Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

3-D Imaging og analyse af neuroner Inficerede doi: 10.3791/52237 Published: December 9, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Ved hjælp af denne protokol, var vi i stand til at afbilde 160 um tyk hjerne afsnit fra mus inficeret med parasitten Toxoplasma gondii, som gør det muligt visualisering og analyse af det rumlige forhold mellem encysting parasitten og den inficerede neuron.

Abstract

Toxoplasma gondii er en obligat, intracellulær parasit med et bredt værtsområde, herunder mennesker og gnavere. I både mennesker og gnavere, Toxoplasma etablerer en livslang vedvarende infektion i hjernen. Mens denne hjerne infektion er asymptomatisk i de fleste immunkompetente personer, i fosteret eller immunkompromitterede personer, såsom erhvervet immundefektsyndrom (AIDS) patienter denne forkærlighed for og vedholdenhed i hjernen udvikler kan føre til ødelæggende neurologisk sygdom. Således er det klart, at hjerne- Toxoplasma interaktion er kritisk for symptomatisk sygdom forårsaget af Toxoplasma, men vi har lidt forståelse af den cellulære eller molekylære vekselvirkning mellem celler i det centrale nervesystem (CNS) og parasitten. I musemodel for CNS Toxoplasmose det har været kendt i over 30 år, som neuroner er de celler, hvor parasitten varer ved, men få oplysninger om, hvilkedel af neuron er generelt inficeret (soma, dendritceller, axon), og hvis denne cellulære forhold ændrer mellem stammer. I del, denne mangel er sekundær til vanskeligheden ved billedbehandling og visualisering hele inficerede neuroner fra et dyr. Sådanne billeder vil typisk kræve seriel sektionering og syning af væv afbildet ved elektronmikroskopi eller konfokal mikroskopi efter immunfarvning. Ved at kombinere flere teknikker, den her beskrevne fremgangsmåde muliggør anvendelse af tykke sektioner (160 um) for at identificere og billede hele celler, der indeholder cyster, så tredimensional visualisering og analyse af de enkelte, kronisk inficerede neuroner uden behov for immunfarvning, elektronmikroskopi eller seriel sektionering og syning. Ved hjælp af denne teknik, kan vi begynde at forstå den cellulære forhold mellem parasit og den inficerede neuron.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Det overordnede mål med denne metode er at opnå en høj opløsning, tre-dimensionelle billeder af individuelle neuroner, der er smittet med obligat intracellulær parasit Toxoplasma gondii.

Toxoplasma er ofte betragtes som en af de mest succesfulde parasitter på grund af sin store mellemliggende værtsområde, der omfatter mennesker og gnavere. I både mennesker og gnavere, efter akut infektion gennem indtagelse af forurenet mad eller vand, Toxoplasma er i stand til at forårsage en vedvarende infektion i CNS ved at konvertere fra sin hurtige replikerende formen (den tachyzoite) til dens langsomme-replikerende og encysting formular (den bradyzoite ). I immunkompetente individer er denne latent CNS-infektion menes at være relativt symptomfri, men i immunsvækkede personer, såsom AIDS-patienter eller transplanterede patienter, kan genopblussen af parasitten medføre fatal toxoplasmic hjernebetændelse 1,2. Desuden Nylige undersøgelser, have vist, at latent infektion med Toxoplasma kan medføre adfærdsændringer hos gnavere 3,4, selv om mekanismen er stadig ukendt.

Overraskende, trods disse data fremhæver betydningen af CNS- Toxoplasma interaktion, relativt lidt om dette forhold, især på det cellulære og molekylære niveau. Evnen til at studere selv simple aspekter af interaktionen hjerne-parasit er blevet hæmmet delvist af Technologic begrænsninger. For eksempel størstedelen af arbejdet viser, at neuroner er de celler, i hvilke cyster resterer er blevet gjort med elektronmikroskopi (EM) 5,6. Selvom EM giver høj opløsning, er det tidskrævende, arbejdskrævende og dyrt. Immunofluorescens (IF) assays er for nylig blevet anvendt i forbindelse med konfokal mikroskopi for at bekræfte arbejde EM 7. Hvis analyser er teknisk let at udføre og relativt billig, men ved anvendelse af disse teknikker til understand det rumlige forhold mellem cyste og den inficerede neuron kræver seriel rekonstruktion, som er tidskrævende, teknisk vanskeligt, og kan føre til tab af værdifulde oplysninger. Vi har således udviklet en metode, der kan anvendes med musemodel for CNS toxoplasmose og tillader os at afbilde hele inficerede neuroner uden EM eller immunhistokemi (IHC). Ved at udvikle en sådan teknik, kan vi begynde at undersøge cellulære forholdet mellem den inficerede celle og cyste i en relativt hurtig og billig måde.

Den metode, vi har udviklet kombinerer nyere teknikker til optisk clearing og billedbehandling tykke hjernesnit ved konfokal mikroskopi 8 med et system, der markerer in vivo-celler, der er blevet injiceret med parasit-proteiner 9,10. I dette system, vi inficere Cre-reporter mus, der udtrykker et grønt fluorescerende protein (GFP) efter Cre-medieret rekombination 11 med Toxoplasma 9. Denne kombination giver os mulighed for at høste den inficerede mus hjernen efter CNS-infektion er etableret, skæres tykke hjernesnit, og hurtigt at identificere relevante områder af billedet ved at finde RFP + cyster. Det er vigtigt at bemærke, at som værtscelle ekspression af GFP alene afhænger injektion af Cre af parasitter, og ikke på infektion, en række af GFP + -celler indeholder ikke parasitter 10. Da målet med denne protokol er at være i stand til at afbilde hele inficerede neuroner er fokus kun på GFP + neuroner, der også indeholder en RFP + cyste, men protokollen kan også bruges til at afbilde GFP + / RFP - neuroner.

Når den inficerede hjerne høstes og snit, er afsnittene gøres gennemsigtigt ved glycerol clearing. Passende områder af sektioner derefter afbildes med konfokal mikroskopi, algende hidtil uset visualisering af inficerede værtsceller og de indkapslede parasitter i deres helhed. Her giver vi en komplet protokol til at identificere, optisk clearing, og billedbehandling smittet neuroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Mus blev avlet og holdt i en temperatur og fugtighed kontrolleret rum med 12 timer vendes lys / mørke cykler med mad og vand tilgængeligt ad libitum på University of Arizona. Eksperimenter blev udført under retningslinier og godkendelse af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Arizona. Blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser. Cre-reporter mus er på en C57BL / 6 baggrund 11 og er kommercielt tilgængelige.

1. Mouse Infektion

BEMÆRK: Fremgangsmåde mus infektion med Toxoplasma gondii beskrevet nedenfor er blevet anvendt i undersøgelser tidligere offentliggjorte 10-12.

  1. Grow Toxoplasma stammer i humane forhudsfibroblaster (HFFS) dyrket i Dulbeccos High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) suppleret med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin (cDMEM) i en T-25 kolbe i en 5% CO 2-inkubator indtil parasitter har dannet store parasitophore vakuoler.
  2. Sprøjte-release parasitter ved at skrabe cellerne fra bunden af ​​kolben og passerer den resulterende opløsning gennem en 25 gauge nål forbundet til en 3 ml sprøjte 2 gange inde i kolben derefter overføre alle opløsningen til en 5 ml sprøjte tilfælde forbundet til en 27 gauge nål, er placeret på hovedet i en 15 ml konisk rør. Slut stemplet på sprøjten og videregive parasitten opløsning ind i konisk rør.
  3. Centrifugeres i 10 minutter ved 300 x g. Aspirer supernatanten derefter pellet resuspenderes i 4-6 ml sterilt USP kvalitet 1x phosphatpufret saltvand (PBS) pH 7,4 (stamopløsning).
  4. Læg et hæmocytometer med 10 pi stamopløsning, vent 5-10 min for parasitterne at bosætte derefter tælle antallet af parasitter i de fire hjørner og center pladser i midten store firkantede.
  5. Fortynd parawebsteder til passende inokulum størrelse 100K / 200 pi 1x PBS derefter injicere mus intraperitonealt (ip) med et samlet volumen på 200 pi.
    BEMÆRK: Til denne procedure blev mus podet med 100K Type III (CEP) 13 tachyzoitter i 200 pi 1x PBS. Når inficere mus med andre stammer af Toxoplasma, kan koncentrationen af ​​inokulum skal justeres for at tage højde for forskelle i virulens.

2. Perfusion og Brain Høst

BEMÆRK: Denne protokol blev udført ved 21 dage efter infektion (dpi), da dette repræsenterer det tidspunkt, hvor peak antal cyster findes i musehjernen, men andre tidspunkter kan anvendes. Størrelse, antal, placering og tilstedeværelse eller fravær af cyster afhænger af mange faktorer, herunder musestamme, parasit stamme typen samt inoculum størrelse 7,14 - 17. Efterforskere skal individuelt bestemme den passende inokulum til musen og Toxoplasma stamme han / hun bruger.

  1. Opsætning alle kirurgiske høst værktøjer (figur 1).
  2. For hver mus, forberede og holde på is: 20 ml sprøjte fyldt med 0,9% natriumchlorid (NaCl) + 10 U / ml heparin i 1x steril USP klasse PBS (Heparin / saltvand); 20 ml sprøjte fyldt med 4% paraformaldehyd (PFA); Scintillationshætteglas med 15 ml 4% PFA. For flere mus, forberede et bæger fyldt med hele beløbet for hver opløsning er nødvendig for alle mus derefter udarbejde en ny sprøjte fyldt med løsning til hver perfusion.
  3. Bedøve mus ip med 200 pi / 25 g legemsvægt af Ketamin / Xylazin cocktail (24 mg / ml og 4,8 mg / ml) på dag af interesse. Overvåg musen for niveau af anæstesi ved at kontrollere tå knivspids refleks. Fortsæt med protokol kun én gang musen viser ingen reaktion på en fast tå knivspids.
    BEMÆRK: Andre metoder til anæstesi kan anvendes, så længe det passende niveau af anæstesi er opnået førfortsætter med protokollen.
  4. Placer musen i liggende stilling på den overdækkede skum platform. Pin alle fire lemmer ud ved fødderne derefter sprøjte brystet og maven med 70% ethanol (EtOH) (figur 2A). Tilsætning af flere sterile papirhåndklæder under musen kan bruges til at hjælpe absorbere overløb af perfusion væsker.
  5. Lift hud lige under brystbenet med pincet derefter bruge en saks til at gøre et snit. Træk huden tilbage for at blotlægge brystet (figur 2B).
  6. Løft xiphoid proces og foretage en abdominal incision lige under mellemgulvet, udsætter leveren, som er stumpt dissekeres væk fra membranen. Lav to snit, en til venstre og en til højre gennem membranen og bunden af ​​ribbenene. Forlæng venstre og højre indsnit ca. 1 / 2-2 / 3 op brystkassen, som derefter reflekteres tilbage for at åbne brysthulen (figur 2C).
    BEMÆRK: Pas på ikke at skære nogen organer eller store blodkar DUring denne procedure da dette vil forringe kvaliteten af ​​perfusion.
  7. Perfundere transkardialt med 10-20 ml heparin / saltvand efterfulgt af 10-20 ml 4% PFA.
    BEMÆRK: Hvis perfusionen gøres ordentligt, vil leveren vende fra rød til tan (figur 2D). Hvis ikke gøres ordentligt, vil blodkarrene være synlige (Figur 2E).
  8. Vend musen over på sin mave, re-pin fødder derefter spray hoved og hals med 70% EtOH. Løft hud fra bunden af ​​halsen og foretage en incision. Fjern huden for at blotlægge kraniet (figur 2F). Halshugge hoved på niveau med skuldrene. Fjern kraniet, forsigtigt fjerne hjernen, og læg det i et scintillationshætteglas fyldt med 4% PFA (figur 2G-H).
    BEMÆRK: Hvis godt perfunderet, vil hjernen blive vist hvide uden synlige blodkar (Figur 2i). Hvis hjernen ikke er godt perfunderet, vil blodkar være synlig (figur 2J).
  9. Placer Scintillation hætteglas med hjerne i 4% PFA ved 4 ° C natten over, dækket mod lys. Skyl hjernen i ikke-USP kvalitet 1x PBS og overføres til en ny scintillationshætteglas fyldt med afkølet 1x PBS. Opbevar hjernen i 1X PBS ved 4 ° C, dækket af lys.
    BEMÆRK: Vellykket clearing og billedbehandling er opnået med sektioner, der er lagret i 1x PBS i op til en måned, men det er bedst at afsnittet hjernen inden for et par dage som langvarig lagring i PBS vil vende PFA fiksering og kan føre til mindre end optimale billeder . Autofluorescens og øget sløring er blevet bemærket i nogle afsnit afbildet efter opbevaring i 1x PBS i en måned eller længere.

3. Brain Sektionsinddeling

  1. Tag hjernen fra 1x PBS og læg det i en hjerne matrix (figur 3A) at give mulighed for mere præcis og selv skærer gennem hjernen. Skær de cerebellum og olfaktoriske pærer, hvis den findes, og derefter skære hjernen coronalt i 2 eller 3 sektioner.
  2. Fastgør hver hjerne sektion på en prøve monteringsblok med cyanoacrylat. Forsynes med et lille blok af 5% agarosegel bag hjernen sektion for støtte (figur 3B).
    BEMÆRK: Der kan anvendes andre støttemekanismer, men uden støtte, kan Vibratome skubbe på hjernen forårsager ujævn sektionering.
  3. Skær væv ind 160 um (arbejder afstand af målet, der anvendes til billeddannelse) tykke sektioner med Vibratome indstilles til en hastighed på 4 og amplitude af 9.
    BEMÆRK: Indstillingerne for hastighed og amplitude kan justeres afhængigt af den pågældende maskine anvendes for at opnå selv, glatte sektioner. Hvis indstillingerne erikke er korrekt, kan resultatet være ujævne sektioner, rivning af væv eller snak mærker.
  4. Saml vævssnit i et scintillationshætteglas fyldt med frisk, kølet 1x PBS, hvis de vil blive ryddet inden for en uge. Hvis dele ikke skal ryddes inden for en uge, sted sektioner i 1,5 ml mikrocentrifugerør fyldt med kryokonserveringsmiddel løsning og opbevares ved -20 ° C.

4. Optisk Clearing af hjernevæv Sektioner

BEMÆRK: Denne protokol er blevet ændret fra en tidligere offentliggjort metode 8.

  1. Forbered 25%, 50%, 75% og 90% vol / vol glycerol i 1x PBS + 2% Tween-20 (GL / PBST).
  2. Fjern sektioner fra 1x PBS eller, hvis i kryokonserveringsmiddel, skylles i 1x PBS og overføre til et scintillationsglas indeholdende 10 ml 25% Gl / PBST. Placer hætteglasset på en ryster ved 4 ° C, dækket af udsættelse for lys, i 12 timer.
  3. Kontroller, at alle sektioner er sunket til Bottom af hætteglasset. Suges 25% Gl / PBST, så kun nok til at dække de afsnit derefter udfylde hætteglasset med 10 ml 50% Gl / PBST og sted på en ryster ved 4 ° C, dækket mod udsættelse for lys, i 12 timer. Gentag denne proces for de 75% Gl / PBST derefter 90% Gl / PBST. Lad sektioner i 90% Gl / PBST i 24 timer for at nå maksimal clearing. I løbet af clearingen, observere gradvis optisk clearing (figur 4).
    BEMÆRK: Denne proces kan fremskyndes, hvis løsninger er skiftet umiddelbart efter afsnit er sunket til bunden af ​​hætteglasset. I 75% & 90% opløsninger vil sektioner ikke synke hele vejen til bunden af ​​hætteglasset, men vil flyde i midten.

5. Montering Brain vævssnit

  1. Skær en nr 1,5 dækglas i 5 stykker til at skabe en spacer. Brug en lineal og diamant spids blyant for at score og bryde dækglasset langs de stiplede linjer, der er vist i figur 5A. Kassér than opsats, arrangere de 4 yderste stykker på en almindelig glasplade for at oprette et vindue, og derefter børste klar neglelak på sømmene at klæbe brikkerne i afstandsstykket til dias i den korrekte konfiguration (figur 5B).
    BEMÆRK: spacer vil blive brugt til at skabe den nødvendige plads mellem dias og dækglasset til montering af ryddet sektioner. Det dækglas kan skæres på forskellige måder at skabe enhver størrelse vindue nødvendig. Pre-cut skum afstandsstykker er også kommercielt tilgængelige. For at tillade neglelak tørre helt, er det bedst at slides med afstandsstykker mindst én dag før montering sektioner.
  2. Overfør sektioner til et objektglas ved anvendelse af en plast transfer pipette med spidsen skåret af. Sørg for at udfylde omkringliggende område med 90% Gl / PBST. Sænk forsigtigt et dækglas over afsnittene og sørg for ikke at indføre nogen bobler. Overskydende Gl / PBST kan det vanvittigt væk med en fnugfri klud.
  3. Billede GFP + neuroner indeholder RFP + (figur 7A-B) derefter gemme slides flad og dækket mod lys ved 4 ° C.
    BEMÆRK: Du kan også sæl glider helt omkring alle kanter for at gemme og afbildet på et senere tidspunkt. Anvendelse af klare neglelak til at forsegle dias er valgfrit og kan gøre det vanskeligere at fjerne dækglas hvis man fjerne afsnit fra dias på et senere tidspunkt til videre behandling.

6. Imaging

BEMÆRK: Enhver mikroskop kan anvendes, der har evnen til at opnå høj opløsning z-stakke.

  1. Efter første omgang at finde brændplanet ved 10X, skifte til en 20X objektiv og scanne gennem sektionen til at identificere en cyste placeret inde i en GFP + celle. Centrer området af interesse (ROI) i synsfeltet.
  2. Skift til en 40X objektiv. Fokus op og ned gennem hele ROI for at sikre, at hele cellen og cyst er synlige.
    BEMÆRK: Billeder blev opnået ved anvendelse af et konfokalt mikroskop med en 40X / 1,30 Olie DIC M27 mål.
  3. Brug den installerede imaging software, opnå en z-stak, der omfatter hele cellen med cyste. Gennemsnitlige indstillinger, der anvendes til at opnå billeder er vist i figur 6.
    BEMÆRK: Indstillinger kan være nødvendigt at justere alt efter hver efterforskere vævssnit og mikroskop kapaciteter.
  4. Anskaf en maksimal projektion billede af z-stakken ved at indstille antallet af fremskrivninger til 1. Skaf et fuldt roterende visning ved at indstille antallet af projektioner til 64.
    BEMÆRK: Andre software-pakker er til rådighed og kan anvendes til at opnå maksimal projektion, roterende samt andre visninger af z-stak billeder.
  5. Analyser billede med imaging analysesoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 7 indeholder repræsentative billeder af to cyste indeholdende GFP + neuroner fra to forskellige 160 um tykke sektioner samt en repræsentativ måling af afstanden fra cyste-til-celle-organ for figur 7B. Figur 7 A og B viser, at denne nye protokol giver mulighed for visualisering af det inficerede neuron i sin helhed. Figur 7C viser, at med denne billeddannelse teknik, er det nu muligt at kvantificere afstanden mellem cyste og cellen legeme (Imaris 7,7). Figur 7D er en fuld roterende af figur 7B. Visualisering af Z-stakken på denne måde giver mulighed for kontrol af fuldstændig indfangning af cellen og cyste. Figur 7E er et 3D roterende film viser, hvordan billedet fra 7D kan analyseres ved Imaris 7.7 software til at måle afstanden fra cyste til cellelegemet enten fra midten-til-middle oR kant-til-kant. Selvom den viste måling blev udført ved anvendelse af en lige linje mellem cyste og cellen kroppen, en måling efter den faktiske GFP + proces til cellen organ kan også genereres (data ikke vist).

Figur 1
Figur 1: Kirurgisk udstyr til fjernelse af musehjerne. (A) absorberende pude. (B) Skum blok. (C) Nåle at pin ned fødder. (D) 25 G Blodopsamling sæt. (E) 3-vejs stophane. (F) 20 ml sprøjte til heparin / saltvand. ( G) 20 ml sprøjte til 4% PFA. (H) Thumb pincet. (I) Fin saks, vinklet til side, skarpe skarp. (J) Sharp-skarp saks. (K) Kelly hemostats. (L) Mayo saks. (M) (N) scintillationshætteglas for 4% PFA. Scale bar = 8 cm.

Figur 2
Figur 2: Høst mus hjerne. (A) mus holdt nede og bryst sprøjtet med 70% EtOH. (B) Udsat brystet. (C) brysthulen åben. (D) Lever efter korrekt perfusion. (E) Lever efter forkert perfusion. (F) Udsat kranium. ( G) Brain med halv kraniet fjernes. (H) Høstet hjerne i hætteglas fyldt med 4% PFA. (I) Brain efter korrekt perfusion. (J) Brain efter forkert perfusion.

Figur 3
Figur 3: Skæring musehjerne. (A) musehjerne Matri x. (B) Mouse hjerne og agarosegel fastgjort til monteringsblokken med cyanoacrylat inde Vibratome kammer fyldt med afkølet 1x PBS.

Figur 4
Figur 4: Rydning proces Repræsentative billeder af en mus hjerne sektion under hvert trin i clearingen..

Figur 5
Figur 5: Skæring og fastsættelse spacer til at glide. A nr. 1.5 dækglas med repræsentative karakterer for at skære dækglas i 5 stk. B. Plain objektglas med hvert stykke skåret dækglas hæftet på plads med klar neglelak for at oprette et vindue.

2237 / 52237fig6highres.jpg "/>
Figur 6: Skærmbillede af generelle parametre, der anvendes til billedoptagelse.

Figur 7
Figur 7:. Toxoplasma gondii cyster kan opholde sig fjernt neuronale processer (AB) Maksimal projektion billeder af GFP + neuroner indeholder RFP + cyster (hvide pile). Scale bar = 20 um. (CE) give yderligere visualisering og analyse af cyste-neuron forhold vist i B. (C) Imaris-genereret måling direkte linje af afstanden fra kanten af cyste til kanten af cellen kroppen (149μm ). (D) 3-D roterende film . (E) Imaris-genereretwww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figur 7E.avi "target =" _ blank "> 3-D film, der viser cyste-til-celle-krop måling fra både midt-til-midten (163 um) og kant-til-kant (149 um).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Da celleforandringer i inficerede værtsceller har været knyttet til sygdoms resultater i infektioner med andre intracellulære organismer såsom HIV, Rabies, og Chlamydia 18,19, vi udviklet en teknik, der vil give os mulighed for at studere de intime samspil, der opstår mellem CNS værtscelle, og Toxoplasma. Den her beskrevne fremgangsmåde opnår dette mål ved at muliggøre effektiv billeddannelse af kronisk inficerede neuroner. Forud for udviklingen af ​​denne fremgangsmåde, såsom billeddannelse var tidskrævende, dyrt eller ikke er mulig.

Vi kan nu bruge denne teknik til at besvare grundlæggende spørgsmål om Toxoplasma -neuron samspil, som er specifikke neuronale områder, som parasitten? Betyder det variere mellem Toxoplasma stammer? Har de cellulære områder, hvor cyste opholder afviger fra resten af cellen (dvs. ikke inficerede og ikke-inficerede dendritter fra samme neuron har det samme antal pigge)? Hvad er de cellulære egenskaber deles af inficerede neuroner? Evnen til at besvare sådanne spørgsmål er afgørende for at forstå, hvordan Toxoplasma infektion ændrer CNS, herunder på niveau med adfærd.

For at opnå de bedste billeder er muligt, er det meget vigtigt at sørge for, at vævet skæres i lige sektioner. Hvis sektionerne er ujævn, er dækglasset ikke sidde korrekt på afsnittet fører til ujævn kontakt med målet resulterer i sub-optimal billeddannelse. Under optimering af denne protokol, blev der flere ændringer foretaget. Den oprindelige clearing proces blev udført med fruktose i et forsøg på at gengive resultaterne vist i en teknik kendt som SeeDB 20. Denne metode var uforenelig med denne model, da den standset RFP (specifikt mCherry). Et andet afgørende skridt og formentlig den vigtigste af alle er at tillade for maksimal rydning af vævssnit. Hvis ikke ryddet ordentligt, vil baggrundslys diffraktion være højere ogbilleder bliver støjende. Vi fandt, at tilsætning af Tween-20 til glycerol gav en lidt klarere billede end glycerol alene. Nuværende teknologi giver os mulighed for at få z-stack billeder via 160μm tykke hjerne vævssnit men i fremtiden, ser vi at øge denne tykkelse til 500 um eller mere for at give mulighed for endnu mere indgående analyse.

Det er kun ved at se på hele cellen og dens forbindelser, vi kan begynde at udvikle en mekanistisk idé om, hvordan hjernen er globalt påvirket af Toxoplasma. Denne nye protokol giver mulighed for at studere Toxoplasma -neuron interaktion på enkelt celle niveau og gøre det på en hurtig, økonomisk måde. Vi har endnu til at udforske alle de mulige anvendelser for denne protokol, og hvordan det kan overføres til andre systemer, men vi forventer det vil have flere programmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker hele Koshy laboratorium til nyttige diskussioner. Vi takker Patty Jansma og University of Arizona Neuroscience afdeling for rådgivning og hjælp til billedbehandling. Vi takker også Porreca laboratorium for brug af deres Vibratome. Denne forskning blev støttet af det amerikanske National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System Technical Products International, Inc. Other vibratomes are compatible
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Premium Slides Fisher Scientific 12-544-2
#1.5 Coverslips VWR 48393 251
Diamond Scriber VWR 52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope Zeiss LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml Western Medical Supply, Inc. 4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml Lloyd Inc.
ZsGreen Mice Jackson Laboratories 7906 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) HyClone SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine Corning 25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask Fisher Scientific 1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium VWR 45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade amresco K813-500ml
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Bright-Line Hemocytometer Sigma-aldrich Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS005-1
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-aldrich H3393-100KU
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials Fisher Scientific FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof In-house 17212945 This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software Bitplane
Clear nail polish Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok VWR BD309604 Other syringes are compatible
Three-way Stopcock Any brand is compatible
Hypodermic needle Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter Greiner Bio-One 450099 Other brands are compatible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15, (2), 211-222 (1992).
  2. Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8, (10), 634-640 (2002).
  3. Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8, (9), 75246 (2013).
  4. Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
  5. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411, (1), 39-43 (1987).
  6. Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72, (4), 463-474 (1991).
  7. Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. (2010).
  8. Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
  9. Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7, (4), 307-309 (2010).
  10. Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8, (7), (2012).
  11. Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, (1), 133-140 (2010).
  12. Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9, (5), (2013).
  13. Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21, (10), 476-481 (2005).
  14. Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11, (2), 267-299 Forthcoming.
  15. Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29, (3), 205-214 (2014).
  16. Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6, (12), 28925 (2011).
  17. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73, (6), 483-491 (1987).
  18. De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46, (3), 614-638 (2012).
  19. Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82, (1), 513-521 (2008).
  20. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, (8), 1154-1161 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:

Anita A. Koshy, Carla M. Cabral

to:

Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

3-D Imaging og analyse af neuroner Inficerede<em&gt; In Vivo</em&gt; Med<em&gt; Toxoplasma gondii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).More

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter