ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
השימוש בפרוטוקול זה, הצלחנו חלקים במוח העבה מיקרומטר 160 תמונה מעכברים נגועים בטפיל טוקסופלזמה גונדי, המאפשר הדמיה וניתוח של היחסים מרחביים בין טפיל encysting ונוירון הנגוע.
Abstract
Toxoplasma gondii הוא טפיל לחייב, תאית עם מגוון רחב מארח, כולל בני אדם ומכרסמים. בשני בני האדם ומכרסמים, Toxoplasma קובע זיהום מתמשך לכל החיים במוח. בעוד זיהום מוח זה הוא ללא תסמינים ברוב האנשים עם מערכת חיסון, בעובר המתפתח או אנשים מדוכאי חיסון כגון תסמונת כשל חיסוני נרכשת חולים (איידס), נטייה זו ולהתמדה במוח יכול להוביל למחלות נוירולוגיות הרסניות. לפיכך, ברור כי האינטראקציה Toxoplasma המוחין היא קריטית למחלה סימפטומטית המיוצרת על ידי Toxoplasma, עדיין יש לנו מעט הבנה של האינטראקציה הסלולרית או מולקולרית בין התאים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) וטפיל. במודל העכבר של מערכת העצבים המרכזית טוקסופלזמוזיס זה כבר ידוע במשך 30 שנים שהנוירונים הם התאים שבו הטפיל נמשך, אך מעט מידע זמין על שחלק מתא העצב בדרך כלל נגוע (סומה, דנדריט, אקסון) ואם מערכת יחסים סלולריים זה משתנה בין זנים. בחלקו, חוסר זה הוא משניים לקושי של הדמיה חזותי נוירונים נגועים כולו מבעלי חיים. תמונות כאלה בדרך כלל ידרשו חתך ותפרים של רקמה צילמה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים או confocal לאחר immunostaining סדרתי. על ידי שילוב של מספר טכניקות, השיטה המתוארת כאן מאפשרת השימוש בחלקים עבים (160 מיקרומטר) כדי לזהות ותאי תמונה שלמה המכילים ציסטות, המאפשר הדמיה וניתוח של נוירונים בודדים, נגועים כרוני תלת-ממדיים ללא הצורך בimmunostaining, מיקרוסקופיה אלקטרונית , או חתך סידורי ותפרים. שימוש בטכניקה זו, אנו יכולים להתחיל להבין את הקשר בין סלולארי הטפיל ונוירון הנגוע.
Introduction
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשיג ברזולוציה גבוהה, תמונות תלת ממדיות של נוירונים בודדים שנדבקו בטפיל תאיים לחייב Toxoplasma gondii.
Toxoplasma נחשב לאחד מהטפילים המצליחים ביותר לעתים קרובות בגלל מגוון הגדול שלה ביניים מארח, הכולל בני אדם ומכרסמים. בשני בני אדם ומכרסמים, לאחר זיהום חריף בבליעה של מזון או מים מזוהמים, Toxoplasma הוא מסוגל לגרום לזיהום מתמשך של מערכת העצבים המרכזית על ידי המרה מצורתו מהירה משכפלת (tachyzoite) לאיטי המשכפל וencysting טופס (bradyzoite ). אצל אנשים עם מערכת חיסון תקינים, הוא חשב זיהום במערכת העצבים המרכזית סמוי זה להיות יחסית ללא תסמינים, אבל אצל אנשים מדוכאי חיסון כגון חולי איידס או מושתלים, התפרצות מחודשת של הטפיל עלולה לגרום לדלקת קרום מוח toxoplasmic הקטלנית 1,2. בנוסף, מחקרים שנעשה לאחרונה חההוכיח כי זיהום סמוי עם Toxoplasma יכול להוביל לשינויים התנהגותיים במכרסמים 3,4, אם כי המנגנון אינו ידוע.
באופן מפתיע, למרות נתונים אלה מדגישים את החשיבות של האינטראקציה CNS- Toxoplasma, קטן יחסית ידוע על הקשר הזה, במיוחד ברמה התאית ומולקולרית. היכולת ללמוד היבטים אפילו פשוטים של האינטראקציה המוח-טפיל כבר הקשתה בחלקו על ידי מגבלות טכנולוגיות. לדוגמא, רוב העבודה שהראה כי תאי עצב הם התאים שבי ציסטות להתמיד נעשתה עם מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) 5,6. למרות EM נותן ברזולוציה גבוהה, שזה זמן רב, עבודה אינטנסיבית, ויקר. לאחרונה Immunofluorescence מבחני (IF) היו בשימוש בשילוב עם מיקרוסקופיה confocal כדי לאשר את העבודה שנעשתה על ידי 7 EM. אם מבחני הם קלים מבחינה טכנית לבצע וזולים יחסית, אך תוך שימוש בטכניקות אלה לאחורייםtand הקשר המרחבי בין ציסטה ונוירון הנגוע דורש שיקום סדרתי, שזה זמן רב, קשה מבחינה טכנית, ועלול להוביל לאובדן של מידע בעל ערך. לפיכך, פיתחנו שיטה שיכול לשמש עם מודל העכבר של טוקסופלזמוזיס CNS ומאפשרת לנו תמונת השלמות של תאי עצב נגועים ללא EM או אימונוהיסטוכימיה (IHC). על ידי פיתוח טכניקה כזו, אנחנו יכולים להתחיל לחקור את מערכת היחסים בין סלולארי התא הנגוע וציסטה באופן מהיר יחסית ולא יקר.
השיטה שפיתחנו משלבת טכניקות חדשות לסליקה אופטית וחלקים במוח עבים הדמיה על ידי מיקרוסקופ confocal 8 עם מערכת שמסמנת בתאי vivo שכבר הזריקו עם חלבוני טפיל 9,10. במערכת זו, אנו להדביק עכברי Cre-כתב שמבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) רק לאחר Cre בתיווך רקומבינציה 11 עם Toxoplasma 9. שילוב זה מאפשר לנו לקצור את מוח העכבר הנגוע לאחר הדבקת CNS הוקמה, לחתוך חלקים במוח עבים, ולזהות במהירות אזורים רלוונטיים לתמונה על ידי מציאת RFP + ציסטות. חשוב לציין כי כביטוי תא המארח של GFP תלוי אך ורק בהזרקה של Cre על ידי טפילים, ולא על זיהום, מספר תאי GFP + אינם מכיל טפילי 10. כמטרה של פרוטוקול זה היא להיות מסוגל נוירונים נגועים תמונה כולה, הדגש הוא רק על GFP + תאי עצב שמכיל גם RFP + ציסטה, אלא גם את הפרוטוקול יכול לשמש לתמונת GFP + / RFP - נוירונים.
ברגע שהמוח הנגוע שנקטפו ומחולק, הקטעים ניתנים על ידי שקופים סליקת גליצרול. אזורים מתאימים סעיפים לאחר מכן צילמו עם מיקרוסקופ confocal, אלהדמיה חסרת תקדים געיית תאי מארח נגועים וטפילי ביצת הקיימא בשלמותם. כאן אנו מספקים פרוטוקול מלא לזיהוי, סליקה אופטית, ונוירונים הדמיה נגועה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עכברים גדלו ומתוחזק במבוקר חדר טמפרטורה ולחות עם 12 שעות התהפכו מחזורי אור / חושך עם אוכל וכרצונך מודעה זמין מים באוניברסיטת אריזונה. ניסויים נערכו בהתאם להנחיות ואישור ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת אריזונה. כל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. עכברי Cre-הכתב הם על C57BL / 6 רקע 11 והם זמינים באופן מסחרי.
1. זיהום עכבר
הערה: השיטה של זיהום עכבר עם gondii Toxoplasma המתואר להלן נעשתה שימוש במחקרים שפורסמו בעבר 10 - 12.
- לגדול זני Toxoplasma בבני עורלת fibroblasts (HFFs) בתרבית הגבוה גלוקוז השתנה Dulbecco נשרים בינוניים (DMEM) בתוספת 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, 100 מ"ג / מיליליטר streptomycin, ו- L-גלוטמין 2 מ"מ (cDMEM) בבקבוק T-25 בתוך 5% CO 2 באינקובטור עד טפילים יצרו vacuoles parasitophorous הגדול.
- טפילי מזרק-שחרור על ידי גירוד תאים מהחלק התחתון של הבקבוק ועובר פתרון שהתקבל באמצעות מחט 25 מד מחוברת למזרק 3 מיליליטר 2 פעמים בתוך הבקבוק ולאחר מכן להעביר את כל הפתרון למקרה מזרק 5 מ"ל מחובר למחט 27 מד ש הושם במהופך בתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. חבר את בוכנת המזרק ולהעביר את הפתרון הטפיל לתוך צינור חרוטי.
- צנטריפוגה הצינור במשך 10 דקות ב 300 x גרם. לשאוב supernatant אז resuspend גלולה בpH 4-6 הכיתה USP מיליליטר סטרילי 1x בופר פוספט (PBS) 7.4 (פתרון במלאי).
- לטעון hemocytometer עם 10 μl של פתרון מניות, לחכות 5-10 דקות לטפילים להתיישב אז לספור את מספר הטפילים בארבעת ריבועי פינה ומרכז הכיכר הגדולה באמצע.
- לדלל paraאתרים לגודל הבידוד מתאים של 100K / 200 μl 1X PBS אז להזריק עכברי intraperitoneally (IP) בהיקף כולל של 200 μl.
הערה: להליך זה, עכברים מחוסן עם 100K סוג III (CEP) 13 tachyzoites ב200 μl 1x PBS. כאשר מדביקים עכברים עם זנים אחרים של Toxoplasma, ריכוז של הבידוד ייתכן שיצטרך להיות מותאם לדין וחשבון על רמת האלימות.
2. זלוף וקציר המוח
הערה: פרוטוקול זה נערך על 21 ימים לאחר פגיעה (dpi) כמו זה מייצג את נקודת הזמן שבו מספרי שיא של ציסטות נמצאים במוח העכבר, אך ניתן להשתמש בי נקודות זמן אחרות. גודל, מספר, מיקום, ונוכחות או עדר של ציסטות תלויות בגורמים רבים, כולל זן עכבר, סוג זן טפיל, כמו גם גודל הבידוד 7,14 - 17. חוקרים יצטרכו לקבוע את הבידוד המתאים לעכבר וToxoplas בנפרדמתח ma הוא / היא משתמשת.
- כל הכלים ההתקנה הניתוחיים קצירה (איור 1).
- עבור כל עכבר, להכין ולשמור על קרח: מזרק 20ml מלא בשיעור של 0.9% נתרן כלוריד (NaCl) + 10 U / ml הפרין בכיתה USP סטרילי 1X PBS (הפרין / מלוח); מזרק 20 מיליליטר מלא עם 4% Paraformaldehyde (PFA); בקבוקון נצנץ עם 15 מיליליטר PFA 4%. לעכברים מרובים, להכין כוס מלאה את כל הסכום של כל פתרון נחוץ לכל העכברים אז לצייר את מזרק טרי מלא של פתרון לכל זלוף.
- להרדים את ip העכבר עם 200 μl / 25 גרם ממשקל הגוף של קוקטייל / Xylazine קטמין (24 מ"ג / מיליליטר & 4.8 מ"ג / בהתאמה מ"ל) ביום של עניין. לפקח על העכבר לרמה של הרדמה על ידי בדיקת רפלקס קמצוץ הבוהן. תמשיך עם פרוטוקול רק פעם אחת על העכבר לא מראה תגובה לקמצוץ הבוהן חברה.
הערה: שיטות אחרות של הרדמה עשויה לשמש עוד כרמה המתאימה של הרדמה הוא הגיעה לפנישתמשיך עם הפרוטוקול. - מניחים את העכבר במצב שכיבה על פלטפורמת הקצף המכוסה. הצמד את כל ארבעת הגפיים החוצה בכפות הרגליים ולאחר מכן לרסס את החזה והבטן עם אתנול 70% (EtOH) (איור 2 א). תוספת של כמה מגבות נייר סטרילי שמתחת לעכבר יכולה לשמש כדי לסייע בספיגת עודפי נוזלי זלוף.
- עור מעלית ממש מתחת לעצם החזה עם מלקחיים ולאחר מכן להשתמש במספריים לעשות חתך. משוך עור לאחור כדי לחשוף את החזה (איור 2).
- הרם xiphoid תהליך ולהפוך את חתך בבטן ממש מתחת לסרעפת, חושף את הכבד שגזור בצורה בוטה מהסרעפת. לעשות שני חתכים, אחד בצד שמאל ואחד בצד ימין דרך הסרעפת והחלק התחתון של הצלעות. להאריך את החתכים מהשמאל ומימין דרך 1 / 2-2 / 3 כ עד בית החזה, אשר לאחר מכן בא לידי הביטוי בחזרה כדי לפתוח את בית החזה (איור 2 ג).
הערה: טיפול קח לא לחתוך כל איברים או כלי דם גדולים duלצלצל בהליך זה ככך יתפשר על איכות זלוף. - Perfuse transcardially עם 10-20 מיליליטר הפרין / מלוח ואחרי 10-20 מיליליטר PFA 4%.
הערה: אם זלוף נעשה כראוי, הכבד יהפוך מאדום להשתזף (איור 2 ד). אם לא נעשה כראוי, כלי דם יהיו (2E איור) הגלוי. - הפכתי את העכבר על הבטן שלה, רגליים מחדש פינים לאחר מכן לרסס ראש וצוואר עם 70% EtOH. הרם את העור מבסיס הצוואר ולעשות חתך. להסיר עור לחשוף את הגולגולת (איור 2F). לערוף את הראש ברמה של הכתפיים. הסר את הגולגולת, להסיר בעדינות את המוח, ולמקם אותו לתוך בקבוקון נצנץ מלא PFA 4% (איור 2G-H).
הערה: אם perfused היטב, המוח יופיע לבן ללא כלי דם גלויים (איור ט 2). אם המוח אינו perfused היטב, כלי דם יהיו (י 2 איור) הגלוי. - הנח את השביבבקבוקון tion עם מוח PFA 4% על 4 מעלות צלזיוס לילה, מכוסה מן האור. יש לשטוף את המוח שבאינו USP הכיתה 1x PBS והעברה לבקבוקון נצנץ חדש מלאים במצונן 1x PBS. אחסן את המוח ב1x PBS על 4 מעלות צלזיוס, מכוסה מהאור.
הערה: ניקוי והדמיה מוצלחים הושגה עם קטעים מאוחסנים ב1x PBS לעד חודש אבל עדיף סעיף המוח תוך כמה ימים כאחסון ממושך בPBS יהיה להפוך את קיבעון PFA ועלול להוביל לפחות מאופטימליות תמונות . Autofluorescence ולטשטש עלה כבר ציינו בכמה סעיפים צילמו לאחר האחסון ב1x PBS במשך חודש אחד או יותר.
3. מוח חתך
- הסר את המוח מ1x PBS ולמקם אותו לתוך מטריצת מוח (איור 3 א), כדי לאפשר למדויק יותר ואף חוצה את המוח. חתוך את נורות המוח הקטן וחוש ריח, אם קיימים, ולאחר מכן לחתוך את המוח coronally לתוך 2 או 3 חלקים.
- להדביק כל חלק במוח על בלוק דגימת הרכבה עם cyanoacrylate. להדביק בלוק קטן של 5% ג'ל agarose מאחורי סעיף המוח לתמיכה (איור 3).
הערה: ניתן להשתמש במנגנוני תמיכה אחרים, אבל ללא תמיכה, Vibratome עשויה לדחוף במוח גורם לחתך לא אחיד. - לחתוך רקמה לתוך 160 מיקרומטר (מרחק עבודה של המטרה המשמשת להדמיה) חלקים עבים עם Vibratome להגדיר למהירות של 4 והמשרעת של 9.
הערה: ההגדרות למהירות ומשרעת עשויות להיות מותאמות בהתאם למכונה המסוימת בשימוש על מנת להשיג אפילו, חלקים חלקים. אם ההגדרותלא נכון, התוצאה יכולה להיות חלקים לא אחידים, קריעה של רקמה או סימני פטפוט. - לאסוף חלקי רקמות לתוך בקבוקון נצנץ מלא טרי, המצונן 1x PBS אם הם הולכים להיות מסומנות בתוך שבוע אחד. אם חלקים לא הולכים להיות מסומנות בתוך שבוע אחד, סעיפי מקום לתוך צינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge מלא פתרון cryopreservative ולאחסן ב -20 ° C.
4. סליקה אופטית של סעיפים רקמת מוח
הערה: פרוטוקול זה שונה משיטה שפורסמה בעבר 8.
- הכן 25%, 50%, 75% ו 90% גליצרול כרך / כרך ב 1x PBS Tween-20 + 2% (Gl / PBST).
- להסיר חלקים מ1x PBS או, אם בcryopreservative, לשטוף ב1x PBS ולהעביר לבקבוקון נצנץ המכיל 10 מיליליטר של 25% Gl / PBST. בקבוקון מקום על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס, מכוסה מחשיפה לאור, לשעה 12.
- ודא שכל החלקים שקעו לbottom של הבקבוקון. לשאוב 25% Gl / PBST, והשאיר רק מספיק כדי לכסות את החלקים ולאחר מכן למלא את הבקבוקון עם 10 מיליליטר 50% Gl / PBST ומקום על שייקר ב 4 מעלות צלזיוס, מכוסים מחשיפה לאור, לשעה 12. חזור על תהליך זה עבור 75% Gl / PBST אז 90% Gl / PBST. השאר חלקים ב -90% Gl / PBST למשך 24 שעות כדי להגיע לסליקה מקסימלי. במהלך תהליך הסליקה, להתבונן סליקה הדרגתית אופטית (איור 4).
הערה: תהליך זה עשוי להיות מזורז אם פתרונות משתנים מייד לאחר הסעיפים שקעו לתחתית של הבקבוקון. בפתרונות של 75% ו- 90%, סעיפים לא ישקעו כל הדרך עד לתחתית של הבקבוקון אבל יצופו באמצע.
5. סעיפים רקמות הרכבה מוח
- לחתוך coverslip 1.5 מס 'ל -5 חלקים כדי ליצור spacer. השתמש בעיפרון שליט ושקצו יהלום להבקיע ולשבור את coverslip לאורך הקווים מקווקווים שמוצגים באיור 5 א. בטל tהוא מרכז חתיכה, לסדר את 4 חתיכות חיצוניות בשקופית זכוכית רגיל כדי ליצור חלון, ולאחר מכן לצחצח ברור לק על התפרים לדבוק החתיכות של spacer לשקופית בתצורה הנכונה (איור 5).
הערה: spacer ישמש ליצור את המרחב הדרוש בין השקופיות וcoverslip להרכבת החלקים פינו. Coverslip ניתן לחתוך בדרכים שונות כדי ליצור כל גודל חלון הכרחי. מפרידי קצף חתוכים מראש זמינים גם מבחינה מסחרית. כדי לאפשר ללק להתייבש לחלוטין, דרך טובה ביותר הוא לעשות שקופיות עם מפרידי לפחות יום אחד לפני סעיפי הרכבה. - העברת חלקים לשקופית באמצעות pipet העברת פלסטיק עם הקצה מנותקים. הקפד למלא בסביבה עם 90% Gl / PBST. בזהירות להוריד coverslip על החלקים כדי לוודא שלא להציג את כל בועות. עודף Gl / PBST עלול להיות רשע משם עם לנגב ונטול מוך.
- GFP תמונה + נוירונים המכילים RFP +
הערה: לחלופין, חותם מחליק לחלוטין סביב כל הקצוות כדי לאחסן וצלמו במועד מאוחר יותר. שימוש בלק ברור לאטום שקופיות הוא אופציונאלי ועשוי להפוך אותו קשה יותר להסיר coverslip אם אחד היה כדי להסיר חלקים מהשקופית במועד מאוחר יותר לעיבוד נוסף.
6. הדמיה
הערה: כל מיקרוסקופ ניתן להשתמש שביש את יכולת קבלת Z- ערימות ברזולוציה גבוהה.
- לאחר בתחילה למצוא את מישור המוקד ב10X, לשנות למטרת 20X ולסרוק באמצעות הסעיף לזהות ציסטה ממוקמת בתוך GFP + תא. מרכז את האזור של העניין (ROI) בשדה הראייה.
- לשנות למטרת 40X. פוקוס למעלה ולמטה דרך כל ROI לוודא שכל התא וCYרח 'גלוי.
הערה: תמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת הנפט דסק"ש M27 40X / 1.30. - שימוש בתוכנת ההדמיה המותקנת, להשיג Z- מחסנית הכוללת את כל התא עם ציסטה. הגדרות ממוצעת בשימוש כדי להשיג תמונות מוצגות באיור 6.
הערה: הגדרות ייתכן שתצטרכנה להיות מותאמות בהתאם לכל סעיפי רקמות חוקרים ויכולות מיקרוסקופ. - לקבל תמונת הקרנה המרבית של Z- המחסנית על ידי קביעת מספר התחזיות ל1. השג מבט סיבוב מלא על ידי קביעת מספר התחזיות ל -64.
הערה: חבילות תוכנה אחרות זמינות וניתן להשתמש כדי להשיג הקרנה המרבית, סיבוב, כמו גם דעות אחרות של Z- מחסנית תמונות. - לנתח את התמונה עם תוכנת ניתוח הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 7 כולל תמונות מייצגות של שני GFP + תאי עצב משני 160 מיקרומטר חלקים שונים עבים, כמו גם מדידת נציג של המרחק מציסטה אל התא-גוף לאיור 7. איורים המכיל ציסטה 7 ו- B להמחיש שזה חדש פרוטוקול מאפשר להדמיה של תא העצב הנגוע בשלמותו. איור 7C מראה כי עם טכניקת הדמיה זו, ניתן כיום לכמת את המרחק בין ציסטה וגוף התא (Imaris 7.7). איור 7D הוא נוף סיבוב מלא של איור 7 ב. ויזואליזציה של Z- המחסנית בצורה זו מאפשרת לאימות לכידתו של התא וציסטה המלאה. איור 7E הוא סרט סיבוב 3D המראה כיצד התמונה מ7D יכולה להיות מנותחת על ידי תוכנת Imaris 7.7 כדי למדוד את המרחק מציסטה ל גוף התא או ממרכז ל- בינונית or קצה לקצה. למרות שהמדידה הראתה שנעשתה שימוש בקו ישר בין ציסטה וגוף התא, מדידה הבאה GFP בפועל + תהליך לגוף התא יכול גם להיות שנוצר (מידע לא מוצג).
איור 1: ציוד כירורגי להסרת מוח עכבר. כרית סופגת (). מחטי בלוק (B) קצף. (C) להצמיד את הרגליים. 25 סט אוסף דם G (D). ברזלים 3-כיווניים (E). מזרק 20 מיליליטר להפרין / מלוח (F). ( G) מזרק 20 מיליליטר למלקחי Thumb PFA. (H) 4%. (I) המספריים פיין, זווית לצד, חד-חד. (J) מספריים חדים-חד. (Hemostats K) קלי. (L) מספריים מאיו. (M) (N) לPFA 4%. בר סולם = סנטימטר 8.
איור 2: מוח עכבר קציר. כבד () עכבר מרותק וחזה ריסס עם 70% EtOH. חזה (B) חשוף. החלל (C) חזה פתוח. כבד (ד ') לאחר זלוף הנכון. (E) לאחר זלוף לא תקין. גולגולת חשופה (F). ( מוח G) עם חצי גולגולת הוסרה. (H) מוח שנקטפו בבקבוקון מלא PFA 4% (מוח. I) לאחר זלוף הנכון. (מוח J) לאחר זלוף לא תקין.
איור 3: חתך מוח עכבר. מתרי מוח () עכבר x. מוח העכבר (B) וג'ל agarose המודבק הרכבה בלוק עם cyanoacrylate בתוך תא Vibratome המלא מצונן 1x PBS.
איור 4: ניקוי תהליך נציג תמונות של סעיף מוח עכבר בכל שלב של תהליך הסליקה..
איור 5: חיתוך ותיקון spacer להחליק. Coverslip. מס '1.5 עם סימני נציג לחיתוך coverslip לתוך 5 חתיכות. B. שקופיות זכוכית רגילים עם כל פיסת coverslip החתך מודבקת למקום עם לק ברור כדי ליצור חלון.
2,237 / 52237fig6highres.jpg "/>
איור 6: צילום מסך של פרמטרים כלליים המשמשים לרכישת תמונה.
איור 7:. ציסטות Toxoplasma gondii יכולה לשכון בתוך תהליכים עצביים רחוקים (AB) תמונות מרבי השלכה של GFP + תאי עצב המכילים RFP + ציסטות (חצים לבנים). בר סולם = 20 מיקרומטר. (CE) לספק להדמיה וניתוח נוספים של מערכת היחסים ציסטה-נוירון שמוצגים בB. (ג) מדידה שנוצר Imaris ישיר קו של מרחק מהקצה של ציסטה לקצה של גוף התא (149μm ). (ד) 3-D סרט סיבוב. (שנוצר Imaris E)"Target =" www.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video איור 7E.avi _ blank "> 3-D סרט מראה מדידת ציסטה אל תא-גוף משני אמצע לאמצע (163 מיקרומטר) וקצה לקצה (149 מיקרומטר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהתחשב בכך ששינויים תאיים בתאי מארח נגועים נקשרו לתוצאות מחלה בזיהומים עם אורגניזמים תאיים אחרים כגון HIV, כלבת, וכלמידיה 18,19, שפיתחנו טכניקה שתאפשר לנו ללמוד את יחסי הגומלין האינטימיים המתרחשים בין מערכת העצבים המרכזית לארח תא וToxoplasma. השיטה המתוארת כאן משיגה מטרה זו על ידי הפעלת הדמיה יעילה של תאי עצב נגועים כרוני. לפני פיתוחה של שיטה זו, ההדמיה כזו הייתה גוזל זמן יקר, או לא אפשרי.
כעת אנו יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לענות על שאלות בסיסיות בנוגע לאינטראקצית -neuron Toxoplasma, כגון אזורים עצביים ספציפיים הממוקדים על ידי הטפיל? האם זה שונה בין זני Toxoplasma? האם האזורים הסלולריים שבציסטה מתגוררת שונה משאר תאים (כלומר אל נגוע ויש לי דנדריטים נגוע מאותו תא העצב אותו המספר של עמוד השדרה)? מהם המאפיינים המשותפים לסלולריים נוירונים נגועים? היכולת לענות על שאלות כאלה היא חיונית להבנה כיצד זיהום Toxoplasma משנה את מערכת העצבים המרכזית, כולל ברמה של התנהגות.
כדי להשיג את התמונות הטובות ביותר אפשריים, זה מאוד חשוב לוודא הרקמות היא חתכו לתוך אפילו חלקים. אם החלקים הם לא אחידים, coverslip לא יושב כמו שצריך בקטע המוביל למגע לא אחיד במטרה וכתוצאה מכך ההדמיה תת-אופטימלית. במהלך אופטימיזציה של פרוטוקול זה, כמה שינויים נעשו. תהליך הסליקה המקורי נעשה בפרוקטוז בניסיון לשחזר את תוצאות ניתן לראות בטכניקה המכונית SeeDB 20. שיטה זו אינה מתיישבת עם המודל הזה כפי שהוא הרווה RFP (במיוחד mCherry). עוד צעד מפתח וכנראה החשוב ביותר מכולם הוא שמאפשר לסליקה מקסימלי של חלקי רקמות. אם לא ניקה כראוי, עקיפת אור הרקע תהיה גבוהה יותר והתמונות הפכו רועשות. מצאנו כי תוספת של Tween-20 לגליצרול נתנה תמונה מעט ברורה יותר מגליצרול לבד. טכנולוגיה נוכחית מאפשרת לנו להשיג Z- מחסנית תמונות באמצעות קטעי רקמת המוח עבים 160μm אבל בעתיד, אנו מחפשים להגדיל את עובי זה ל -500 מיקרומטר או יותר כדי לאפשר לעוד יותר בניתוח מעמיק.
זה רק מלהסתכל על כל התא והקשרים שלה שאנחנו יכולים להתחיל לפתח רעיון המכניסטי של איך המוח מושפע באופן גלובלי על ידי Toxoplasma. פרוטוקול חדש זה מציע הזדמנות ללמוד האינטראקציה -neuron Toxoplasma ברמת התא הבודד ולעשות זאת בצורה מהירה, חסכונית. יש לנו עדיין לחקור את כל השימושים האפשריים לפרוטוקול זה ואיך זה יכול לתרגם למערכות אחרות, אבל אנו צופים שיהיה לה מספר רב של יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למעבדת הקושי הזה כולו לדיונים מועילים. אנו מודים לפטי Jansma ואוניברסיטת אריזונה Neuroscience המחלקה לייעוץ ועזרתי בהדמיה. אנו מודים גם למעבדה Porreca לשימוש Vibratome. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (NIH NS065116, AAK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-Cl | |
| 200 mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25 cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20 ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10 ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible - used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
- Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
- Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
- Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
- Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
- Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
- Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
- Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
- Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
- Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
- Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 Forthcoming.
- Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
- Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
- De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).
- Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
Tags
נוירוביולוגיה גיליון 94 Neuroscience מיקרוסקופיה Confocal עכבר מוח מסלקת חלבוני פלורסנט,Erratum
Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015.
Citeable Link.
A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy
