3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected Published: December 9, 2014 doi: 10.3791/52237

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Carla M. Cabral¹, Anita A. Koshy^1,2,3

¹Bio5 Institute, University of Arizona, ²Department of Neurology, University of Arizona, ³Department of Immunobiology, University of Arizona

Summary

Met dit protocol, konden we beeld 160 pm dikke hersencoupes van muizen geïnfecteerd met de parasiet Toxoplasma gondii, die visualisatie en analyse van de ruimtelijke relatie tussen de encysting parasiet besmette neuron maakt.

Abstract

Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire parasiet met een breed gastheerbereik, waaronder mensen en knaagdieren. In zowel mensen als knaagdieren, Toxoplasma wordt een levenslange persistente infectie in de hersenen. Hoewel deze hersenen infectie asymptomatisch meeste immunocompetente mensen, voor de foetus of immuungecompromitteerde personen, zoals verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) patiënten deze voorkeur voor en persistentie in de hersenen kan leiden tot verwoestende neurologische ziekte. Het is dus duidelijk dat de hersen- Toxoplasma interactie is essentieel voor de symptomatische ziekte door Toxoplasma, maar we hebben weinig begrip van de cellulaire en moleculaire interacties tussen cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en de parasiet. In het muismodel van CNS toxoplasmose het is bekend dan 30 jaar dat neuronen de cellen waarin de parasiet aanhoudt, maar weinig informatie beschikbaar over welkedeel van het neuron wordt over het algemeen besmet (soma, dendriet, axon) en als dit cellulaire relatie verandert tussen stammen. Deels dit gebrek ondergeschikt is aan de moeilijkheid van beeldvorming en visualiseren gehele geïnfecteerde neuronen van een dier. Dergelijke beelden zou vergen doorgaans seriële snijden en stikken van weefsel in beeld gebracht met behulp van elektronenmicroscopie of confocale microscopie na immunostaining. Door het combineren van verschillende technieken, de hier beschreven werkwijze maakt het gebruik van dikke secties (160 urn) te identificeren en het gehele cellen die cysten bevatten, zodat driedimensionale visualisatie en analyse van individuele, chronisch geïnfecteerde neuronen zonder immunokleuring, elektronenmicroscopie , of seriële snijden en stikken. Met deze techniek kunnen we beginnen de cellulaire relatie tussen de parasiet en de geïnfecteerde neuron begrijpen.

Introduction

Het algemene doel van deze methode is in een hoge resolutie, drie-dimensionale beelden van individuele neuronen die zijn geïnfecteerd met het obligate intracellulaire parasiet Toxoplasma gondii verkrijgen.

Toxoplasma wordt vaak beschouwd als een van de meest succesvolle parasieten vanwege zijn grote tussengastheer serie, die mensen en knaagdieren bevat. Bij zowel mensen en knaagdieren, na acute infectie door het eten van besmet voedsel of water, Toxoplasma is in staat om een persistente infectie van het CZS veroorzaakt door het omzetten van zijn snelle replicerende vorm (de tachyzoite) om de trage-vermeerderingsfase encysting vorm (de bradyzoite ). In immuuncompetente individuen, wordt dit latente CNS infectie gedacht relatief asymptomatisch zijn, maar in immuungecompromitteerde personen zoals AIDS patiënten of ontvangers, kan weer uitbreken van de parasiet tot fatale encefalitis toxoplasmic ^1,2. Daarnaast recente studies have aangetoond dat latente infectie met Toxoplasma kan leiden tot gedragsveranderingen bij knaagdieren ^3,4, hoewel het mechanisme blijft onbekend.

Verrassend, ondanks deze gegevens benadrukken het belang van het CNS- Toxoplasma interactie, relatief weinig bekend is over deze relatie, in het bijzonder op cellulair en moleculair niveau. De mogelijkheid om zelfs eenvoudige aspecten van de interactie hersenen-parasiet bestuderen is deels belemmerd door technologische beperkingen. Bijvoorbeeld, het merendeel van het werk blijkt dat neuronen de cellen waarin cysten blijven is gedaan met elektronenmicroscopie (EM) ^5,6. Hoewel EM geeft hoge resolutie, het is tijdrovend, arbeidsintensief en duur. Immunofluorescentie (IF) assays zijn onlangs gebruikt in combinatie met confocale microscopie met het werk van EM ⁷ bevestigen. IF testen zijn technisch eenvoudig uit te voeren en relatief goedkoop, maar met behulp van deze technieken understand de ruimtelijke relatie tussen de cyste en de besmette neuron vereist seriële reconstructie, dat is tijdrovend, technisch moeilijk, en kan leiden tot verlies van waardevolle informatie. Aldus hebben we een methode die kan worden gebruikt met het muismodel van CNS toxoplasmose en laat ons beeld de gehele geïnfecteerde neuronen zonder EM of immunohistochemie (IHC) ontwikkeld. Door het ontwikkelen van een dergelijke techniek, kunnen we beginnen de cellulaire relatie tussen de geïnfecteerde cel en de cyste in een relatief snelle en goedkope wijze verkennen.

De methode die we ontwikkeld combineert nieuwere technieken voor het optisch clearing en imaging dikke hersensecties door confocale microscopie ⁸ met een systeem dat markeert in vivo cellen die zijn ingespoten met parasiet eiwitten ^9,10. In dit systeem infecteren we Cre-reporter muizen die een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie na Cre gemedieerde recombinatie ¹¹ met Toxoplasma 9. Deze combinatie stelt ons in staat om de geïnfecteerde muizenhersenen oogsten na CNS infectie is vastgesteld, snijd dikke hersenen secties, en snel te identificeren relevante gebieden om het beeld door het vinden van de RFP ⁺ cysten. Het is belangrijk op te merken dat als gastheercel expressie van GFP alleen afhankelijk injectie van Cre door parasieten, en niet op infectie, een aantal GFP ⁺ cellen niet parasieten ¹⁰ bevatten. Als het doel van dit protocol is om te kunnen het hele geïnfecteerde neuronen, de focus is alleen op GFP ⁺ neuronen die ook een RFP ⁺ cyste bevatten, maar het protocol kan ook worden gebruikt voor het imago van de GFP ⁺ / RFP ^- neuronen.

Zodra de besmette hersenen wordt geoogst en gesegmenteerd, worden de secties transparant gemaakt door glycerol clearing. Geschikte gebieden van de secties worden vervolgens afgebeeld met confocale microscopie, algende ongekende visualisatie van geïnfecteerde gastheercellen en de ingekapselde parasieten in hun geheel. Hier bieden we een compleet protocol voor het identificeren, optisch clearing, en imaging geïnfecteerde neuronen.

Protocol

OPMERKING: De muizen werden gekweekt en onderhouden in een constante temperatuur en vochtigheid kamer met 12 uur teruggedraaid licht / donker cycli met voedsel en water ad libitum beschikbaar aan de Universiteit van Arizona. Experimenten werden uitgevoerd onder de richtsnoeren en de goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Arizona. Alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. De Cre-reporter muizen op een C57BL / 6 achtergrond ¹¹ en zijn commercieel verkrijgbaar.

1. Mouse Infectie

OPMERKING: De werkwijze muis infectie met Toxoplasma gondii hieronder beschreven is gebruikt in studies eerder gepubliceerd ^10-12.

