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Neuroscience

न्यूरॉन्स की 3 डी इमेजिंग और विश्लेषण संक्रमित doi: 10.3791/52237 Published: December 9, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम दृश्य और encysting परजीवी और संक्रमित न्यूरॉन के बीच स्थानिक संबंधों के विश्लेषण में सक्षम बनाता है जो परजीवी Toxoplasma gondii, से संक्रमित चूहों से छवि 160 माइक्रोन मोटी मस्तिष्क वर्गों के लिए सक्षम थे।

Abstract

Toxoplasma gondii मनुष्यों और कृन्तकों सहित एक व्यापक मेजबान रेंज, के साथ एक लाचार, intracellular परजीवी है। दोनों मानव और कृन्तकों में, Toxoplasma मस्तिष्क में एक आजीवन लगातार संक्रमण स्थापित करता है। यह मस्तिष्क के संक्रमण विकासशील भ्रूण या इस तरह के दिमाग में एक्वायर्ड इम्यून डेफिसिएंसी सिंड्रोम (एड्स) के रोगियों के लिए इस झुकाव और दृढ़ता के रूप में प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों में, सबसे असुरक्षित लोगों में स्पर्शोन्मुख है जबकि विनाशकारी तंत्रिका संबंधी रोग हो सकता है। इस प्रकार, यह brain- Toxoplasma बातचीत Toxoplasma द्वारा उत्पादित रोगसूचक रोग के लिए महत्वपूर्ण है, फिर भी हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और परजीवी की कोशिकाओं के बीच सेलुलर या आणविक बातचीत की कम समझ है कि स्पष्ट है। सीएनएस के माउस मॉडल में यह न्यूरॉन्स परजीवी बनी रहती है जिसमें कोशिकाओं रहे हैं कि 30 साल से अधिक के लिए जाना जाता रहा है टोक्सोप्लाज़मोसिज़, लेकिन बहुत कम जानकारी के बारे में जो उपलब्ध हैन्यूरॉन का हिस्सा आम तौर पर (सोमा, डेन्ड्राइट, अक्षतंतु) संक्रमित है और इस सेलुलर संबंध उपभेदों के बीच बदलता है। भाग में, इस कमी इमेजिंग की कठिनाई के माध्यमिक और एक जानवर से पूरे संक्रमित न्यूरॉन्स visualizing है। इस तरह की छवियों को आम तौर पर धारावाहिक सेक्शनिंग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या immunostaining के बाद confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged ऊतक की सिलाई की आवश्यकता होगी। कई तकनीकों के संयोजन से, यहाँ वर्णित विधि immunostaining के लिए आवश्यकता के बिना तीन आयामी दृश्य और व्यक्तिगत, लंबे समय से संक्रमित न्यूरॉन्स के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, की पहचान करने और अल्सर होते हैं कि छवि पूरे कोशिकाओं को मोटी वर्गों के उपयोग (160 माइक्रोन) में सक्षम बनाता है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या धारावाहिक सेक्शनिंग और सिलाई। इस तकनीक का उपयोग करना, हम परजीवी और संक्रमित न्यूरॉन के बीच सेलुलर संबंध को समझने के लिए शुरू कर सकते हैं।

Introduction

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इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए उच्च संकल्प, लाचार इंट्रासेल्युलर परजीवी Toxoplasma gondii से संक्रमित हैं कि व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की तीन आयामी चित्र प्राप्त करने के लिए है।

Toxoplasma अक्सर क्योंकि मनुष्यों और कृन्तकों भी शामिल है जो अपने बड़े मध्यवर्ती मेजबान श्रृंखला के सबसे सफल परजीवी में से एक माना जाता है। मनुष्य और कृन्तकों दोनों में, दूषित भोजन या पानी की घूस के माध्यम से तीव्र संक्रमण के बाद, Toxoplasma फार्म इसकी धीमी गति से नकल करने के लिए अपनी तेजी से नकल फॉर्म (tachyzoite) से परिवर्तित और encysting द्वारा सीएनएस के एक लगातार संक्रमण पैदा करने में सक्षम है (bradyzoite )। असुरक्षित व्यक्तियों में, इस अव्यक्त सीएनएस संक्रमण अपेक्षाकृत स्पर्शोन्मुख माना जाता है, लेकिन इस तरह एड्स रोगियों या प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के रूप में प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों में, परजीवी के प्रत्यावर्तन घातक toxoplasmic इन्सेफेलाइटिस 1,2 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों हातंत्र अनजान बनी हुई है हालांकि Toxoplasma साथ अव्यक्त संक्रमण, कृन्तकों 3,4 में व्यवहार में बदलाव करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं दिखाया गया है।

हैरानी की बात है, CNS- Toxoplasma बातचीत के महत्व पर प्रकाश डाला इन आंकड़ों के बावजूद, अपेक्षाकृत छोटे से विशेष रूप से सेलुलर और आणविक स्तर पर, इस रिश्ते के बारे में जाना जाता है। मस्तिष्क-परजीवी बातचीत का भी सरल पहलुओं का अध्ययन करने की क्षमता टैकनोलजी सीमाओं के हिस्से में बाधा उत्पन्न कर दिया गया है। उदाहरण के लिए, काम के बहुमत न्यूरॉन्स अल्सर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) 5,6 के साथ किया गया है जारी रहती है जिसमें कोशिकाओं रहे हैं कि दिखा। ईएम उच्च संकल्प देता है, यह समय लेने वाली है, श्रम गहन, और महंगी है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) assays के हाल ही में ईएम 7 द्वारा किए गए कार्य की पुष्टि करने के confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया गया है। Assays के प्रदर्शन करने के लिए तकनीकी रूप से आसान है और अपेक्षाकृत सस्ती है, लेकिन अंडर करने के लिए इन तकनीकों का उपयोग कर रहे हैंtand पुटी और संक्रमित न्यूरॉन के बीच स्थानिक संबंध समय, तकनीकी रूप से कठिन लगता है, और बहुमूल्य जानकारी के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो धारावाहिक पुनर्निर्माण की आवश्यकता है। इस प्रकार, हम सीएनएस टोक्सोप्लाज़मोसिज़ के माउस मॉडल के साथ प्रयोग किया और अन्दर या immunohistochemistry (आईएचसी) के बिना छवि को संक्रमित न्यूरॉन्स की सम्पूर्णता के लिए हमें की अनुमति देता है कि हो सकता है एक तरीका विकसित किया है। एक ऐसी तकनीक विकसित करके, हम एक अपेक्षाकृत जल्दी और सस्ता तरीके से संक्रमित कोशिका और पुटी के बीच सेलुलर संबंधों का पता लगाने के लिए शुरू कर सकते हैं।

हम पद्धति विकसित परजीवी प्रोटीन 9,10 इंजेक्शन के साथ किया गया है कि इन विवो कोशिकाओं में निशान जो एक प्रणाली के साथ confocal माइक्रोस्कोपी 8 से ऑप्टिकली समाशोधन और इमेजिंग मोटी मस्तिष्क वर्गों के लिए नई तकनीकों को जोड़ती है। इस प्रणाली में, हम Toxoplasma साथ पुनर्संयोजन 11 Cre की मध्यस्थता के बाद ही एक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त कि रचनात्मक संवाददाता चूहों को संक्रमित 9 में Cre recombinase इंजेक्षन कि उपभेदों। इस संयोजन सीएनएस संक्रमण की स्थापना की है के बाद, संक्रमित माउस मस्तिष्क फसल मोटी मस्तिष्क वर्गों में कटौती, और तेजी से आरएफपी + अल्सर खोजने के द्वारा छवि के लिए प्रासंगिक क्षेत्रों की पहचान करने के लिए हमें की अनुमति देता है। यह GFP के मेजबान सेल अभिव्यक्ति GFP + कोशिकाओं के एक नंबर परजीवी 10 शामिल नहीं है, संक्रमण पर परजीवी द्वारा Cre के इंजेक्शन पर पूरी तरह से निर्भर करता है, और के रूप में नहीं है कि नोट के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य छवि पूरे संक्रमित न्यूरॉन्स के लिए सक्षम होने के लिए है, ध्यान ही + GFP भी एक आरएफपी + पुटी होते हैं कि न्यूरॉन्स पर है, लेकिन प्रोटोकॉल भी छवि के लिए + GFP / आरएफपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - न्यूरॉन्स।

संक्रमित मस्तिष्क काटा और sectioned है एक बार, वर्गों ग्लिसरॉल समाशोधन द्वारा पारदर्शी प्रदान कर रहे हैं। वर्गों का उचित क्षेत्रों तो confocal माइक्रोस्कोपी, अल साथ imaged हैंसंक्रमित मेजबान कोशिकाओं और अपनी संपूर्णता में encysted परजीवी के lowing अभूतपूर्व दृश्य। यहाँ हम एक की पहचान करने के लिए पूरा प्रोटोकॉल, ऑप्टिकली समाशोधन, और इमेजिंग संक्रमित न्यूरॉन्स प्रदान करते हैं।

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Protocol

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नोट: चूहे एरिजोना विश्वविद्यालय में भोजन और पानी उपलब्ध यथेच्छ के साथ प्रकाश / अंधेरे चक्र उलट नस्ल और 12 घंटा के साथ एक तापमान और आर्द्रता नियंत्रित कमरे में बनाए रखा गया। प्रयोगों के दिशा-निर्देशों और एरिजोना विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुमोदन के तहत आयोजित की गई। सभी प्रयासों पीड़ा कम करने के लिए किए गए थे। Cre संवाददाता चूहों एक C57BL 6 / पृष्ठभूमि 11 पर हैं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

1. माउस संक्रमण

नोट: - 12 से नीचे वर्णित Toxoplasma gondii के साथ माउस संक्रमण की विधि में पहले 10 में प्रकाशित अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है।

  1. Fibroblasts (HFFs) चमड़ी मानव में Toxoplasma उपभेदों हो जाना है Dulbecco उच्च ग्लूकोज में सुसंस्कृत ईगल्स मध्यम (DMEM) 10% FBS के साथ पूरक संशोधित, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 मिलीग्राम / एमएल streptएक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर अंदर एक टी-25 फ्लास्क में omycin, और 2 मिमी एल glutamine (cDMEM) परजीवी बड़े parasitophorous रिक्तिकाएं का गठन किया है जब तक।
  2. तब एक 27 गेज सुई से जुड़ा एक 5ml सिरिंज मामले के लिए सभी समाधान हस्तांतरण कुप्पी के अंदर 2 बार कुप्पी के नीचे से कोशिकाओं scraping और एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ा एक 25 गेज सुई के माध्यम से परिणामस्वरूप समाधान गुजर द्वारा सिरिंज जारी-परजीवी कि उल्टा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के अंदर रखा गया है। सिरिंज सवार कनेक्ट और शंक्वाकार ट्यूब में परजीवी समाधान गुजरती हैं।
  3. अपकेंद्रित्र 300 x जी पर 10 मिनट के लिए ट्यूब। सतह पर तैरनेवाला तो 4-6 मिलीलीटर बाँझ खासियत ग्रेड 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 7.4 पीएच (स्टॉक समाधान) में गोली resuspend aspirate।
  4. परजीवी बीच बड़े वर्ग के चार कोने और केंद्र वर्गों में परजीवी की संख्या तो बसा गिनती करने के लिए शेयर समाधान के 10 μl के साथ एक hemocytometer लोड, 5-10 मिनट इंतज़ार करो।
  5. पैरा पतला100K / 200 μl की उचित inoculum आकार करने के लिए साइटों पीबीएस तो 200 μl की कुल मात्रा के साथ intraperitoneally (आईपी) चूहों इंजेक्षन 1x।
    नोट: इस प्रक्रिया के लिए, चूहों 100K प्रकार III (सीईपी) पीबीएस 1x 200 μl में 13 tachyzoites साथ inoculated थे। Toxoplasma के अन्य उपभेदों के साथ चूहों को संक्रमित करते हैं, inoculum की एकाग्रता डाह के स्तर के लिए खाते में समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

2. छिड़काव और मस्तिष्क संचयन

नोट: इस अल्सर के शिखर संख्या माउस मस्तिष्क में पाए जाते हैं, जिस पर समय बिंदु का प्रतिनिधित्व के रूप में इस प्रोटोकॉल के 21 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) में आयोजित किया गया है, लेकिन अन्य समय बिंदुओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 17 - अल्सर का आकार, संख्या, स्थान, और उपस्थिति या अनुपस्थिति माउस तनाव, परजीवी तनाव प्रकार के रूप में अच्छी तरह से inoculum आकार 7,14 सहित कई कारकों पर निर्भर करता है। जांचकर्ताओं को व्यक्तिगत रूप से माउस और Toxoplas के लिए उपयुक्त inoculum का निर्धारण करने की आवश्यकता होगीमा तनाव वह / वह उपयोग करता है।

  1. सेटअप सभी शल्य कटाई उपकरण (चित्रा 1)।
  2. प्रत्येक माउस के लिए, तैयार करने और बर्फ पर रख: 0.9% सोडियम क्लोराइड (NaCl) के साथ भरा 20ml सिरिंज + 10 यू / एमएल हेपरिन 1x बाँझ खासियत ग्रेड पीबीएस (हेपरिन / खारा) में; 20 मिलीलीटर सिरिंज 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ भर दिया; 15 मिलीलीटर 4% पीएफए ​​के साथ जगमगाहट शीशी। कई चूहों के लिए, तो प्रत्येक छिड़काव के लिए समाधान का पूरा एक ताजा सिरिंज आकर्षित सभी चूहों के लिए आवश्यक प्रत्येक समाधान की पूरी राशि के साथ भरा बीकर तैयार करते हैं।
  3. 200 μl / Ketamine / xylazine कॉकटेल के शरीर के वजन के 25 ग्राम (24 मिलीग्राम / एमएल और 4.8 मिलीग्राम / क्रमशः एमएल) ब्याज के दिन के साथ माउस आईपी anesthetize। पैर के अंगूठे चुटकी पलटा जाँच करके संज्ञाहरण के स्तर के लिए माउस मॉनिटर। माउस एक फर्म पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए कोई प्रतिक्रिया से पता चलता है कि केवल एक बार प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: संज्ञाहरण के उचित स्तर से पहले तक पहुँच जाता है के रूप में संज्ञाहरण के अन्य तरीकों के रूप में लंबे समय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने से।
  4. कवर फोम मंच पर लापरवाह स्थिति में माउस रखें। तो 70% इथेनॉल (EtOH) (2A चित्रा) के साथ सीने और पेट स्प्रे पैरों पर सभी चार अंगों बाहर पिन। माउस के तहत कई बाँझ कागज तौलिये के अलावा छिड़काव तरल पदार्थ की बाढ़ को अवशोषित करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. सिर्फ संदंश के साथ उरोस्थि नीचे लिफ्ट त्वचा तो एक चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। छाती (चित्रा 2 बी) को बेनकाब करने के लिए वापस त्वचा खींचो।
  6. प्रक्रिया असिरूप लिफ्ट और दो टूक दूर डायाफ्राम से विच्छेदित है जो जिगर को प्रकाश में लाने के लिए, बस डायाफ्राम के नीचे एक पेट चीरा बनाते हैं। दो चीरों, बाईं ओर एक और डायाफ्राम के माध्यम से सही और पसलियों के तल पर एक बनाओ। लगभग 1 / 2-2 / 3 तरह से ऊपर तो छाती गुहा (चित्रा -2) खोलने के लिए वापस परिलक्षित होता है जो ribcage, बाएँ और दाएँ चीरों बढ़ाएँ।
    नोट: ध्यान रखना किसी भी अंगों में कटौती नहीं करने या प्रमुख रक्त वाहिकाओं duछिड़काव की गुणवत्ता में समझौता होगा ऐसा करने के रूप में इस प्रक्रिया की अंगूठी।
  7. 10-20 मिलीलीटर 4% पीएफए ​​के द्वारा पीछा 10-20 मिलीलीटर हेपरिन / खारा के साथ transcardially छिड़कना।
    नोट: छिड़काव ठीक से किया जाता है, तो जिगर (चित्रा 2 डी) तन लाल से बंद हो जाएगा। ठीक से नहीं किया है, तो रक्त वाहिकाओं दिखाई (चित्रा 2 ई) हो जाएगा।
  8. अपने पेट पर पर माउस मुड़ें, फिर से पिन पैर तो 70% EtOH के साथ सिर और गर्दन स्प्रे। गर्दन के आधार से त्वचा लिफ्ट और एक चीरा बनाते हैं। खोपड़ी (चित्रा 2 एफ) को बेनकाब करने के लिए त्वचा निकालें। कंधे के स्तर पर सिर सिर काटना। धीरे मस्तिष्क को हटा दें, खोपड़ी निकालें, और 4% पीएफए ​​(चित्रा 2 जी एच) से भरा एक जगमगाहट शीशी में जगह।
    नोट: अच्छी तरह से perfused हैं, मस्तिष्क नहीं दिखाई रक्त वाहिकाओं (चित्रा 2I) के साथ सफेद दिखाई देगा। मस्तिष्क में अच्छी तरह से perfused नहीं है, तो रक्त वाहिकाओं दृश्यमान (चित्रा 2J) हो जाएगा।
  9. झलक रखें4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए ​​में मस्तिष्क के साथ tion के शीशी रातोंरात, प्रकाश से कवर किया। ठंडा 1x पीबीएस के साथ भरा एक नई जगमगाहट शीशी के लिए गैर-खासियत ग्रेड 1x पीबीएस में मस्तिष्क और हस्तांतरण कुल्ला। प्रकाश से कवर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में मस्तिष्क, स्टोर।
    नोट: सफल समाशोधन और इमेजिंग अप करने के लिए एक महीने के लिए 1x पीबीएस में संग्रहीत वर्गों के साथ पूरा किया लेकिन पीएफए ​​निर्धारण रिवर्स जाएगा और पीबीएस में लंबे समय तक भंडारण के रूप में कुछ दिनों के भीतर मस्तिष्क इष्टतम छवियों से भी कम समय के लिए ले जा सकता है कि यह अनुभाग के लिए सबसे अच्छा है किया गया है । Autofluorescence और बढ़ कलंक एक महीने या उससे अधिक समय के लिए 1x पीबीएस में भंडारण के बाद imaged कुछ वर्गों में उल्लेख किया गया है।

3. मस्तिष्क सेक्शनिंग

  1. 1x पीबीएस से मस्तिष्क निकालें और अधिक सटीक के लिए अनुमति देने के लिए एक मस्तिष्क मैट्रिक्स (चित्रा 3A) में डाल दिया है और यहां तक कि मस्तिष्क के माध्यम से कटौती। अगर मौजूद है, सेरिबैलम और घ्राण बल्ब बंद ट्रिम, और उसके बाद 2 या 3 वर्गों में coronally मस्तिष्क में कटौती।
  2. Cyanoacrylate के साथ एक नमूना बढ़ते ब्लॉक पर प्रत्येक मस्तिष्क खंड प्रत्यय। समर्थन के लिए मस्तिष्क खंड (3B चित्रा) के पीछे 5% agarose जेल की एक छोटी सी ब्लॉक प्रत्यय।
    नोट: अन्य समर्थन तंत्र में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन समर्थन के बिना, Vibratome असमान सेक्शनिंग के कारण मस्तिष्क पर धक्का कर सकते हैं।
  3. Vibratome साथ मोटी वर्गों एक चार की गति और 9 के आयाम करने के लिए सेट 160 माइक्रोन (इमेजिंग के लिए इस्तेमाल उद्देश्य से काम कर दूरी) में ऊतक में कटौती।
    नोट: गति और आयाम के लिए सेटिंग्स विशेष मशीन के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, यहां तक ​​कि चिकनी वर्गों को प्राप्त करने के क्रम में इस्तेमाल किया जा रहा है। सेटिंग कर रहे हैंसही नहीं है, परिणाम असमान वर्गों, ऊतक या बकवास के निशान से फाड़ हो सकता है।
  4. वे एक सप्ताह के भीतर मंजूरी दे दी हो जा रहे हैं 1x पीबीएस ठंडा ताजा के साथ भरा एक जगमगाहट शीशी में ऊतक वर्गों लीजिए। वर्गों एक सप्ताह के भीतर मंजूरी दे दी हो के लिए नहीं जा रहे हैं, -20 डिग्री सेल्सियस पर cryopreservative समाधान और दुकान के साथ भरा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में जगह वर्गों।

मस्तिष्क ऊतक वर्गों के 4. ऑप्टिकल क्लियरिंग

नोट: इस प्रोटोकॉल एक पहले प्रकाशित विधि 8 से संशोधित किया गया है।

  1. 1x पीबीएस + 2% बीच 20 (जीएल / PBST) में 25%, 50%, 75% और 90% वॉल / वॉल ग्लिसरॉल तैयार करें।
  2. Cryopreservative में अगर, 1x पीबीएस में कुल्ला और 25% जीएल / PBST के 10 मिलीलीटर युक्त एक जगमगाहट शीशी के लिए स्थानांतरण, 1x पीबीएस से वर्गों निकालें या। 12 घंटे के लिए, जोखिम से प्रकाश को कवर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर जगह शीशी।
  3. सभी वर्गों बो को डूब चुके हैं कि इस बात की पुष्टिशीशी के ttom। वर्गों तो 12 घंटे के लिए, प्रकाश के संपर्क से कवर किया, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन पर 10 एमएल 50% जीएल / PBST के साथ शीशी और जगह भरने को कवर करने के लिए अभी पर्याप्त छोड़ रहा है, 25% जीएल / PBST aspirate। 75% जीएल / PBST तो 90% जीएल / PBST के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं। अधिक से अधिक समाशोधन तक पहुंचने के लिए 24 घंटे के लिए 90% जीएल / PBST में वर्गों के लिए छोड़ दें। समाशोधन प्रक्रिया के दौरान, क्रमिक ऑप्टिकल समाशोधन (चित्रा 4) का पालन।
    नोट: समाधान वर्गों शीशी की तह तक डूब गईं तुरंत बाद बदल रहे हैं, तो इस प्रक्रिया में तेजी लाई जा सकती है। 75% और 90% समाधान में, वर्गों शीशी के नीचे करने के लिए सभी तरह से सिंक नहीं होगा, लेकिन बीच में जारी करेगी।

5. बढ़ते मस्तिष्क ऊतक वर्गों

  1. एक स्पेसर बनाने के लिए 5 टुकड़ों में एक नहीं, 1.5 coverslip के काटें। चित्रा 5 ए में दिखाया गया धराशायी लाइनों के साथ coverslip के स्कोर और तोड़ने के लिए एक शासक और हीरे की इत्तला दे दी पेंसिल का प्रयोग करें। त्यागें टीवह एक खिड़की बनाने के लिए एक सादे गिलास स्लाइड पर चार बाहरी टुकड़े की व्यवस्था, टुकड़ा केंद्र है, और उसके बाद सही विन्यास (चित्रा 5 ब) में स्लाइड करने के लिए स्पेसर के टुकड़े पालन करने के लिए तेजी के पर स्पष्ट नेल पॉलिश ब्रश।
    नोट: स्पेसर स्लाइड और मंजूरी दे दी वर्गों बढ़ते के लिए coverslip के बीच आवश्यक जगह बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। coverslip के लिए आवश्यक किसी भी आकार खिड़की बनाने के लिए अलग अलग तरीकों में कटौती हो सकती है। पूर्व में कटौती फोम spacers के भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। नेल पॉलिश पूरी तरह से शुष्क करने की अनुमति के लिए, यह कम से कम एक दिन पूर्व बढ़ते वर्गों के लिए spacers के साथ स्लाइड बनाने के लिए सबसे अच्छा है।
  2. टिप के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet का उपयोग एक स्लाइड पर स्थानांतरण वर्गों काट दिया। 90% जीएल / PBST के साथ आसपास के क्षेत्र में भरने के लिए सुनिश्चित करें। ध्यान से यकीन है कि किसी भी बुलबुले परिचय नहीं कर रही वर्गों पर एक coverslip कम है। अतिरिक्त जीएल / PBST एक प्रकार का वृक्ष मुक्त पोंछे के साथ दूर दुष्ट हो सकता है।
  3. छवि + GFP आरएफपी युक्त न्यूरॉन्स + (चित्रा 7A-बी) तो दुकान स्लाइड्स फ्लैट और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से कवर के साथ Toxoplasma gondii अल्सर।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, पूरी तरह से सील भर के सभी किनारों की दुकान और एक बाद में समय पर imaged करने के लिए स्लाइड। स्लाइड सील करने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग वैकल्पिक है और एक आगे की प्रक्रिया के लिए एक बाद की तारीख में स्लाइड से वर्गों को दूर करने के लिए गए थे कि अगर इसे और अधिक कठिन coverslip के दूर करने के लिए कर सकते हैं।

6. इमेजिंग

नोट: कोई माइक्रोस्कोप उच्च संकल्प जेड के ढेर को प्राप्त करने की क्षमता है कि इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. शुरू में 10X पर फोकल हवाई जहाज़ खोजने के बाद, एक 20x उद्देश्य को बदलने के लिए और एक + GFP सेल के अंदर स्थित एक पुटी की पहचान करने के लिए खंड के माध्यम से स्कैन। देखने के क्षेत्र में ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र केंद्र।
  2. एक 40x उद्देश्य के लिए परिवर्तित करें। सुनिश्चित करें कि पूरे आरओआई के माध्यम से ऊपर और नीचे फोकस पूरे सेल और cyसेंट दिखाई दे रहे हैं।
    नोट: छवियाँ एक 40x / 1.30 तेल डीआईसी M27 के उद्देश्य के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर प्राप्त किया गया।
  3. स्थापित इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, पुटी के साथ पूरे सेल भी शामिल है कि एक z ढेर प्राप्त करते हैं। छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल औसत सेटिंग्स 6 चित्र में दिखाया जाता है।
    नोट: प्रत्येक सेटिंग के जांचकर्ताओं ऊतक वर्गों और माइक्रोस्कोप क्षमताओं के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  4. 64 अनुमानों की संख्या निर्धारित करके एक पूर्ण घूर्णी दृश्य प्राप्त करने के लिए 1. अनुमानों की संख्या निर्धारित करके z ढेर की एक अधिकतम प्रक्षेपण छवि प्राप्त करते हैं।
    नोट: अन्य सॉफ्टवेयर संकुल उपलब्ध हैं और अधिकतम प्रक्षेपण प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, घूर्णी के रूप में अच्छी तरह से Z ढेर छवियों के अन्य विचार।
  5. इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ छवि का विश्लेषण करें।

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Representative Results

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चित्रा 7 ए और बी के इस नए कि पुटी युक्त दो अलग-अलग 160 माइक्रोन मोटी वर्गों के साथ-साथ चित्रा 7B के लिए पुटी के लिए सेल शरीर से दूरी के एक प्रतिनिधि के माप। आंकड़ों से + GFP न्यूरॉन्स को वर्णन 7 दो के प्रतिनिधि छवियों शामिल प्रोटोकॉल अपनी संपूर्णता में संक्रमित न्यूरॉन के दृश्य के लिए अनुमति देता है। चित्रा 7C इस इमेजिंग तकनीक के साथ, यह पुटी और सेल शरीर (Imaris 7.7) के बीच की दूरी यों के लिए अब संभव है कि पता चलता है। चित्रा 7 दिन चित्रा की एक पूरी घूर्णी दृश्य है 7B। इस तरह से z ढेर के दृश्य सेल और पुटी का पूरा कब्जा के सत्यापन के लिए अनुमति देता है। चित्रा 7E 7 दिन से छवि को पुटी से दूरी को मापने के लिए Imaris 7.7 सॉफ्टवेयर के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है कि कैसे दिखा एक 3 डी घूर्णी फिल्म है सेल शरीर से या तो मध्यम से मध्यम ओआर बढ़त को बढ़त मिली है। दिखाया माप सेल शरीर के लिए वास्तविक + GFP प्रक्रिया के बाद पुटी और सेल शरीर, एक माप के बीच एक सीधी रेखा का उपयोग किया गया था, हालांकि यह भी उत्पन्न हो (डेटा) नहीं दिखाया जा सकता है।

चित्रा 1
चित्रा 1: माउस मस्तिष्क को हटाने के लिए सर्जिकल उपकरण। (ए) शोषक पैड। फुट नीचे पिन (बी) फोम ब्लॉक। (सी) सुइयों। (डी) 25 जी रक्त संग्रह सेट। (ई) 3 तरह पानी निकलने की टोंटी। (एफ) हेपरिन / खारा के लिए 20 मिलीलीटर सिरिंज। ( जी) 4% पीएफए। (एच) अँगूठा संदंश के लिए 20 मिलीलीटर सिरिंज। (मैं) ठीक कैंची, तेज-तेज, पक्ष की कोणीय। (जे) तीव्र तेज कैंची। (कश्मीर) केली hemostats। (एल) मेयो कैंची। (एम) (एन) जगमगाहट शीशी। स्केल बार = 8 सेमी।

चित्रा 2
चित्रा 2: फसल काटने वाले माउस मस्तिष्क। अनुचित छिड़काव के बाद (ए) माउस नीचे टिकी और सीने में 70% EtOH के साथ छिड़काव किया। (बी) उजागर छाती। (सी) छाती गुहा खुला। उचित छिड़काव के बाद (डी) जिगर। (ई) जिगर। (एफ) उजागर खोपड़ी। ( हटाया आधा खोपड़ी के साथ जी) मस्तिष्क। (एच) उचित छिड़काव के बाद 4% पीएफए। (मैं) मस्तिष्क के साथ भरी शीशी में काटा मस्तिष्क। (जे) ब्रेन अनुचित छिड़काव के बाद।

चित्रा 3
चित्रा 3: माउस मस्तिष्क सेक्शनिंग। (ए) माउस मस्तिष्क मातृ एक्स। (बी) माउस मस्तिष्क और agarose जेल ठंडा 1x पीबीएस के साथ भरा Vibratome कक्ष के अंदर cyanoacrylate के साथ ब्लॉक बढ़ते चिपका।

चित्रा 4
चित्रा 4: समाशोधन प्रक्रिया समाशोधन प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के दौरान एक चूहे के मस्तिष्क खंड के प्रतिनिधि छवियाँ।।

चित्रा 5
चित्रा 5: काटना और स्लाइड करने के लिए स्पेसर फिक्सिंग। 5 टुकड़ों में coverslip के काटने के लिए प्रतिनिधि अंक के साथ एक। सं 1.5 coverslip के। बी। कटौती coverslip के प्रत्येक टुकड़े के साथ सादे गिलास स्लाइड एक खिड़की बनाने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ जगह में हमला बोला।

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चित्रा 6: छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल सामान्य मापदंडों की स्क्रीन शॉट।

चित्रा 7
चित्रा 7:। Toxoplasma gondii अल्सर दूर neuronal प्रक्रियाओं के भीतर निवास कर सकते हैं (एबी) अधिकतम प्रक्षेपण GFP की छवियों + आरएफपी + अल्सर (सफेद तीर) युक्त न्यूरॉन्स। स्केल बार = 20 माइक्रोन। (सीई) बी में दिखाया गया पुटी-न्यूरॉन संबंधों के अतिरिक्त दृश्य और विश्लेषण प्रदान करते हैं। सेल शरीर के किनारे करने के पुटी के किनारे से दूरी (सी) Imaris जनित सीधी रेखा माप (149μm )। (डी) 3-डी घूर्णी फिल्म । (ई) Imaris जनितwww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video चित्रा 7E.avi "लक्ष्य =" _blank "से पुटी के लिए सेल शरीर माप दिखा> 3-डी फिल्म दोनों के मध्यम से मध्यम (163 माइक्रोन) और बढ़त को बढ़त (149 माइक्रोन)।

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Discussion

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संक्रमित मेजबान कोशिकाओं में सेलुलर परिवर्तन ऐसे एचआईवी, रेबीज, और क्लैमाइडिया 18,19 के रूप में अन्य इंट्रासेल्युलर जीवों के साथ संक्रमण में इस रोग के परिणामों से जोड़ा गया है यह देखते हुए कि, हम हमारे सीएनएस के बीच होती है कि अंतरंग बातचीत का अध्ययन करने की अनुमति होगी कि एक तकनीक विकसित की सेल और Toxoplasma की मेजबानी। यहाँ वर्णित विधि लंबे समय से संक्रमित न्यूरॉन्स की कुशल इमेजिंग सक्रिय करने के द्वारा इस लक्ष्य को accomplishes। इस पद्धति का विकास करने से पहले, ऐसे इमेजिंग समय लगता है, महंगा, या संभव नहीं था।

अब हम ऐसे परजीवी द्वारा लक्षित विशिष्ट neuronal क्षेत्रों के रूप में Toxoplasma -neuron बातचीत के बारे में बुनियादी सवालों, जवाब देने के लिए इस तकनीक का उपयोग कर सकते हैं? इस Toxoplasma उपभेदों के बीच अलग करता है? पुटी (यानी संक्रमित करते हैं और एक ही न्यूरॉन से असंक्रमित डेन्ड्राइट कांटा का ही नंबर है सेल के बाकी हिस्सों से अलग-अलग रहता है, जिसमें सेलुलर क्षेत्रों करो)? संक्रमित न्यूरॉन्स द्वारा साझा सेलुलर लक्षण क्या हैं? इस तरह के सवालों के जवाब देने की क्षमता Toxoplasma संक्रमण व्यवहार के स्तर पर, सहित सीएनएस कैसे परिवर्तन को समझने के लिए आवश्यक है।

सबसे अच्छा संभव छवियों को प्राप्त करने के लिए, यह ऊतक भी वर्गों में कट जाता है सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। वर्गों असमान हैं, coverslip के उप इष्टतम इमेजिंग में जिसके परिणामस्वरूप उद्देश्य के साथ असमान संपर्क करने के लिए अग्रणी खंड पर ठीक से बैठ नहीं है। इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के दौरान, कई संशोधन किए गए थे। मूल समाशोधन प्रक्रिया SeeDB 20 के रूप में जाना एक तकनीक में दिखाया गया है परिणामों को पुन: पेश करने की कोशिश में फ्रुक्टोज के साथ किया गया था। यह आरएफपी (विशेष रूप से mCherry) बुझती के रूप में इस विधि को इस मॉडल के साथ तालमेल नहीं था। एक और महत्वपूर्ण कदम है और सभी की शायद सबसे महत्वपूर्ण ऊतक वर्गों की अधिक से अधिक समाशोधन के लिए अनुमति है। ठीक से साफ नहीं हैं, पृष्ठभूमि प्रकाश विवर्तन अधिक हो जाएगा औरछवियों शोर हो जाते हैं। हम ग्लिसरॉल करने के बीच 20 के अलावा अकेले ग्लिसरॉल की तुलना में थोड़ा साफ छवि दिया पाया। वर्तमान प्रौद्योगिकी हमें 160μm मोटी मस्तिष्क ऊतक वर्गों के माध्यम से z ढेर छवियों को प्राप्त करने के लिए, लेकिन भविष्य में, हम और भी गहराई से विश्लेषण में के लिए अनुमति देने के लिए 500 माइक्रोन या अधिक करने के लिए इस मोटाई में वृद्धि देख रहे हैं अनुमति देता है।

यह केवल पूरे सेल और हम मस्तिष्क में विश्व स्तर पर Toxoplasma से प्रभावित है कि कैसे एक यंत्रवत विचार विकसित करने के लिए शुरू कर सकते हैं कि अपने कनेक्शन को देखकर है। इस नए प्रोटोकॉल एकल कोशिका के स्तर पर Toxoplasma -neuron बातचीत का अध्ययन करने और एक तेजी से, किफायती तरीके से ऐसा करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है। हम इस प्रोटोकॉल के लिए क्षमता का उपयोग करता है सभी का पता लगाने के लिए अभी तक है और यह अन्य प्रणालियों के लिए अनुवाद कर सकते हैं कि कैसे, लेकिन हम इसे कई अनुप्रयोगों होगा आशा।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए पूरे कोशी प्रयोगशाला धन्यवाद। हम पैटी Jansma और सलाह के लिए एरिजोना के तंत्रिका विज्ञान विभाग के विश्वविद्यालय धन्यवाद और इमेजिंग के साथ मदद की। हम भी उनके Vibratome के उपयोग के लिए Porreca प्रयोगशाला धन्यवाद। इस शोध अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच NS065116, AAK) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System Technical Products International, Inc. Other vibratomes are compatible
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Premium Slides Fisher Scientific 12-544-2
#1.5 Coverslips VWR 48393 251
Diamond Scriber VWR 52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope Zeiss LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml Western Medical Supply, Inc. 4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml Lloyd Inc.
ZsGreen Mice Jackson Laboratories 7906 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) HyClone SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine Corning 25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask Fisher Scientific 1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium VWR 45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade amresco K813-500ml
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Bright-Line Hemocytometer Sigma-aldrich Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS005-1
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-aldrich H3393-100KU
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials Fisher Scientific FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof In-house 17212945 This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software Bitplane
Clear nail polish Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok VWR BD309604 Other syringes are compatible
Three-way Stopcock Any brand is compatible
Hypodermic needle Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter Greiner Bio-One 450099 Other brands are compatible

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:

Anita A. Koshy, Carla M. Cabral

to:

Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

न्यूरॉन्स की 3 डी इमेजिंग और विश्लेषण संक्रमित<em&gt; Vivo</em&gt; साथ<em&gt; Toxoplasma gondii</em
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Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).More

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).

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