Sigara Duman maruz kalan Fare Akciğer Amfizem ve Küçük Havayolu Yaptırma otomatik ölçüm

Introduction

bir model mükemmel insan hastalığı ⁽²⁾ tüm özelliklerini taklit çünkü KOAH çalışma hayvan modellerinde kullanılması zordur. Çoğu araştırmacı nedeniyle pulmoner fizyoloji, patoloji, genetik ve metabolitleri fareler ve insanlar arasındaki benzerlikler KOAH model fareler kullanın. Ayrıca, fareler çalışma nispeten ucuzdur ve amfizem ve küçük hava yolu yeniden hem CS maruz ^(5,7-9) 6 ay içinde gelişir.

Sigara dumanı kaynaklı KOAH: Çeşitli yöntemler farelerde KOAH neden olabilir. Çoğu araştırmacı insan KOAH için önemli etyolojik faktör olan CS, fareler maruz kalmaktadır. 6 ay boyunca CS pozlama amfizem ve farelerde küçük hava yolu yeniden (SAR) gelişimine neden olur, ancak bağlı olan hastalığın şiddeti okudu kemirgen gerginlik bağlı olarak değişir. AKR / J fareleri extremel vardır, oysa Örneğin, NZWLacZ fareler CS kaynaklı anfizemin gelişimine karşı dirençli olanHassas y ^(10). Çoğu araştırmacı gibi birçok gen hedefli fareler bu gerginlik mevcuttur CS pozlama modelinde C57BL / 6 suşu fareler çalışma. Sürekli maruz, amfizem ve küçük hava yolu fibroz 6 ay sonra yabani tip geliştirmektedir (WT), C57BL / 6 fareleri, her iki lezyonlar şiddeti ^(5,10) içinde nispeten hafiftir. Burun-tek ve tüm vücut maruz: Araştırmacılar CS maruz kalma iki türlerini kullanabilirsiniz. 1) Bir daha emek-yoğun bir yöntemdir;: burun sadece pozlama tekniği önemli dezavantajları olduğunu vardır ve 2) fareler hayvanlar ⁽¹¹⁾ bir stres tepkisi ve hipertermi neden küçük odacıklarda ölçülü gerekir. (bu tarifnamede anlatıldığı gibi) tam gövde maruz önemli dezavantajı, bunların kürk temizlerken hayvanlar nikotin ve katran ürünleri (aynı zamanda inhale gibi) yutar olmasıdır. Tüm vücut dumanına maruz bırakılan fareler aynı zamanda daha düşük carboxyhemoglobin seviyeleri ve burun sadece CS ⁽¹²⁾ maruz kalan hayvan ile karşılaştırıldığında, vücut ağırlığı kaybı azalır.

Solunum fonksiyon testi (SFT): Akciğer uyum ve elastansı ölçüleri genellikle C57BL / 6 yabani tip benzer (WT) nedeniyle bu geliştirir nispeten hafif amfizem 6 ay boyunca hava veya dumanına maruz bırakılan farelerde suşu CS ⁽¹⁰⁾ maruz kalmaktadır. Amfizem yıkım daha şiddetli Ancak, akciğer uyum ve basınç-hacim (PV) sol vardiya artışlar döngüler tespit edilebilir akış. İkincisi, C57BL / 6 WT farelere göre daha ciddi bir amfizem tip CS maruz kalan, C57BL / 6 streyn gen hedefli farelerde, CS etkilerine ⁽¹⁰⁾ karşı daha duyarlı olan fare suşlarının, örneğin, görülebilir ya da CS etkilerine ⁽¹⁴⁾ karşı daha duyarlı hale getirmek çevre değişikliklerine maruz CS maruz bırakılan farelerde ^(13). Bu protokol dokusunda akciğer elastik recoil (Yan statik akciğer uygun artar [Cst] azalma ve azalmalar ölçmek için küçük bir hayvan vantilatör kullanırelastisite [H]), PV akış döngüler, ve anestezi farelerin ^(15,16) hava yolu ve doku direnci değişir.

Pulmoner amfizem Ölçüleri: dağıtım mekansal heterojen çünkü CS-maruz C56BL / 6 suşu farelerde amfizem gelişimi analizi zordur. Çeşitli farklı yöntemler farelerde bir hava boşluğu büyümesi miktarı belirlenir. Kullanılan ilk yöntem, ⁽¹⁷⁾ ortalama lineer ara parçası (L _m) idi. Ancak, L _m yöntemi (akciğerin tüm bölümleri rastgele örnekleme sürece) hastalık ve dolayısıyla analiz içine gözlemci önyargı tanıtmak olabilir kullanımı heterojen yakalamak olmayabilir yavaş, manuel süreçtir. yıkıcı indeksi [DI, ^(18)] aynı zamanda bir hematoksilen ve eozin lekeli akciğer bölümünün basılı sayısallaştırılmış resmin üzerine yerleştirilen 50 eşit dağıtılmış noktaları ile şeffaf bir sayfasını kullanarak hava sahasını büyütme rakamlarla. PI yöntemi puanları her nokta ac çevresiölçüde Cording olan bu alanda alveol kanalları ve alveol duvarları tahrip edilir için. DI yöntemin temel dezavantajı, zaman alan ve diğer yöntemler ^(19,20) göre daha doğru olmadığıdır.

Bu protokol önlemler Gill'ın boyası ile boyanmış parafin gömülü akciğer bölümlerinde alveol kiriş uzunluğunu ve alveol alanı demek. Morfometri yazılımı ikili görüntüleri akciğer bölümlerinin görüntüleri dönüştürür (ki doku beyaz ve hava sahasını siyah), ve daha sonra yatay ve dikey çizgiler (akorları) muntazam bir ızgara üst üste bindirir ve yazılımı daha sonra tespit alanlarda her akor uzunluğunu quantifies hava sahasını gibi yazılım. Bu yöntem kullanılarak, bir standart ve nispeten otomatik bir şekilde ⁽²¹⁾ akciğer her yerinde alveol boyutunu ölçmek mümkündür.

Küçük hava yolu yeniden (SAR): ECM proteinleri artan birikim (özellikle çatlaklarküçük hava yollarının çevresindeki l kollajen) CS-maruz kalan hayvanlarda oluşur ve tıkanıklık hava akımını katkıda bulunur. Araştırmacılar, amfizem geliştirme ⁽²²⁾ olduğu kadar sık KOAH hayvan modellerinde, SAR deneyi değildir. CS-maruz bırakılan farelerde SAR ölçmek için, bu protokol küçük hava yolları parafine gömülü akciğer bölümlerinde (üst solunum yolları 300 ve 899 m arasında bir ortalama çapa sahip olan) yaklaşık yatırılır ECM proteinlerinin tabakasının kalınlığının ölçülmesi için görüntü analizi yazılımını kullanır Masson trikrom boyası ile boyandı.

Protocol

protokol tamamlamak için 25 hafta ~ alır. protokol 24 hafta boyunca hava veya duman fareler maruz. Duman maruz sonunda, protokol önlemler akciğer farelerde fonksiyon ve akciğerleri, sabit bir basınca şişirilmiş, sabit ve aynı gün çıkarılır. Ek süre (2-4 gün hayvan sayısına bağlı olarak okudu), gömmek kesilmiş ve akciğer bölümlerini (2-3 gün), ve yakalama leke ve görüntüleri analiz araştırmacı için gereklidir. Bu protokol, aynı zamanda farelerde de yaşa bağlı hava boşluğu büyümesi olarak ölçmek için kullanılabilir.

Bu protokol açıklanan tüm işlemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Brigham'daki Komitesi ve Kadın Hastanesi / Harvard Tıp Okulu tarafından onaylanmıştır.

1. Tüm Vücut Sigara Duman Pozlama

1. Davlumbaz yüklü bir tüm vücut dumanı maruziyeti cihazı (Şekil 1) sigara içmek fareler Açığa.
   NOT: Cihaz otomatik tekerlek, l araştırmalar sigara yüklersigara ights ve yan akım dumanı toplama odasında yan akım dumanı toplar ve sigara çıkarır. Makine ana ve yan akım dumanı bir karışımı oluşturmak için bir pompa tarafından sigara çıkarılan ana duman ile yan akım dumanı birleştirir. karıştırma ve seyreltilmesi odasına fan ortam havası ile duman karışır ve pozlama odalarına duman sürücüler.
2. Maruz kalma odasına uzaklaştırıldı kafes kapak (Şekil 1) olmayan fare içeren bir yer kafesleri. Fareler kafeslerine etrafında serbestçe hareket ve duman maruziyeti (~ 1.75 saat) süresince yiyecek ve suya erişimi için izin verin.
3. Çıkartılan sigara söndürmek için sigara odasının altındaki su dolu bir kova yerleştirin. Pompa aracılığıyla etanol (% 100) çalıştırın ve cihaza bağlayın. Sigara aydınlatabiliriz otomatik sigara yükleme, pompa şişirme ve ısıtma başlatır cihazın mikroişlemci elemanı, üzerinde anahtarıting tel.
4. Cihaz yükler, ışıklar, ve bir seferde 10 sigara içiyor ve daha sonra kullanılan sigara çıkarır ve 10 sigara bir yeni parti ile değiştirir ve bu işlemi tekrarlar. Her döngü 9 dakika sürer.
5. İlk gün 20 sigara, ikinci gününde 40 sigara, üçüncü gün 60 sigara, dördüncü gününde 80 sigara ve beşinci günde 100 sigara dumanı onları teşhir ederek duman fareler iklime alıştırmak. Uyum sürecinde sıkıntı belirtileri açısından dikkatle fareler gözlemlemek.
6. Alışmadan 5 gün sonra, günde 100 sigaralar, 5 ya da 6 gün başına haftada 6 ay boyunca fareler ortaya çıkarmak. Duman maruz düzeyi, C57BL / 6 vahşi tip farelerde nispeten ılımlı bir hava boşluğu büyümesi (23,24) ikna etmek için gereklidir. 6 ay boyunca ortam oda havası kontrol fareler Açığa. Vücut ağırlığı üzerindeki dumanı maruziyeti etkisini değerlendirmek için haftalık sonra duman alışmadan önce fareler tartılır ve.
7. Toplam askıda parçacık Monitörİlk 60 sigara sonra poz odalarında madde (TSPM) füme edilmiş:
   1. Bir filtre kağıdı tartılır ve bir zaman ayarlı filtre örnekleyici ve kuru gaz sayacı bağlı olan bir hat-içi filtre tutucuya yerleştirin. zamanlı filtre numune filtre kağıdı ve gaz sayacı önlemler örnekleme sırasında hava akımı yoluyla maruz odasından havayı çeker.
      NOT: pozlama odası hava 20 m ³ olarak filtre tuzakları partiküler madde (kuru gaz sayacı ölçülen) filtreden geçer.
   2. Önce ve m ³ havada başına (mg) örnekleme sonra filtre ağırlığındaki değişim olarak TPM sayısını hesaplayın. İdeal TPM sayısı 150 ila 200 mg / ^{m3 bulunmaktadır.}
8. Sigara tüm füme sonra, pozlama odasından kafesleri kaldırmak ve 20 dakika boyunca sıkıntı belirtileri fareler gözlemlemek.
9. Her kullanımdan sonra% 100 etanol ile pompayı temizleyin ve teşvik makine iki haftada tüm portları ve çubuklar temizlemekHava sirkülasyonu ve katran oluşumunu engeller.

2. Solunum Fonksiyon Testi (SFT) ve Akciğer Enflasyon

1. Maruz sonunda tuzlu su, 200 ul intraperitonal yoldan (USP ketamin (100 mg / kg), ksilazin (10 mg / kg) ve asepromazin (3 mg / kg) bir kokteyli vererek, her fare anestezi sınıf) ve kurumasını önlemek için göze veteriner merhem kullanın. Hayvan, anestezi, cerrahi düzlemde olan ayak-tutam yöntemi kullanılarak değerlendiriyor kadar bekleyin.
2. Trakea deri anterior Tıraş ve etanol ile, ardından bir iyot ihtiva eden çözelti ile bölge dezenfekte. Otoklava makas kullanarak trakea deri ve deri altı doku anterior yoluyla orta hat kesi yapmak ve trakea maruz forseps ile sternothyroid kasları ayırın.
3. , Trakea ipek sütür posterior 2-inç uzunluğunda geçmek Otoklavlanmış t trakea ön yüzünde bir trakeotomi yapmakracheal makas, trakeotomi bir trakeal kanül (18 G) takın ve dikiş ile yerine sabitleyin.
4. Trakeal kanül aracılığı ile mekanik ventilatör adaptörün Y-boru için fareyi bağlayın ve 10 ml / kg tidal hacmi ve / dak 150 nefesler bir solunum oranı kullanılarak mekanik ventilasyon başlatmak.
   NOT: Bu fare yeterince hassas SFT ölçümleri elde etmek için anestezi sağlamak için bu aşamada önemlidir. Hayvan anestezi cerrahi bir düzlemde değilse anestezik ile fareyi yeniden doz. SFT tüm manevralar tüm süresi yaklaşık 7.5 dakika, bu yüzden anestezi cerrahi bir düzlemde elde edildikten sonra anestetikler ile farelerin redose genellikle gerekli değildir. Ötenazi anestezi indüksiyonu toplam süresi ~ 20 dakikadır.
5. Toplam akciğer kapasitesi (TLC) inspiratuar kapasite (IC) ölçmek ve akciğerlerin atelektazi azaltmak için bir hacim geçmişi için 3 kez akciğerlerini şişirmek. Daha sonra, perfor, geniş bant frekansı zorla salınım manevrası (Hızlı Prime-3 pertürbasyon ardından solunum sistemi elastans (Ers) ve uyum (CRS), tek frekans zorla salınım manevrası (SnapShot-150 pertürbasyon) m ve dinamik direnci (R) değerlendirmek ) ve merkezi hava yolu direncinin _{(R, n),} doku direncini (G), doku elastisite (lH) ve oranı, G ölçmek / N (a). Son olarak, hacim-basınç akış manevraları sırasında kayıt Quasic-statik uygunluk (C _st).
6. Bu manevralar her beş kez tekrarlayın (ya da tutarlı okumalar elde edilinceye kadar ilave tedbirler yerine) ölçümleri her tekrarlanan kümesi arasında üç kez ve TLC şişirmek. Her bir fare için, her parametre için ortalama değer kaydedilir.
7. Mekanik ventilatöre fareyi çıkarın ve servikal dislokasyon tarafından takip CO ₂ narkoz ile euthanize [Bu ötenazi yöntemi bizim Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır]. Diyafram, op Cutorta hatta toraks ve akciğerler tr maruz ön kaburga kaldırın. Trakea çevresindeki deri ve deri altı doku incelemek ve trakea ipek sütür posterior ikinci 2-inç uzunluğunda geçmek.
8. Akciğer enflasyon (Şekil 2) için donatım hazırlayın:
   1. Steril PBS ile dolu bir 500 ml'lik konik bir Erlenmeyer flask ¾ Dolgu lastik bir durdurucu ile mühür, bu ters, ve bir halka stand üzerine askıya (fosfat tamponlu tuzlu su pH 7.4 (PBS) menisküs üzerinde 25 cm olacak şekildedir fare kalp).
   2. Lastik tıpa ile şişede PBS içine ayarlanmış bir intravenöz verme bir ucunu. Açılış hava balon bırakarak PBS yerine izin PBS menisküs üstünde yatıyor böylece lastik tıpa ile plastik serolojik pipet 6 inç uzunluğu yerleştirin.
   3. Veren set valfini açın ve sistem veren kümesinden havayı dışarı floş olsa PBS çalıştırın.
9. Intr bağlayıntrakeal kanül ile avenous veren seti, valfini açın ve akciğerler tamamen şişirmek kadar PBS yerçekimi tarafından akciğerlere akmasına izin verin. , Vanayı kapatın trakeal kanül cerrahi sütür distalinde kullanarak trakea kapalı kravat ve kanül çıkarın.
10. Forseps ile trakea kaldırın, ve düğüm için trakea proksimal kesim ve trakea ve akciğerlere bağ dokusu posterior teşrih. Dikkatle (onlara nicking olmadan) akciğerleri kaldırmak, ve% 10 tuzlu tamponlu formalin içeren bir tüp içinde akciğerleri yerleştirin. Akciğerler O / oda sıcaklığında, N, ve bir sonraki gün saptamak iki kez PBS ile yıkayın.
11. Parafin akciğerleri embed, 5 mikron kalınlığında kesitler kesmek, ve aşağıda belirtilen sonra Gill'ın leke bölümleri leke.

3. Amfizem

1. Parafin akciğer bölümlerinin Gill'ın boyama
   1. Plastik raf slaytlar yerleştirin ve bir fırında 20-30 dakika süreyle 70 ° C'de inkübe.
   2. Slaytlar De-pariffinizeiksilen dört değişiklikleri her 2 dakika için onları kuluçka.
   3. % 95 etanol içinde iki değişiklik, her 2-3 dakika süre ile,% 100 etanol içinde iki değişiklik, her biri 2-3 dakika boyunca enkübasyonuyla slaytları rehidrate, ve daha sonra, 2-3 dakika boyunca PBS içinde iki kere slaytları yıkama çözümün her değişiklik için.
   4. Gill, Hematoksilin 1 karışımı ve modifiye Harris Hematoksilen bir 1: 18-48 st için slaytlar inkübe edin.
   5. Damıtılmış su beş değişiklikleri her 2 dakika için slaytlar yıkayın ve% 95 etanol içinde iki değişiklik, her 2-3 dakika, daha sonra inkübe edilerek slaytlar dihidrat,% 100 2 değişiklik, her 2-3 dakika sonra etanol.
   6. Iksilen dört değişiklikleri her 2 dakika için onları kuluçka slaytlar temizleyin.
   7. Açık montaj medya ile slaytlar monte ve sonraki analiz engel olacak tanıtan kabarcıklar olmadan bir lamel ekleyin.
2. Randomize görüntü elde etme:
   1. TIFF dosyası olarak siyah ve beyaz görüntü eldeBir mikroskop, 20 x objektif ve yüksek kaliteli dijital görüntü elde edebilirsiniz bir kamera ve yazılım kullanarak s.
   2. Akciğerin altında şişirilmiş alanları kaçınarak deneysel durumuna kör gözlemci, bir randomize bir şekilde fare başına Yakalama ~ 20-30 görüntüleri (X 200 büyütme).
   3. Slayt üzerine mikro-slayt alan bulucu Teyp. Alan bulucu (dikey yönde) bir harfin olan kareler bir dizi içeren bir ızgara ve (yatay yönde) bir numarası vardır ve her kare merkezinde bir haç (+) olan ve bir harf ile tanımlanır ve numarası (örneğin, A1, A2, ...... Z25).
   4. Rastgele görüntü yakalama için bir kare seçmek için bir Rastgele Alan Jeneratör Excel kullanın. Rastgele bir mektup oluşturmak için, elektronik tablonun hücre B1 içine EFGHJKLMNPQRSTU girin (araştırmacı akciğerleri örten bir mektupla tarafından belirlenen kareler aralığını kapsayacak şekilde bu mektup aralığını ayarlayabilirsiniz). Sonraki, formül ekleyebilir [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] rastgele rastgele harflerden oluşan bir sütun oluşturmak için C2, C3, C4 ve saire içine bir C1. Kopyala ve yapıştır mektup C1 seçmek için C1 hücre.
   5. (5-25 slaytta dokusu tipik aralık olduğu) bitişik sütunda bir rasgele sayı oluşturmak için, D1 içine formül = RANDBETWEEN (5,25) yazın. İsteğe bağlı olarak, akciğerleri örten bir sayısına göre belirlenen kareler aralığını karşılamak için bu aralığı ayarlayın.
   6. D2, D3, D4 ve saire içine kopyalama ve yapıştırma D1 yanında olduğunu içeren rastgele harfler rastgele sayılar için bir sütun oluşturmak için. Böylece, her satır alan bulucu kareler üzerindeki etiketlere karşılık gelen rasgele oluşturulmuş harf ve sayılar bir çift içeren (örneğin, E17, H24 ....).
   7. Mikroskop slayt yerleştirin. 4X mikroskop objektif kullanarak alan bulucu slayt ilgili kare bulmak (örneğin, E17, H24 ...) ve mikroskop alanının merkezinde bu kare yerleştirin.
   8. Mikroskobik merkezini hizalayınSeçilen meydanın ortasında "+" ile alan. Alan bulucu çıkarın 20X mikroskop objektif kullanarak akciğer odaklanmak ve gri ölçekli TIF dosyası olarak görüntü elde. Akciğer dokusu kapakları <mikroskobik alan% 50, sonraki rastgele üretilen kare seçin. 20-30 görüntüleri her bir hayvan için yakalanır ~ kadar tekrarlayın. Dosyaları tanımak için makro Excel Raporu için sırayla hayvan etiket numarası ile etiketlenmiş tek bir klasörde her hayvan için tüm görüntüleri kaydedin.

4. Morfometri Amfizem ölçün için

protokol hava sahasını genişlemesini analiz filiz Görüntü ve özelleştirilmiş makro kullanır. Filiz Görüntü Macintosh işletim sistemi altında çalışan orijinal NIH Görüntü uygulama Windows uyumlu sürümü. Filiz Görüntü, Windows XP altında çalışan ve 'Scion Image' için arama bağlantıları kullanıcıyı yönlendirecek Wikiversity.org, üzerinden online hala kullanılabilirFiliz Görüntü manuel ve beta 4.0.2 sürümü. Kurulum ve yazılım operasyonu çevrimiçi ek kılavuzunda açıklandığı ve aşağıda özetlenmiştir. Alveoler akor uzunluğu makro NIH Image mevcut makro uyarlanmıştır.

1. Filiz görüntü analizi için Gill'ın lekeli akciğer bölümünün TIFF görüntü hazırlayın:
   1. Filiz Görüntü başlatın ve çevrimiçi ekte belirtilen makro yükleyin. Seçin ve görüntü TIFF dosyasını açmak için Açık aydınlık Görüntü [1] makro seçin. Sonraki, analiz için görüntüyü hazırlamak için görüntü düzenleme araçlarını kullanın.
   2. Hava sahasında veya doku gibi ya tedavi edilecek hava sahasını veya alveoler duvarlar değil görüntünün alanlarını zorlamak için boya-fırça aracını kullanın. Onlar doku olarak analiz edilir, böylece, örneğin, siyah bronşlar ve damarları boya. Onlar hava sahasını olarak analiz edilmesi için alveol beyaz yer kaplayan iltihap hücreleri (veya toz) boya.
   3. Fare imlecini tıklayarak boya fırçası rengi seçinAÜS penceresinin altındaki kelimeleri Siyah veya Beyaz. Sonraki, fırça aracını tıklatın. Fırça aracı fırça boyutunu, çift tıklama değiştirmek ve uygun bir fırça boyutunu girmek için. Tıklayın ve yapıları seçilen rengi (yukarıda # 1) boyamak için resmin üzerine fareyi sürükleyin.
2. Hava sahasını ortalama kiriş uzunluğunu Ölçme
   1. [2] hava sahasını akor uzunlukları ölçmek için makro Chord Uzunluk Hava seçin.
   2. Eşik sonra eşik değeri (Bilgi penceresinde gösterilir, 0 ile 255 arasında bir sayı) ayarlamak için yukarı veya aşağı sürükleyin görüntünün merkezine yakın fareyi tıklayarak ilk görüntü. Fareye eşik değeri kabul etmek ikinci kez tıklayın. Orijinal görüntüler olarak alveol duvarlarını aynı kalınlıkta yapmak için eşik ayarlayın.
      NOT: Bu araştırmacı değil eşik-altı ve böylece üretecek orijinal görüntüde yoktur alveol duvarlarında sonları oluşturmak yaptığı önemlidiryapay yüksek akor uzunluğu değerleri.
   3. Program otomatik olarak tek bir piksel (8 beyaz piksel çevrili tek bir siyah piksel) kaldırır.
   4. > 4.2.4 em. Kullanıcıyı yeniden eşik ikili görüntü ister bir pencere gözlemlemek makro devam ya da makro iptal. Tekrar eşiğine, istemine cevap ve Y Tamam düğmesini seçin.
   5. > 4.2.5 em. 5 piksel ayrı bir makro tarafından oluşturulan hatları ile yatay ve dikey ızgara penceresini gözünüzde canlandırın. Program hava sahasını üst üste yatay ve dikey çizgilerin uzunluklarını ölçer.
   6. Herhangi bir klasördeki dosyayı kaydedin, ama aksi takdirde Excel Raporu makro biçimi hava sahasının akor uzunluğu "CLa.txt" ile eklenen resmin adıdır (dosya bulamazsınız varsayılan adını değiştirmeyin.
      NOT: Program ölçümler yapmak değilse, eşik değeri çok düşük olabilir (olmalı> 1). Bu daha yüksek bir değeri kullanarak, araştırmacı yeniden eşikleri görüntü oluşursa.
   7. em> 4.2.7. Alveol alanı ölçümleri için (ek olarak uzunlukları kirişe) ek uzantı [4] ve [5] makro de.
   8. > 4.2.8 em. Tüm görüntüleri analiz edilinceye kadar devam edin.
3. Excel Raporu Makrolar kullanarak sonuçları analiz
   1. Açık Excel Raporu 20x.xls. Gerekli kullanılan Excel sürümünde varsayılan güvenlik ayarlarına bağlı olarak, eğer manuel Makroları etkinleştirin.
   2. Makro penceresinde makrolar listesini gözlemleyin (bakınız Tablo 1).
      NOT: CL_Air_1 tek bir hayvan (klasör) için hava sahasındaki akor uzunluğunu bildirir. CL_Air_Multi birden hayvanlar (klasörler) için hava sahasındaki akor uzunluğunu bildirir. AP_No_Edge_1 .AP_No_Edge_Multi birden hayvanlar (klasörler) için kenar temas olmadan alveol alanı raporları tek bir hayvan (klasörün) için kenar temas olmadan alveol alanı bildirir. AP_With_Edge_1 tek bir hayvan (klasör) için kenar rehber ile alveol alanı bildirir. AP_With_Edge_Multi kenar c alveol alanı raporlarıBirden fazla klasör için ONTAKLARIM.
   3. Birden farelerin görüntülere karşılık gelen birden fazla klasör için alveol akor uzunluğu ölçümleri rapor CL_Air_Multi makro seçin. Program seçilen klasörlerdeki _CLa.txt tüm dosyaları raporlar. Geçerli klasörün bir alt klasörüne taşıyarak veya _CLa bölümünü yeniden adlandırarak (gerektiği gibi) bir _CLa.txt dosyasını atlayın.
   4. Dosya penceresinden, (programın bir kerede birden fazla seçim desteklemez) Tamam seçerek ardından klasörü vurgulayarak bir defada bir klasörü seçin. Her klasör seçildiğinde, çalışma sayfasındaki bunu gözlemlemek. Seç "Cancel" veya devam etmek için dosyası penceresini kapatın.
      NOT: Excel sürümüne bağlı olarak, araştırmacı, her klasör seçildikten sonra geri bir klasör düzeyi gezinmek zorunda kalabilirsiniz.
   5. Tüm _CLa.txt dosyalarından kombine akor uzunluğu verileri istatistiklerine ardından her _CLa.txt dosyası ilişkin istatistikleri gösteren, her klasör için ayrı bir çalışma gözlemleyin.
   6. Yeniden adlandırın ve tabloyu kaydedin. Varsayılan dosya adı _CLa.xls ile eklenen üst klasörün adıdır. Başka bir makro seçmeden önce çalışma kapatın.

5. Küçük Havayolu Tadilat

1. Boyama ve görüntü elde etme
   1. Bir ticari kit kullanılarak Masson trikrom boyası ile akciğer bölümleri Leke ve üreticinin talimatlarına uyun.
   2. Mikroskop 20X objektif kullanarak bir görüntü alanında (yatırılır ECM proteinlerinin katman nefes yolu dışında mavi tabaka da dahil olmak üzere), tam olarak yerleştirilebilir her iki akciğerde de tüm hava yollarının görüntü yakalama.
      NOT: Büyük hava yolları CS-maruz kalan farelerde ECM proteinleri artan birikimi ile ilişkili değildir.
   3. Jpeg dosyaları olarak renkli görüntüleri kaydedin.
2. Görüntü analizi: Görüntü dosyasını açınGörüntü analiz yazılımı programında.
   1. Açın ve ölçümleri kaydetmek için günlük dosya adı.
   2. Bir çizgi çizim aracı seçin. Solunum yolunun boyutunu ölçmek için hava yolu lümen (iç çap) geçen 4 satır çizmek ve yalnızca üst solunum yolları analizinde arzu edilen boyuta sahip bulunmaktadır. Daha sonra, mavi lekeli bölgenin kenarına hava yolu üzerinden bitişik adventisya tabakanın kenarından uzanan (bir saat numaralarına karşılık gelen solunum yolu içinde pozisyonunda) kalınlığını ölçmek için hava yolu 12 eşit aralıklı çizgiler çevrili çizmek nefes yolunun dışında biriken ECM proteinlerinin tabakasının (Şekil 5). Havayolu, diğer havayollarındaki veya gemileri ile etkileşime alanları ölçme kaçının.
   3. Daha sonra ilk günlük dosyasında iç çapı hatlarının tüm kayıt ve solunum yollarının çevresindeki mavi ECM tabakasının kalınlığını ölçen 12 satırları kaydeder.
   4. Görüntü daha sonra bir sonraki görüntüyü açmak kapatın.
   <hayvan için tüm görüntüleri tek bir klasör içine günlüğe kadar li> bu adımları tekrarlayın.
   5. Bir sonraki hayvandan akciğer bölümlerinde çekilen görüntüleri içeren bir sonraki klasör için adım 5.2 başlayın. Deneyde tüm hayvanların akciğer bölümlerinde hava yollarının bütün analizini tamamladıktan sonra programı çıkın.
   6. 4 iç çap ölçümleri ve bir Excel elektronik tabloya veri günlük dosyalarında her fare için her hava yolu için kaydedilen 12 ECM protein tabakası kalınlığı ölçümleri girin. Her hayvan için çap ve ECM protein tabakası kalınlığı ölçümleri ortalama.
   7. Mikron piksel ölçümleri dönüştürme.
   8. Grup, iç çapı büyüklüğüne göre hava yolları (örn., 300-399 mikron, 400-499 mikron vb) duman maruz kalan farelerin karşı hava için benzer boyutlara sahip solunum yollarının etrafında ve karşılaştırın ECM protein tabakası kalınlığı ölçümleri (örn., 300-899 um arasında bir çapa sahip olan solunum yolu;
   9. (Dokular arası kollaj ve bazal zar proteini içeren) tek tek proteinler için, immunostain akciğer bölümleri gerekli ve bu yöntem kullanılarak ilgi konusu olan proteinlerin birikmesini ölçmek için benzer analiz edin.

Representative Results

Bu protokol, CS farelerin tüm vücut teması ile başlar. Yeterli gözetim ve cihaz ve TPM izlenmesi bakım tutarlı duman risklerini (Şekil 1) sağlamak sayar. Araştırmacı enflasyon cihazı kullanarak akciğer enflasyon tekniği uygulamaları olduğunu önemlidir

Bu protokol, CS farelerin tüm vücut teması ile başlar. Yeterli gözetim ve cihaz ve TPM izlenmesi bakım tutarlı duman risklerini (Şekil 1) sağlamak sayar. Bu araştırmacı uygulamaları dikkatle enflasyon cihazı (Şekil 2) ve kullanarak akciğer enflasyon tekniği hava sahasını genişleme doğru analizi için iyi şişirilmiş akciğer bölümlerini elde etmek amacıyla enflasyon sonra akciğer kaldırır önemlidir. Şekil 3B kötü şişirilmiş akciğer gösterir oysa Şekil 3A iyi şişirilmiş akciğer gösterir. Şekil 3C eşikleme s için hazırlanan şişirilmiş akciğer bölümünün bir görüntü gösterirAlveoler alanlarda dım (makrofajlar beyaz boyalı, ve damarlar ve bronşlar oluşturmak için siyah boyalı. eşik adım alveol alanda tüm pikseller beyaz olduğu bir ikili görüntü oluşturur ve alveol akciğer alanlarında tüm pikseller değil ki siyah (Şekil 3D). Şekil 3E ve 3F, dikey ve yatay alveoler kiriş makro sırasıyla güç olduğunu uzunlukları göstermektedir.

Solunum fonksiyon testleri (6 ay için CS maruz C57BL / 6 WT farelerde gelişen hafif amfizem ile uyumlu akciğer elastik recoil mütevazı kaybı yansıtan döngüler basınç hacim (PV) sol mütevazı (ve istatistiksel olarak anlamlı değil) vardiya göstermek Şekil 4A). PV döngülerinde önemli sol kaymaları sadece CS veya CS-maruz C57BL / 6 ağırlık farelere göre daha şiddetli bir amfizem fenotipe sahip olan CS-maruz gen hedefli farelerde etkilerine son derece duyarlı olan fare suşlarının gözlenir.

İncirure 5 CS-maruz kalan hayvanlarda küçük hava yollarının çevresindeki ECM protein birikimi artışını gösteren 6 ay için hava (Şekil 5A) veya CS (Şekil 5B) maruz C57BL / 6 WT farelerin Masson trikrom lekeli akciğer bölümleri. Şekil temsili görüntüler gösterir 5C, bir görüntü analiz yazılım programı istenilen iç çapa sahip olan hava yolları etrafında ECM proteini birikmesini rakamlarla verilmektedir. Şekil 5D CS maruz kalan, C57BL / 6 WT farelerinde 300-899 um bir çapı olan hava yolları etrafında ECM protein birikimi ve analizini göstermektedir.

Şekil 1. tüm vücut sigara maruziyeti sisteminin bir karikatür. Bir duman maruz cihazı bir duman pozlama odasına bağlanır. Duman yan akım toplama odasına çekilir ve duman çekilirpompa ile sigara, hem de duman örnekleri karışık ve karıştırma ve seyreltme odasının (solda) ortam havası ile seyreltilmiş, ve sonra duman maruziyeti odasına akar. Araştırmacı maruz odasının (sağ) kendi kafeslerine fareler yerleştirir; fareler kendi kafeslerinde serbestçe hareket ve duman maruz kalma süresince yiyecek ve suya erişimi mümkün.

Kemirgen akciğer Şekil 2. Enflasyon. Araştırmacı bir lastik tıpa ile mühürleri, steril PBS ile bir şişeyi doldurur, ve bunu tersine çevirir ve bir halka standı kullanarak hayvanın kalbi üzerinde o 25 cm mesafe korur. Bir damardan veren seti trakeal kanül aracılığı ile akciğerlere PBS sunar. Bir cut-down serolojik pipet lastik stoper sokulur ve bu lu içine drene PBS hacmi değiştirmeniz için balona hava veriyoryerçekimi ile farelerin NGS.

Şekil 3. Amfizem analizi. (A) Gill's-leke temsili görüntü 6 ay süreyle hava veya dumanına maruz bırakılan farelerin akciğer bölümleri şişirilmiş gösterir, siyah oklar bir gemi ve makrofajların gösterir. (B) analizi için uygun olmayan bir altı şişirilmiş akciğer temsili bir görüntüsünü gösterir. (A) "önce" ve (C) Fuarlar araştırmacı bir ikili görüntünün nesil için hazırlar temsili akciğer bölümünün imajı "sonra". (A) ve (C) siyah oklar bir gemi ya işaret (araştırmacı siyah boyalar (C)) veya alveoler makrofajlar (araştırmacı beyaz boyalar (C)). (D) < Araştırmacı eşik adımını gerçekleştirir sonra / strong> ikili görüntüyü gösterir. (E) ve (F), yatay ve dikey alveoler kiriş araştırmacı sırasıyla oluşturduğu uzunlukları göstermektedir. Tüm görüntülerin Büyütme 400 mikron (A) gösterilir temsil x 200 Ölçek bar.

Şekil 4. Alveoler Kiriş uzunluğu ve basınç-hacim eğrileri. (A), 6 ay boyunca hava (n = 13) ya da CS (n = 24) maruz C57BL / 6 WT farelerinde alveoler kiriş uzunluklarının tipik analizini gösterir. Yıldız p <0.001 gösterir. (B) 6 ay boyunca hava (n = 13) ya da CS (n = 14) maruz kalan, C57BL / 6 ağırlık fareler üzerinde yapılan tipik bir PV döngüleri gösterilmektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir.

highres.jpg "/>
Şekil 5. Küçük hava yolu yeniden (SAR) değerlendirilmesi. (A) ve (B) 6 ay boyunca hava (A) ya da CS (B) 'ye maruz, C57BL / 6 farelerinden alınan WT Masson trikrom ile boyanmış akciğer kesitlerin temsili görüntüleri gösterir. Görüntü analiz yazılımı CS-maruz kalan farelerde SAR analiz nasıl (C) gösterir. (D), (n = 16), 6 (n = 11), hava ile temas, C57BL / 6 WT farelerinde 300-899 m arasında bir çapa sahip olan, küçük hava yolları etrafında biriken hücre dışı matris protein tabakasının kalınlığı tipik ölçümleri göstermektedir veya CS ay. Veriler ortalama ± SEM ve yıldız işareti olarak ifade edilmiştir p <0.05 gösterir.

Ölçek çubukları her akciğer bölümünün görüntüleri gösterilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whole-body smoke exposure device	Teague Enterprise	TE-10z	Chronic Smoke exposures to induce chronic lung disease in mice
Research Cigarette	University of Kentucky	3R4F reference cigarettes
Pallflex® Air Monitoring Filters, Emfab Filters TX40HI20WW, 25 mm	Pall Corporation	7219	For measurement of TPMs
25 mm filter holder	Pall Corporation
Filter sampler	Intermatic	Metal T100
Gas meter	AEM	Gas meters G1.6; G2.5; G4
Tracheal Cannula for mouse 18 gauge	Labinvention		Analysis of pulmonary function
Mechanical ventilator	Scireq	FlexiVent
Gill's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GSH316	For Gill staining, work under a fume hood
Hematoxylin solution, Harris modified	Sigma-Aldrich	HHS16
Cytoseal-60	Thermo Scientific	8310-16
Micro-Slide-Field-Finder	Andwin Scientific INC	50-949-582	For analysis of emphysema
Scion Image Program	Scion Corporation
Mason's trichrome stain	Sigma-Aldrich	HT15	For analysis of small airway fibrosis
MetaMorp Offline version 7.0	Molecullar Devices LLC	31032