1. Groei Toxoplasma stammen in humane voorhuid fibroblasten (HFFS) gekweekt in Dulbecco's hoog glucosegehalte Modified Eagles Medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS, 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycin, en 2 mM L-glutamine (cDMEM) in een T-25 kolf in een 5% _CO2 incubator tot parasieten gevormd parasitophorous grote vacuolen.
2. Spuit afgifte parasieten door schrapen cellen van de bodem van de kolf en de gevormde oplossing door een 25 gauge naald verbonden met een injectiespuit 3 ml 2 keer in de kolf vervolgens overbrengen all oplossing een 5 ml injectiespuit geval verbonden met een 27 gauge naald die is ondersteboven in een 15 ml conische buis geplaatst. Sluit de plunjer aan de spuit en laat de parasiet oplossing in de conische buis.
3. Centrifugeer het buisje gedurende 10 minuten bij 300 x g. Zuig het supernatant resuspendeer dan de pellet in 4-6 ml steriele USP 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 (voorraadoplossing).
4. Plaats een hemocytometer met 10 ul van stockoplossing, wacht 5-10 minuten voor de parasieten om vervolgens af te wikkelen tel het aantal parasieten in de vier hoeken en in het midden pleinen van de middelste grote plein.
5. Verdunnen paraplaatsen passende inoculum van 100K / 200 pl 1x PBS injecteer dan muizen intraperitoneaal (ip) met een totaal volume van 200 ui.
   LET OP: Voor deze procedure werden muizen geënt met 100K Type III (CEP) ¹³ tachyzoiten in 200 ul 1x PBS. Wanneer infecteren muizen met andere stammen van Toxoplasma, moet concentratie entmateriaal worden aangepast om rekening te houden niveau van virulentie.

2. perfusie en Brain Oogsten

Opmerking: Dit protocol werd uitgevoerd op 21 dagen na infectie (dpi) aangezien dit het tijdstip waarop piek aantal cysten worden gevonden in muizenhersenen, maar andere tijdstippen worden gebruikt. Grootte, aantal, plaats, en de aanwezigheid of afwezigheid van cysten afhankelijk van vele factoren zoals muizenstam, parasiet stamtype als inoculum ^{7,14 - 17.} Onderzoekers zullen moeten individueel bepalen van de juiste entstof voor de muis en Toxoplasma stam hij / zij gebruikt.

1. Setup alle chirurgische oogst gereedschap (figuur 1).
2. Voor elke muis, voor te bereiden en te houden op het ijs: 20ml spuit gevuld met 0,9% natriumchloride (NaCl) + 10 U / ml Heparine in 1x steriele USP PBS (Heparine / Saline); 20 ml spuit gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA); Scintillatieflesje met 15 ml 4% PFA. Voor meerdere muizen, bereiden een beker gevuld met het volledige bedrag van elke oplossing nodig voor alle muizen dan het opstellen van een nieuwe spuit vol oplossing voor elke perfusie.
3. Verdoven de muis ip met 200 gl / 25 g lichaamsgewicht ketamine / xylazine cocktail (24 mg / ml en 4,8 mg / ml) op de dag van belang. Toezien op de muis voor het niveau van de anesthesie door het controleren teen knijpen reflex. Ga verder met het protocol slechts een keer met de muis geeft geen reactie op een stevige teen knijpen.
   OPMERKING: Andere methoden van anesthesie kan worden gebruikt, voor het passende niveau van anesthesie alvorens wordt bereiktverder te gaan met het protocol.
4. Plaats de muis in rugligging op het overdekte schuim platform. Pin alle vier de ledematen uit de voeten dan spuit de borst en de buik met 70% ethanol (EtOH) (Figuur 2A). Toevoeging van verscheidene steriele papieren handdoeken onder de muis kan worden gebruikt om te absorberen overloop van perfusie vloeistoffen.
5. Lift huid net onder het borstbeen met een tang en gebruik dan een schaar om een ​​incisie te maken. Trek de huid terug naar de borst (Figuur 2B) bloot.
6. Til zwaardvormig proces en maakt een incisie in de buik net onder het middenrif, het blootstellen van de lever, die botweg uit de buurt van het middenrif wordt ontleed. Maak twee insnijdingen, één links en één rechts door het membraan en de onderzijde van de ribben. Verleng de links en rechts incisies ongeveer 1 / 2-2 / 3 weg omhoog de ​​ribbenkast, die vervolgens wordt teruggekaatst naar de borstholte (figuur 2C) te openen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat alle organen snijden of grote bloedvaten during van deze procedure zo te doen zal de kwaliteit van de perfusie in gevaar brengen.
7. Perfuse transcardiaal met 10-20 ml Heparine / Saline, gevolgd door 10-20 ml 4% PFA.
   OPMERKING: Als de perfusie naar behoren wordt gedaan, zal de lever van rood naar bruinen (figuur 2D). Als dit niet goed gebeurt, zal de bloedvaten zichtbaar (Figuur 2E) zijn.
8. Draai de muis op zijn buik, re-pins voeten dan spuit hoofd en hals met 70% EtOH. Til huid van de basis van de nek en een insnijding. Verwijder het vel om de schedel (figuur 2F) bloot. Onthoofden hoofd op het niveau van de schouders. Verwijder de schedel, verwijder voorzichtig de hersenen, en leg het in een scintillatieflesje gevuld met 4% PFA (figuur 2G-H).
   OPMERKING: Als goed doorbloed, zullen de hersenen wit met geen zichtbare bloedvaten (figuur 2I) verschijnen. Als de hersenen niet goed doorbloed, zullen de bloedvaten zichtbaar (Figuur 2J) zijn.
9. Plaats de Scintillatie flacon hersenen in 4% PFA bij 4 ° C overnacht, onder tegen licht. Spoel de hersenen in niet-USP 1x PBS en de overdracht naar een nieuwe scintillatieflesje gevuld met gekoelde 1x PBS. Bewaar de hersenen in 1x PBS bij 4 ° C, afgedekt tegen licht.
   OPMERKING: Succesvolle clearing en imaging is bereikt met secties opgeslagen in 1x PBS voor maximaal een maand, maar het is het beste om deel van de hersenen binnen een paar dagen als langdurige opslag in PBS zal de PFA fixatie te keren en zou kunnen leiden tot minder dan optimale beelden . Autofluorescentie en toegenomen onscherpte zijn opgemerkt in sommige secties afgebeeld na opslag in 1x PBS gedurende een maand of langer.

3. Brain-Sectie

1. Verwijder de hersenen van 1x PBS en plaats deze in een brain-matrix (figuur 3A) te zorgen voor meer nauwkeurige en zelfs dwars door de hersenen. Snijd het cerebellum en olfactorische bollen, indien aanwezig, en knip dan de hersenen coronaalwaarts in 2 of 3 delen.
   
2. Bevestig elke sectie hersenen op een exemplaar montage blok met cyanoacrylaat. Plak een klein blok van 5% agarosegel achter de sectie hersenen voor ondersteuning (figuur 3B).
   OPMERKING: Andere ondersteunende mechanismen kunnen worden gebruikt, maar zonder steun kunnen de Vibratome duwen de hersenen veroorzaakt ongelijke snijden.
3. Snijd weefsel in 160 urn (werkafstand van de doelstelling voor imaging) dikke secties met Vibratome ingesteld op een snelheid van 4 en amplitude 9.
   OPMERKING: De instellingen voor snelheid en amplitude kunnen worden aangepast afhankelijk van de machine wordt gebruikt om zelfs verkrijgen glad secties. Als de instellingenniet correct is, kan het gevolg zijn oneffenheden, scheuren van weefsel of kerven.
4. Verzamel materiaal secties in een scintillatieflesje gevuld met verse, gekoelde 1x PBS als ze gaan binnen een week te worden ontruimd. Indien delen niet gaan binnen een week te worden ontruimd, plaats secties in 1,5 ml microcentrifugebuisjes gevuld met cryopreservative oplossing en bewaar bij -20 ° C.

4. Optische Clearing van Brain Tissue secties

LET OP: Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerde methode ^8.

1. Bereid 25%, 50%, 75% en 90% vol / vol glycerol in 1x PBS + 2% Tween-20 (Gl / PBST).
2. Verwijder secties van 1x PBS of, indien in cryopreservative, spoel in 1x PBS en over te dragen aan een scintillatieflesje met 10 ml van 25% Gl / PBST. Plaats flacon op een schudder bij 4 ° C, onder blootstelling aan licht gedurende 12 uur.
3. Bevestigen dat alle secties gezonken naar de bottom van de flacon. Zuig het 25% Gl / PBST, waardoor er net genoeg ter dekking van de secties vul dan de flacon met 10 ml 50% Gl / PBST en plaats op een schudder bij 4 ° C, bedekt tegen blootstelling aan licht, gedurende 12 uur. Herhaal dit proces voor de 75% Gl / PBST dan de 90% Gl / PBST. Verlaat secties in de 90% Gl / PBST gedurende 24 uur tot maximaal clearing te bereiken. In de loop van de clearing proces, observeren geleidelijke optische clearing (figuur 4).
   OPMERKING: Dit proces kan worden versneld als oplossingen worden veranderd onmiddellijk na secties gezonken naar de bodem van de flacon. In 75% en 90% oplossingen zullen gedeelten niet helemaal naar de bodem van de flacon maar zal drijven in het midden.

5. Montage Brain Tissue secties

1. Snijd een No. 1.5 dekglaasje in 5 stukken naar een spacer te creëren. Gebruik een liniaal en gediamanteerde potlood om te scoren en breek het dekglaasje langs de stippellijnen in figuur 5A. Discard thij midden stuk, schik de 4 buitenste stukken op een vlakte glasplaatje om een venster te maken, en dan borstel duidelijke nagellak op de naden om de stukken van de afstandhouder houden aan de dia in de juiste configuratie (Figuur 5B).
   OPMERKING: De spacer wordt gebruikt om de nodige ruimte tussen de schuif en het dekglaasje voor montage van de gewist secties creëren. Het dekglaasje kan op verschillende manieren in elk formaat venster noodzakelijk maken worden gesneden. Voorgesneden schuim afstandhouders zijn ook commercieel verkrijgbaar. Toe te staan ​​nagellak goed drogen, is het het beste om dia's met afstandhouders te maken ten minste een dag voorafgaand aan de montage van secties.
2. Transfer secties om een ​​dia met behulp van een plastic overdracht pipet met de punt afgesneden. Zorg ervoor dat in de omgeving te vullen met 90% Gl / PBST. Verlagen van een dekglaasje over de secties en zorg ervoor dat er geen luchtbellen te introduceren zorgvuldig. Overtollige Gl / PBST kan weg worden wicked met een niet-pluizende vegen.
3. Afbeelding GFP ⁺ neuronen bevatten RFP ⁺ (figuur 7A-B) dan bergen slides plat en bedekt tegen licht bij 4 ° C.
   OPMERKING: U afdichting glijdt volledig rond alle randen op te slaan en in beeld gebracht op een later tijdstip. Het gebruik van duidelijke nagellak aan dia verzegelen is optioneel en kan het moeilijker maken om dekglaasje te verwijderen als men secties van de dia te verwijderen op een later tijdstip voor verdere verwerking.

6. Imaging

OPMERKING: Elke microscoop kan worden gebruikt, dat de mogelijkheid van het verkrijgen van een hoge resolutie z-stacks heeft.

1. Na aanvankelijk het vinden van de focal plane op 10X, veranderen in een 20X objectief en scannen via de sectie om een cyste zich in een GFP ⁺ cellen te identificeren. Centreer het gebied van belang (ROI) in het gezichtsveld.
2. Veranderen naar een 40X objectief. Focus op en neer door het hele ROI om ervoor te zorgen dat de gehele cel en cyst zijn zichtbaar.
   OPMERKING: Beelden werden verkregen met een confocale microscoop met een 40X / 1.30 Oil DIC M27 doelstelling.
3. De geïnstalleerde beeldverwerkingssoftware verkrijgen z-stack die de gehele cel cysten bevat. Gemiddeld gebruikt om beelden te verkrijgen instellingen worden getoond in figuur 6.
   Opmerking instellingen moet worden aangepast afhankelijk per onderzoekers weefselsecties en microscoop mogelijkheden.
4. Een maximale projectie beeld van de z-stack te krijgen door het instellen van het aantal projecties op 1. Zorg voor een volledige rotatie zicht door het instellen van het aantal projecties tot 64.
   OPMERKING: Andere softwarepakketten beschikbaar en kunnen worden gebruikt om maximale projectie verkrijgen, rotatie en andere uitzicht z-stack afbeeldingen.
5. Afbeelding analyseren met beeldvorming analyse software.

Representative Results

Figuur 7 omvat representatieve beelden van twee cyste bevattende GFP ⁺ neuronen van twee 160 urn dikke secties en een representatieve meting van de afstand van cyste-cel-orgaan Figuur 7B. Figuren 7 A en B illustreren dat deze nieuwe protocol maakt visualisatie van de geïnfecteerde neuron in zijn geheel. Figuur 7C toont dat bij deze beeldvormende techniek is het nu mogelijk om de afstand tussen de cyste en het cellichaam (Imaris 7.7) kwantificeren. Figuur 7D is een volledige rotatie van figuur 7B. Visualisatie van de z-stack op deze wijze zorgt voor de verificatie van de totale opname van de cel en cyste. Figuur 7E is een 3D rotatie film zien hoe het beeld van 7D kan worden geanalyseerd door Imaris 7.7 software om de afstand van de cyste meten de cel lichaam ofwel van middle-to-middle or edge-to-edge. Hoewel de getoonde meting werd uitgevoerd met een rechte lijn tussen de cyste en het cellichaam, een meting na de eigenlijke GFP ⁺ proces om het cellichaam kunnen ook worden gegenereerd (gegevens niet getoond).

Figuur 1: Chirurgische apparatuur voor het verwijderen van de hersenen van muizen. (A) absorberende pad. (B) Blokschuim. (C) Naalden te pinnen voeten. (D) 25 G Blood collectie set. (E) 3-weg kraan. (F) 20 ml spuit voor Heparine / Saline. ( G) 20 ml spuit voor 4% PFA. (H) Duim tang. (I) Fijn schaar, schuin naar rechts, scherpe-scherp. (J) Sharp-scherpe schaar. (K) Kelly arterieklem. (L) Mayo schaar. (M) (N) scintillatieflesje voor 4% PFA. Schaal bar = 8 cm.

Figuur 2: Het oogsten van de hersenen van muizen. (A) Muis vastgepind en borst besproeid met 70% EtOH. (B) Exposed borst. (C) borstholte geopend. (D) van de lever na een goede doorbloeding. (E) van de lever na onjuiste perfusie. (F) Exposed schedel. ( G) Brain met de helft van de schedel verwijderd. (H) Geoogst hersenen in flacon gevuld met 4% PFA. (I) Brain na een goede doorbloeding. (J) Brain na onjuiste perfusie.

Figuur 3: Snijden hersenen van muizen. (A) Muis hersenen Matri x. (B) Muis hersenen en agarose gel aangebracht op de montage blok met cyanoacrylaat binnenkant Vibratome kamer gevuld met gekoelde 1x PBS.

Figuur 4: Het wissen van proces Vertegenwoordiger beelden van een sectie muis hersenen tijdens elke stap van het clearing proces..

Figuur 5: Het snijden en de vaststelling spacer te glijden. Een no. 1.5 dekglaasje met representatieve cijfers voor het snijden van dekglaasje in 5 stukken. B. Vlakte glasplaatje met elk stuk gesneden dekglaasje geplakt op zijn plaats met duidelijke nagellak om een ​​venster te maken.

2237 / 52237fig6highres.jpg "/>
Figuur 6: Scherm schot van algemene parameters die worden gebruikt voor het verwerven.

Figuur 7:. Toxoplasma gondii cysten kunnen binnen verre neuronale processen wonen (AB) Maximale projectie beelden van GFP ⁺ neuronen bevatten RFP ⁺ cysten (witte pijlen). Schaalbalk = 20 um. (CE) aanvullende visualisatie en analyse van de cyste-neuron relatie getoond in B. (C) Imaris gegenereerde directe online meten van de afstand van de rand van de cyste aan de rand van het cellichaam (149μm ). (D) 3-D roterende film . (E) Imaris gegenereerdewww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figuur 7E.avi "target =" _ blank "> 3-D film toont cyste-tot-cel-lichaam meten van zowel midden-tot-midden (163 micrometer) en edge-to-edge (149 micrometer).

Discussion

Aangezien cellulaire veranderingen in geïnfecteerde gastheercellen zijn gekoppeld aan de ziektebeelden bij infecties met andere intracellulaire organismen zoals HIV, hondsdolheid en Chlamydia ^18,19, ontwikkelden we een techniek waarmee we de intieme interacties die optreden tussen de CNS bestuderen gastheercel en Toxoplasma. De hier beschreven methode Dit doel wordt bereikt doordat efficiënte beeldvorming van chronisch geïnfecteerde neuronen. Voorafgaand aan de ontwikkeling van deze methode, zoals beeldvorming was tijdrovend, duur of onmogelijk.

We kunnen nu gebruik maken van deze techniek om fundamentele vragen over de Toxoplasma -neuron interactie, zoals zijn specifieke neuronale gebieden het doelwit van de parasiet te beantwoorden? Verschilt dit tussen Toxoplasma stammen? Doe de cellulaire gebieden waarin de cyste bevindt verschillen van de rest van cel (dwz geïnfecteerd.Voer en geïnfecteerde dendrieten uit hetzelfde neuron hetzelfde aantal stekels)? Wat zijn de cellulaire kenmerken gedeeld door besmet neuronen? De mogelijkheid om dergelijke vragen te beantwoorden is essentieel om te begrijpen hoe Toxoplasma-infectie verandert het centrale zenuwstelsel, waaronder op het niveau van gedrag.

Om de best mogelijke beelden te verkrijgen, is het zeer belangrijk dat het weefsel wordt gesneden in gelijke delen. Wanneer de elementen ongelijk gaat het dekglaasje niet goed zitten op het gedeelte leidt tot ongelijke contact met de doelstelling leidt tot sub-optimale beeldvorming. Tijdens het optimaliseren van dit protocol, werden verschillende wijzigingen aangebracht. De originele zuiveringsproces werd met fructose in een poging getoond in een techniek die SeeDB ²⁰ resultaten reproduceren. Deze methode was niet verenigbaar met dit model als het uitgeblust de RFP (specifiek mCherry). Een andere belangrijke stap en waarschijnlijk het belangrijkste van alles is mogelijk voor een maximale clearing van weefsel secties. Als dit niet goed gewist, zal de achtergrond licht diffractie hoger zijn enbeelden worden luidruchtig. We vonden dat toevoeging van Tween-20 aan het glycerol gaf een enigszins helderder beeld dan glycerol alleen. De huidige technologie stelt ons in staat om z-stack beelden te verkrijgen door middel van 160μm dik hersenweefsel secties, maar in de toekomst, zijn we op zoek naar deze dikte te verhogen tot 500 micrometer of meer toe te staan ​​voor nog meer diepgaande analyse.

Het is alleen door te kijken naar de gehele cel en zijn verbindingen die we kunnen beginnen met een mechanistische idee van hoe de hersenen wereldwijd wordt beïnvloed door Toxoplasma ontwikkelen. Dit nieuwe protocol biedt een kans om de Toxoplasma -neuron interactie studeren aan de single cell niveau en doen dat in een snelle, zuinige manier. We moeten nog alle mogelijke toepassingen onderzoeken van dit protocol en hoe het kan vertalen naar andere systemen, maar we verwachten zal meerdere toepassingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible