. Observera en lista över makron i Macro fönstret (se tabell 1).
      OBS: CL_Air_1 rapporterar kordlängd av luftrummen för ett enskilt djur (mapp). CL_Air_Multi rapporterar kordlängd av luftrummen för flera djur (mappar). AP_No_Edge_1 rapporterar området alveolerna utan kant kontakter för ett enskilt djur (mapp) .AP_No_Edge_Multi rapporterar området alveolerna utan kantkontakter för flera djur (mappar). AP_With_Edge_1 rapporterar område alveoler med kant kontakter för ett enskilt djur (mapp). AP_With_Edge_Multi rapporterar område alveoler med kant contacts för flera mappar.
   3. Välj CL_Air_Multi makro för att rapportera alveolära mätningar ackord längd för flera mappar motsvarande bilder från flera möss. Programmet redovisar alla _CLa.txt filer i de valda mapparna. Utelämna en _CLa.txt fil (efter behov) genom att flytta den till en undermapp i den aktuella mappen eller byta namn på _CLa delen.
   4. Från filen fönstret väljer en mapp i taget genom att markera mappen sedan välja OK (programmet stöder inte flera val på en gång). Som varje mapp är vald, observera det på kalkylbladet. Välj "Cancel" eller stäng filen fönstret för att fortsätta.
      OBS: Beroende på vilken version av Excel, kan forskaren måste navigera tillbaka en mappnivå efter varje mapp är vald.
   5. Observera ett separat kalkylblad för varje mapp, visar statistik för varje _CLa.txt fil följt av statistik för ackorddata längd kombinerat från alla _CLa.txt filer.
   6. Byt namn och spara kalkylbladet. Standard filnamn är namnet på den överordnade mappen bifogas med _CLa.xls. Stäng bladet innan du väljer ett annat makro.

5. Liten Airway Remodeling

1. Färgning och bild förvärv
   1. Fläck lungsektioner med Masson trikrom fläcken med en kommersiellt kit och följ tillverkarens instruktioner.
   2. Fånga bilder av alla luftvägarna i båda lungorna som kan rymmas helt (inklusive blå skiktet utanför luftvägarna som är lagret av ECM-proteiner som deponeras) inom ett bildområde med hjälp av 20X objektiv på mikroskopet.
      OBS: Större luftvägarna är inte förknippade med ökad avsättning av ECM-proteiner i CS-exponerade möss.
   3. Spara färgbilder som jpeg-filer.
2. Bildanalys: Öppna bildfileni bildanalysprogrammet.
   1. Öppna och namnge loggfilen för att spela in mätningarna.
   2. Välj en linje ritverktyg. Rita fyra linjer som korsar lumen av luftvägarna (inre diameter) för att mäta storleken av luftvägen och endast innefattar de luftvägarna med den önskade storleken i analysen. Därefter drar 12 jämnt fördelade linjer (på plats i luftvägarna som motsvarar antalet en klocka) som sträcker sig från kanten av adventitiala lagret anliggande luftvägen ut till kanten av den blå-färgade området omges luftvägarna för att mäta tjockleken av lagret av ECM-proteiner deponeras utanför luftvägarna (Figur 5). Undvik att mäta områden där luftvägarna interagerar med andra luftvägar eller fartyg.
   3. Första skivan alla linjer innerdiametern i loggfilen, och sedan spela de 12 linjerna som mäter tjockleken på den blå ECM lager runt luftvägarna.
   4. Stänga bilden öppnas sedan nästa bild.
   <li> Upprepa dessa steg tills alla bilder för djuret har loggat in i en mapp.
   5. Börja vid steg 5.2 för nästa mapp som innehåller de bilder som tagits på lungsektioner från nästa djuret. Avsluta programmet efter avslutad analys av samtliga luftvägar i lungsektioner från alla djuren i experimentet.
   6. Ange mätningar de fyra interna diameter och de 12 ECM proteinskikt tjockleksmätningar registrerats för varje luftväg för varje mus i data loggfiler till ett Excel-ark. Medelvärdet diametern och ECM proteinskikt tjockleksmätning för varje djur.
   7. Konvertera mätningarna från pixlarna till mikron.
   8. Gruppen luftvägarna beroende på deras storlek innerdiameter (t.ex.., 300-399 nm, 400-499 nm etc.) och jämföra ECM proteinskikt tjockleksmätning runt luftvägarna har liknande storlekar för luft kontra rök exponerade möss (t.ex.., luftvägarna med en diameter av 300 till 899 ^ m;
   9. Om det behövs, immunostain lungsektioner för enskilda proteiner (inklusive interstitiell kollagener och basalmembranprotein) och utföra en liknande analys för att kvantifiera avsättning av proteiner av intresse med hjälp av denna metod.

Representative Results

Detta protokoll börjar med helkroppsexponering av möss för CS. Adekvat tillsyn och underhåll av enheten och övervakning av TPM räknar säkerställa konsekventa rök exponering (Figur 1). Det är viktigt att forskaren utövar lungan inflationstekniken med hjälp av inflationsanordningen

Detta protokoll börjar med helkroppsexponering av möss för CS. Adekvat tillsyn och underhåll av enheten och övervakning av TPM räknar säkerställa konsekventa rök exponering (Figur 1). Det är viktigt att forskaren praxis lunginflations teknik med hjälp av inflationsanordningen (Figur 2) och försiktigt bort lungan efter inflationen för att få väl uppblåsta lungsektioner för noggrann analys av utvidgningen luftrum. Figur 3A visar en väl uppblåst lunga medan figur 3B visar en dåligt uppblåst lunga. Figur 3C visar en bild av en uppblåst lungsektionen förberedd för tröskel sTEP (makrofager i alveolära utrymmena är vitmålade och fartyg och luftrören är målade svarta för att generera. Det tröskelsteg skapar en binär bild där alla pixlar i den alveolära utrymmet är vita och alla pixlar i områden i lungan som inte alveoler är svarta (Figur 3D). Figur 3E och 3F visar den vertikala och horisontella alveolär ackord längder att makron genererar, respektive.

Lungfunktionstester visar blygsamma (och inte statistiskt signifikanta) lämnade förskjutningar i tryckvolymen (PV) öglor reflekterar blygsam förlust av elastisk rekyl av lungan förenlig med den milda emfysem som utvecklas i C57BL / 6 WT möss som exponerats för CS i 6 månader ( Figur 4A). Betydande vänster skift i PV slingor observerades endast i murina stammar som är mycket känsliga för effekterna av CS eller i CS-exponerade gen inriktade möss som har en mer allvarlig emfysem fenotyp än CS-exponerade C57BL / 6 WT möss.

Figure 5 visar representativa bilder Masson trikrom-färgade lungsektioner av C57BL / 6 WT möss som exponerats för luft (figur 5A) eller CS (Figur 5B) under 6 månader som illustrerar ökningar i ECM protein avlagring runt små luftvägar i CS-exponerade djur. Figur 5C illustrerar hur en bildanalysmjukvaruprogram kvantifierar ECM protein avlagring kring luftvägarna med den önskade inre diametern. Figur 5D visar analysen av ECM proteinavsättning runt luftvägarna med en diameter av 300 till 899 ^ m i CS-exponerade C57BL / 6 WT möss.

Figur 1. En tecknad av cigarettexponeringssystemet hela kroppen. En rökexponering enheten är ansluten till en rökfri exponeringskammare. Rök dragés från sidoström uppsamlingskammare och rök dras fråncigaretterna vid pumpen, och båda rök prover blandas och späds ut med luften i blandning och spädkammare (vänster), och sedan röken strömmar in i exponeringskammare. Forskaren ställer möss i sina burar i exponeringskammare (höger); möss kan röra sig fritt i sina burar, och har tillgång till mat och vatten under hela röken exponeringen.

Figur 2. Inflation av murina lungor. Forskaren fyller en kolv med steril PBS, tätningar den med en gummipropp, och inverterar den och säkrar det ett avstånd av 25 cm ovanför hjärtat av djuret med hjälp av en ringstativ. En intravenös ge set levererar PBS till lungorna via trakealkanylen. En nedbantad serologisk pipett sätts in genom gummiproppen och detta gör luften i kolven för att ersätta den volym PBS som rinner in i lungarna hos mössen av gravitationen.

Figur 3. Emfysem analys. (A) visar en representativ bild av Gill's-fläck uppblåsta lungsektioner från möss som exponerats för luft eller CS i 6 månader, de svarta pilarna visar ett fartyg och alveolära makrofager. (B) visar en representativ bild av en under-uppblåst lunga som inte är lämplig för analys. (A) visar den "före" och (C) visar den "efter" bild av en representativ lunga sektion att forskaren förbereder sig för generering av en binär bild. De svarta pilarna i (A) och (C) indikerar antingen ett kärl (som forskaren målar svart i (C)) eller alveolära makrofager (vilka forskaren målar vita i (C)). (D) < / Strong> visar den binära bilden efter forskaren utför tröskelsteg. (E) och (F) visar den horisontella och vertikala alveolär ackord längder att forskaren genererar, respektive. Förstoring av alla bilder är x 200. Skala stapel representerar 400 ^ m visas i (A).

Figur 4. Alveolär kordalängd och tryck-volym-kurvor. (A) visar en typisk analys av alveolära ackord längder hos C57BL / 6 WT möss som exponerats för luft (n = 13) eller CS (n = 24) för sex månader. Asterisken anger p <0,001. (B) visar typiska PV öglor utförs på C57BL / 6 WT möss som exponerats för luft (n = 13) eller CS (n = 14) för sex månader. Data uttrycks som medelvärde + SEM.

highres.jpg "/>
Figur 5. Små luftvägs ombyggnad (SAR) bedömning. (A) och (B) visar representativa bilder av Masson trikrom-färgade lungsektioner från C57BL / 6 WT möss som exponerats för luft (A) eller CS (B) under 6 månader. (C) visar hur bildanalys programvara analyserar SAR i CS-exponerade möss. (D) visar typiska mätningar av tjockleken hos det extracellulära matrisproteinet skikt avsatt kring små luftvägar med en diameter av 300 till 899 m i C57BL / 6 WT möss som exponerats för luft (n = 11) eller CS (n = 16) för sex månader. Data uttrycks som medelvärde + SEM och asterisk indikerar p <0,05.

Skala barer visas på bilderna i varje lungsektion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032