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Summary
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다.
Abstract
톡소 포자충은 인간과 설치류를 포함한 광범위한 호스트 범위와 의무적 인, 세포 내 기생충이다. 모두 인간과 설치류에서, 톡소 플라스마는 뇌의 평생 지속적인 감염을 설정합니다. 이 뇌 감염이 태아 또는 뇌의 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS) 환자에 대한이 편애 및 지속성 등의 면역 개인, 대부분의 면역 사람들 무증상이지만 파괴적인 신경 학적 질환으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 뇌 - 톡소 상호 작용에 의해 생성 톡소 질병 증상에 중요하다, 그러나 우리는 중추 신경계 (CNS) 및 기생충 세포 간의 세포 또는 분자 상호 작용의 이해가 작은 것은 분명하다. CNS의 마우스 모델에서이 신경 기생충가 지속되는 세포 인 30 년 이상 알려져있다 톡소 플라스마 증,하지만 약간의 정보는 약 사용 가능신경 세포의 일부는 일반적으로 (소마, 수상 돌기, 축색 돌기를) 감염이 세포 관계는 긴장 사이에서 변경하는 경우. 부분에서는 부족은 촬상의 어려움과 이차 전체 감염된 동물로부터 신경 세포를 시각화한다. 이러한 이미지는 통상적으로 직렬 절편 및 전자 현미경 또는 면역 염색 후 공 초점 현미경에 의해 촬상 조직 봉합을 필요로한다. 몇 가지 기술을 조합하여, 여기에 기재된 방법은 면역의 필요없이 입체 시각화 및 개별 만성적 감염 뉴런의 분석을 가능하게 식별하고 낭종이 포함 된 이미지 전체 셀에 두꺼운 부분의 사용 (160 μm의) 사용, 전자 현미경 , 또는 직렬 절편과 바느질. 이 기술을 사용하여, 우리는 기생충 감염 및 신경 세포 사이의 관계를 이해하기 시작할 수있다.
Introduction
이 방법의 전체 목표는 고해상도, 의무적 인 세포 내 기생충 톡소 포자충에 감염 개별 뉴런의 3 차원 영상을 얻는 것이다.
톡소 때문에 종종 인간과 설치류를 포함 대형 중간 숙주 범위의 가장 성공적인 기생충 중 하나를 간주됩니다. 인간과 쥐 모두에서, 오염 된 음식이나 물을 섭취를 통해 급성 감염 후, 톡소 플라스마는 양식을 그 느린 복제로의 빠른 복제 양식 (tachyzoite)에서 변환 encysting에 의해 중추 신경계의 지속적인 감염을 일으킬 수있다 (bradyzoite ). 면역 개인,이 잠재 중추 신경계 감염은 비교적 증상이없는 것으로 생각되지만, 에이즈 환자 또는 이식 환자와 같은 면역 개인에, 기생충의 재발은 치명적인 toxoplasmic 뇌염 1,2로 이어질 수 있습니다. 또한, 최근의 연구 하메커니즘은 알 수없는 남아 있지만 톡소 플라스마와 잠재 감염, 설치류 3,4의 행동 변화로 이어질 수있는 것으로 나타했습니다.
놀랍게도, CNS- 톡소 상호 작용의 중요성을 강조하는 이들 데이터에도 불구하고, 비교적 작은, 특히 세포 및 분자 수준에서,이 관계에 대해 공지되어있다. 뇌 기생충 상호 작용의도 간단한 측면을 연구하는 기능은 technologic의 제한에 의해 부분적으로 방해하고있다. 예를 들어, 대부분의 작업은 뉴런 낭종 전자 현미경 (EM) 5,6- 수행 한 지속되는 셀임을 나타내는. EM은 높은 해상도를 제공하지만, 그것은 시간이 소요, 노동 집약적, 비싸다. 면역 형광 (IF) 분석은 최근 EM (7)에 의해 수행 된 작업을 확인하기 위해 공 초점 현미경과 함께 사용되어왔다. 분석은 수행 할 기술적으로 쉽고 상대적으로 저렴하지만, 언더에 이러한 기술을 사용하는 경우TAND 낭종과 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계는 시간, 기술적으로 어려운 소비하고, 중요한 정보의 손실을 초래할 수있는 시리얼 재건을 필요로한다. 따라서, 우리는 CNS의 톡소 플라즈마 증의 마우스 모델을 사용하고 EM 또는 면역 조직 화학 (IHC)없이 이미지에 감염된 신경 세포의 전체를 우리를 허용 할 수있는 방법을 개발했다. 이러한 기술을 개발함으로써, 우리는 상대적으로 신속하고 저렴한 방법으로 감염된 세포와 낭종 사이의 세포의 관계를 탐구하기 시작할 수 있습니다.
우리가 개발 한 방법은 기생충 단백질 9,10 주입 된 생체 세포에 표시하는 시스템과 공 초점 현미경 (8)에 의해 광학적으로 청소 및 이미징 두꺼운 뇌 섹션에 대한 새로운 기술을 결합합니다. 이 시스템에서는, 톡소와 재결합 11 치운다 매개 된 후에 만 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 치운다 리포터 생쥐에 감염 (9)에 Cre 호텔 재조합 효소를 주입 계통. 이 조합은 중추 신경계 감염이 설정된 후, 감염된 마우스의 뇌를 수확 두께 뇌 부분을 잘라 빠르게 RFP + 낭종을 찾아 이미지에 관련된 영역을 식별 할 수있게 해준다. 또한 GFP의 숙주 세포 발현 GFP + 세포의 수는 10 기생충을 포함하지 않는, 기생충 감염에 의해 Cre 호텔의 주입에 전적으로 의존하지 같이 것을 주목하는 것이 중요하다. 이 프로토콜의 목적은 화상 전체의 감염된 뉴런 할 수 있도록하기 때문에, 초점은 GFP + 또한 RFP + 낭종이 포함 뉴런이지만, 프로토콜은 또한 이미지에 GFP + / RFP를 사용할 수 - 뉴런.
감염된 뇌 수확 및 절단되면, 섹션은 글리세롤 청산에 의해 투명하게 렌더링됩니다. 섹션들의 적절한 영역이어서 초점 현미경, 알을 촬상감염된 숙주 세포 및 그 전체 포낭 기생충과 같은 전례 시각화. 여기서 우리는 식별을위한 완전한 프로토콜, 광학 청소, 및 이미징 감염된 신경 세포를 제공한다.
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Protocol
참고 : 마우스는 아리조나 대학에서 음식과 물을 사용할 수 임의로 빛 / 어둠주기를 반전 사육 12 시간과 온도 및 습도 조절 실에서 유지되었다. 실험 지침과 아리조나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인하에 실시 하였다. 모든 노력은 고통을 최소화하기 위해 만들어졌다. Cre 호텔 - 기자 마우스 C57BL / 6 배경 (11)에 있으며 상업적으로 사용할 수 있습니다.
1. 마우스 감염
참고 : - (12) 아래에 설명 톡소 포자충와 마우스 감염의 방법은 이전에 10 발표 된 연구에 사용되어왔다.
- 섬유 아세포 (HFFS) 인간 포피 톡소에서 균주를 성장 둘 베코 고혈당 배양 이글스 중간 (DMEM)를 10 % FBS가 보충 된 수정, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎎ / ㎖ strept5 % CO 2 인큐베이터 안에서 T-25 플라스크에서 omycin, 및 2 mM L- 글루타민 (cDMEM)는 기생충 큰 parasitophorous 액포가 형성 될 때까지.
- 다음, 27 게이지 바늘에 연결된 5 ㎖ 주사기 경우에 모든 용액을 전송 플라스크 내부의 2 배를 플라스크의 바닥으로부터 세포를 긁어 및 3 ㎖ 주사기에 연결된 25 게이지 바늘을 통해 생성 된 용액을 통과시킴으로써 주사기 용출 기생충 그 거꾸로 15 ML 원뿔 관 내부에 배치되었습니다. 주사기 플런저를 연결하고 원뿔 튜브에 기생충 솔루션을 전달합니다.
- 원심 분리기 (300)의 X g에서 10 분 동안 튜브. 그리고 나서 상등액을 4-6 ml의 멸균 USP 등급 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.4 (원액)에 펠렛을 재현 탁 대기음.
- 기생충 가운데 큰 사각형의 네 모서리와 중앙 광장에 기생충의 수를 다음 정착 계산하는 원액 10 μL와 혈구를 넣고 5 ~ 10 분을 기다립니다.
- 파라 희석100K / 200 μL의 적절한 접종량에 사이트 후 PBS 200 ㎕의 총 부피로 복강 내 (IP) 주입 된 마우스 배일.
참고 :이 절차를 들어, 마우스는 100K 유형 III (CEP) PBS 1X 200 μL 13 tachyzoites에 접종 하였다. 톡소 플라스마의 다른 균주와 마우스를 감염되면 접종의 농도는 독성의 수준을 고려하여 조정해야 할 수도 있습니다.
2. 관류 및 뇌 수확
주 :이 낭종 피크 번호 마우스의 뇌에서 발견되는 시점을 나타내는 바와 같이이 프로토콜은 이십일일 감염 후의 수 (dpi)에서 수행되었지만, 다른 시점이 사용될 수있다. 17 - 낭종 크기, 개수, 위치 및 유무 마우스 균주, 균주 기생충 타입뿐만 아니라 접종량 7,14를 포함하는 다양한 인자에 의존한다. 수사관들은 개별적으로 마우스와 Toxoplas에 대한 적절한 접종을 결정해야합니다엄마의 변형은 그 / 그녀는 사용합니다.
- 설치 모든 수술 수확 도구 (그림 1).
- 각 마우스의 경우, 준비하고 얼음에 보관 : 0.9 % 염화 나트륨 (NaCl을) 가득 20ml의 주사기를 + 10 U / ㎖ 헤파린 1X 멸균 USP 등급 PBS (헤파린 / 식염수)에; 20 ML의 주사기는 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 가득; 15 ml의 4 % PFA와 섬광 유리 병. 여러 쥐를 들어, 각 관류 솔루션의 전체 신선한 주사기를 그리는 모든 마우스에 필요한 각 솔루션의 전체 양 가득 비커를 준비합니다.
- 200 μL / 케타민 / 크 실라 칵테일의 체중 25g (24 ㎎ / ㎖ 및 4.8 ㎎ / 각각 ml)에 관심이있는 날에 함께 마우스 IP를 마취. 발가락 핀치 반사를 확인하여 마취의 수준에 대한 마우스를 모니터합니다. 마우스가 회사 발가락 핀치에 대한 응답을 보여줍니다 만하면 프로토콜을 계속합니다.
주 : 마취 적절한 레벨에 도달하기 전에 마취로하는 다른 방법은 한 사용될 수있다프로토콜을 진행. - 적용 대상 거품 플랫폼에서 앙와위에서 마우스를 놓습니다. 다음 70 % 에탄올 (EtOH로) (그림 2A)와 함께 가슴과 복부를 스프레이 발 사지를 핀입니다. 무균 마우스하에 여러 종이 타월 첨가 관류 액의 오버 플로우를 흡수하는 데 도움이 될 수있다.
- 단지 집게로 흉골 아래 리프트 피부는 절개를 만들기 위해 가위를 사용합니다. 가슴 (그림 2B)을 노출 다시 피부를 당겨.
- 과정을 칼 모양의 올리고 퉁명스럽게 멀리 다이어프램에서 해부 간을 노출, 횡격막 바로 아래 복부 절개를합니다. 두 절개, 왼쪽에 하나, 다이어프램을 통해 오른쪽 갈비뼈 아래에 하나를 확인합니다. 약 1 / 2-2 / 3의 방식으로 다음 흉강 (그림 2C)를 열고 다시 반사되어 흉곽을 좌우 절개를 확장 할 수 있습니다.
참고 : 관리법은 장기를 잘라하지 않거나 주요 혈관 뒤관류의 품질을 손상 그럴 경우로이 절차를 반지. - 10 ~ 20 ml의 4 % PFA 다음 10 ~ 20 ml의 헤파린 / 식염수로 transcardially 관류.
참고 : 관류가 제대로 수행 할 경우, 간 (그림 2D)를 황갈색 빨간색에서 켜집니다. 올바르게 수행되지 않으면 혈관 표시 (도 2E)이 될 것이다. - 복부에 마우스를 뒤집어서 다시 핀 피트는 70 % EtOH로 머리와 목 스프레이. 목의 기지에서 피부를 들어 올려 절개를합니다. 두개골 (그림 2 층)을 노출 피부를 제거합니다. 어깨 레벨 헤드 참살. 부드럽게 뇌를 제거, 두개골을 제거하고, 4 % PFA (그림 2G-H)로 가득 섬광 유리 병에 넣습니다.
참고 : 잘 관류 경우, 뇌가 눈에 보이는 혈관 (그림 2I) 흰색 나타납니다. 뇌 관류 잘되지 않으면 혈관 표시 (도 2J) 될 것이다. - 불꽃 배치4 ° C에서 4 % PFA 뇌와 기의 유리 병 하룻밤, 빛 덮여. 냉장 1X PBS로 가득 찬 새로운 섬광 유리 병에 비 USP 등급 1X PBS의 뇌와 전송을 씻어. 빛 덮여 4 ° C에서 1X PBS의 뇌를 저장합니다.
노트 : 청소 및 이미징은 최대 한 달 동안 1X PBS에 저장 섹션으로 수행하지만, PFA 고정 역 것이다 PBS에서 장기간 보관으로 몇 일 이내에 뇌가 최적의 이미지 미만으로 이어질 수있는이 부분에 가장 적합한되었습니다 . 자기 형광 증가 흐림는 한 달 이상 1X PBS에 저장 한 후 몇 군데 일부 섹션에서 언급되었다.
3. 뇌 단면
- 1X PBS에서 뇌를 제거하고 더 정확한 수 있도록 뇌 매트릭스 (그림 3A)에 배치, 심지어 뇌를 잘라냅니다. 존재하는 경우, 소뇌 및 후각 전구를 손질 한 다음 2 ~ 3 개의 섹션으로 coronally 뇌를 잘라.
- 시아 노 아크릴 레이트와 시편 장착 블록 위에 각각의 뇌 부분을 붙입니다. 지원 뇌 부 (도 3b) 뒤에 5 % 아가 로즈 겔의 소 블록을 부착.
주 : 다른지지기구가 사용될 수 있지만,지지 않고, 요철 단면에 vibratome 원인 뇌 밀어있다. - 에 vibratome와 두꺼운 섹션 4의 속도와 9의 진폭으로 설정 160 μm의 (영상에 사용되는 목적의 작동 거리)로 조직을 잘라.
주 : 속도 및 진폭의 설정이 특정 시스템에 따라 조정될 수있다, 심지어 부드러운 부분을 얻기 위해 사용된다. 설정이있는 경우올바르지 않은 결과는 단차, 조직 또는 채터 마크의 인열 될 수있다. - 그들은 1 주일 이내에 삭제하려는 경우 1X PBS 차게 신선한 가득 섬광 유리 병으로 조직 섹션을 수집합니다. 섹션 1 주일 이내에 삭제하지 않을 경우, -20 ° C에서 cryopreservative 솔루션 및 저장 가득 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 넣 섹션.
뇌 조직 섹션 4. 광학 지우기
참고 :이 프로토콜은 이전에 발행 된 방식 8에서 수정되었습니다.
- 1X PBS + 2 % 트윈 -20 (GL / PBST)에서 25 %, 50 %, 75 % 및 90 % 부피 / 부피 글리세롤을 준비한다.
- cryopreservative의 경우, 1X PBS로 씻어 내고, 25 % GL / PBST 10ml를 포함하는 섬광 유리 병에 전송, 1X PBS에서 섹션을 제거하거나. 12 시간 동안, 노출 빛에 덮여 4 ° C에서 진탕에 배치 유리 병.
- 모든 섹션이 보에 침몰했는지 확인유리 병의 ttom. 섹션은 다음 12 시간 동안 빛에 노출 적용, 4 ° C에서 진탕에 10 ml의 50 % GL / PBST와 유리 병 및 장소를 채우기 충당하기 위해 충분한 떠나, 25 % GL / PBST를 대기음. 75 % GL / PBST 후 90 % GL / PBST에 대해이 과정을 반복합니다. 최대 청산에 도달하기 위해 24 시간 동안 90 % GL / PBST에 섹션을 남겨주세요. 삭제 절차의 과정 동안 점진적 광 소거 (도 4)를 관찰한다.
참고 : 솔루션 섹션은 유리 병의 바닥에 침몰 직후 변경된 경우이 과정이 신속 할 수있다. 75 % 및 90 %의 솔루션으로, 절은 유리 병의 바닥에 모든 방법을 침몰되지 않지만 중간에 떠.
5. 설치 뇌 조직 섹션
- 스페이서를 만들기 위해 5 조각으로 제 1.5 커버 슬립을 잘라. 도 5a에 표시된 점선을 따라 커버 슬립 점수 및 휴식 통치자와 다이아몬드로 만들어진 연필을 사용합니다. 취소 t그는 창을 생성하기 위해 일반 유리 슬라이드에 4 개의 외부 조각을 마련, 조각을 중심하고 올바른 구성 (그림 5B)에서 슬라이드로 스페이서의 조각을 준수하기 위해 솔기에 투명 매니큐어를 브러시.
참고 : 스페이서 슬라이드 및 삭제 섹션을 장착 커버 슬립 사이에 필요한 공간을 만드는 데 사용됩니다. coverslip에 필요한 모든 크기의 창을 만들 수있는 다른 방법으로 절단 될 수있다. 사전 컷 거품 스페이서도 시판되고있다. 매니큐어가 완전히 건조 할 수 있도록하기 위해서는 적어도 하루 전에 설치 섹션에 스페이서 슬라이드를 만드는 것이 가장 좋습니다. - 팁 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 슬라이드로 전송 섹션은 차단. 90 % GL / PBST로 주변 지역을 작성해야합니다. 조심스럽게 확인 모든 거품을 소개 않도록주의하면서 섹션을 통해 커버 슬립을 낮 춥니 다. 초과 GL / PBST는 보풀이없는 닦아 멀리 악인 할 수있다.
- 이미지 GFP + RFP를 포함하는 신경 세포 +
참고 : 또한, 인감 완전히 주위의 모든 모서리를 저장하고 나중에 영상화하는 슬라이드. 슬라이드를 밀봉 명확한 매니큐어의 사용은 선택 사항이고 다른 하나는 추가 처리를 위해 나중에 슬라이드에서 섹션을 제거 할 수 있다면 더욱 어렵게 커버 슬립을 제거 할 수 있습니다.
6. 이미징
주 : 현미경 고해상도 Z-스택을 얻는 능력을 갖고 사용할 수있다.
- 처음에 10 배에 초점면을 발견 한 후, 20 배 목표로 변경하고 GFP + 세포 내부에있는 낭종을 식별 할 섹션을 통해 스캔 할 수 있습니다. 시야에 대한 관심 (ROI)의 지역 센터입니다.
- 40X 목표로 변경합니다. 있는지 확인하기 위해 전체 투자 수익 (ROI)을 통해 아래로 초점 전체 셀 및 CYST는 볼 수 있습니다.
참고 : 이미지는 40X / 1.30 오일 DIC M27의 목적으로 공 초점 현미경을 사용하여 얻을 수 있었다. - 설치된 이미징 소프트웨어를 사용하여, 낭종 셀 전체를 포함 Z 스택을 얻었다. 이미지를 획득하기 위해 보통 사용되는 설정은도 6에 도시되어있다.
참고 : 설정은 각 연구자의 조직 섹션과 현미경의 기능에 따라 조정해야 할 수도 있습니다. - 돌기 (64)의 개수를 설정하여 전체 뷰를 구하는 회전 1. 돌기의 수를 설정하여 Z-스택의 최대 투영 화상을 얻는다.
주 : 다른 소프트웨어 패키지가 이용 가능하며 최대 투영을 얻기 위해 사용될 수 있고, 회전뿐만 아니라 Z 스택의 다른 이미지보기. - 영상 분석 소프트웨어와 이미지를 분석합니다.
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Representative Results
도 7은 A와 B가이 새로운 것을 낭종 함유 개의 상이한 160 μm의 두께 부분뿐만 아니라,도 7b에 대한 낭종 간 세포 몸으로부터의 거리의 대표적인 측정. 도면으로부터 GFP + 뉴런을 도시 7 개의 대표 화상을 포함 프로토콜은 그 전체가 감염된 신경 세포의 가시화를 허용.도 7c는이 영상 법으로는 낭종 세포체 (Imaris 7.7) 사이의 거리를 정량화하는 것이 가능하다 것을 알 수있다.도 7D는도 전체 회전 도면 7B. 이와 같이 Z 스택의 시각화 셀 낭종 완전 공략 검증을 허용한다.도 7E는도 7D의 화상에 낭종으로부터의 거리를 측정하는 Imaris 7.7 소프트웨어에 의해 분석 될 수있는 방법을 보여주는 3 차원 회전 동영상 인 전지 본체 중 어느 하나로부터 투 O 중간R 에지 - 투 - 에지. 도시 측정 전지 본체에 실제 GFP + 가공 후의 낭종 전지 본체, 측정 사이의 직선을 사용하여 수행되었지만 또한 생성 (데이터는 도시되지 않음) 수있다.
그림 1 : 마우스 뇌의 제거를위한 수술 장비. (A) 흡수 패드. 발을 고정하는 (B) 거품 블록. (C) 바늘. (D) 25 G 혈액 컬렉션 집합. (E) 3 방향 스톱 콕. (F) 헤파린 / 식염수 20 ML의 주사기. ( G) 4 % PFA. (H) 엄지 손가락 집게 20 ML의 주사기. (I) 미세 가위, 날카로운 날카로운, 옆으로 기울어 진. (J) - 샤프 날카로운 가위. (K) 켈리 지혈제. (L) 메이요 위. (M) (N) 섬광 유리 병. 스케일 바 = 8cm.
그림 2 : 수확 마우스 뇌. 부적절한 관류 후 (A) 마우스를 아래로 고정하고 가슴이 70 % EtOH로 뿌렸어요. (B) 노출 된 가슴. (C) 흉강 열립니다. 적절한 재관류 후 (D) 간. (E) 간. (F) 노출 된 두개골. ( 제거 절반 두개골 G) 뇌. (H) 적절한 관류 후 4 % PFA. (I) 뇌 가득 유리 병에 수확 된 뇌. (J) 뇌 부적절한 관류 후.
그림 3 : 마우스 뇌 단면. (A) 마우스 뇌 마트 X. (B) 마우스의 뇌와 아가 로스 젤은 냉장 1X PBS로 가득에 vibratome 챔버 내부 시아 노 아크릴 레이트와 블록을 설치에 부착.
도 4 : 프로세스 지우기 클리어링 프로세스의 각 단계 동안 마우스 뇌 단면의 대표적인 이미지..
그림 5 : 절단 및 밀어 스페이서를 고정. 5 조각으로 커버 슬립을 절단 대표 자국이와. 제 1.5 커버 슬립. B. 컷 커버 슬립의 각 부분과 일반 유리 슬라이드는 윈도우를 만드는 데 분명 매니큐어 제자리에 압정으로 고정.
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그림 6 : 이미지 수집에 사용되는 일반 매개 변수의 스크린 샷.
그림 7 :. 톡소 포자충 낭종이 먼 신경 프로세스 내에 상주 할 수 있습니다 (AB) 최대 투사 GFP의 이미지 + RFP + 낭종 (흰색 화살표)를 포함하는 신경. 스케일 바 = 20 μm의. (CE) B에 도시 낭종 뉴런 관계의 추가적인 시각화 및 분석을 제공한다. 전지 본체의 가장자리 낭종의 가장자리로부터의 거리의 (C) Imaris 생성 직통 측정 (149μm ). (D) D-3 회전 영화 . (E)가 생성 Imariswww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video 그림 7E.avi "대상 ="_ 빈 "에서 낭종에 셀 바디 측정을 보여주는> 3-D 영화 모두 중간에 중간 (163 μm의) 에지 - 투 - 에지 (149 μm의).
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Discussion
감염된 숙주 세포에서 세포 변화는 HIV, 광견병, 클라미디아 (18, 19)와 같은 다른 세포 생물과 감염 질환의 결과에 연결되어 있음을 감안할 때, 우리는 우리가 CNS 사이에 발생하는 친밀한 상호 작용을 연구 할 수 있도록 해주는 기술을 개발 세포 및 톡소 플라스마를 개최. 여기에 기재된 방법은 만성 감염 뉴런의 효율적인 이미징을 가능하게함으로써 이러한 목표를 달성한다. 이 방법의 개발에 앞서, 이러한 이미지는 시간 소모, 비용이 많이 드는, 또는 수 없었습니다.
우리는 지금과 같은 기생충의 대상이 특정 신경 세포의 영역이다과 톡소 -neuron 상호 작용에 관한 기본적인 질문에 대답하기 위해이 기술을 사용할 수 있습니까? 이 톡소 균주 사이에 차이가 있습니까? 낭종 (즉 감염된 않고 신경 세포로부터 감염되지 않은 동일한 돌기가 등뼈의 수가 동일한 셀의 다른 상이 존재하는 셀룰러 영역을 수행)? 감염된 신경 세포에 의해 공유 휴대 특징은 무엇인가? 이러한 질문에 대답 할 수있는 능력은 톡소 플라스마 감염은 행동의 수준을 포함, CNS를 변경하는 방법을 이해하는 데 필수적이다.
최상의 화상을 얻기 위해서는, 조직에도 섹션으로 절단되어 있는지 확인하는 것이 매우 중요하다. 섹션이 고르지 못한 경우, 커버 슬립 하위 최적의 영상을 초래 목적으로 고르지 접촉으로 이어지는 섹션에 제대로 앉아 있지 않습니다. 이 프로토콜의 최적화를하는 동안, 몇 가지 수정이 이루어졌다. 원래 소거 처리가 SeeDB 20으로 알려진 기술에 도시 된 결과를 재생하기위한 시도 과당 수행 하였다. 이 RFP (특히 mCherry)를 급냉이 방법은이 모델과 호환이었다. 또 다른 주요 단계의 모든 아마도 가장 중요한 조직 섹션의 최대 허용 클리어된다. 제대로 제거되지 않으면, 배경 광 회절 높을 것 및이미지가 시끄러운된다. 우리는 글리세롤에 트윈 (20) 또한 혼자 글리세롤보다 약간 선명한 이미지를 준 것으로 나타났다. 현재의 기술은 우리가 160μm 두께의 뇌 조직 절편을 통하여 Z 스택 이미지를 얻을 수 있지만, 향후에는 더욱 깊이 분석을 허용하기 위해 500 ㎛ 이상이 두께를 두껍게 찾고 있습니다.
그것은 단지 전체 셀 우리는 뇌가 전 세계적으로 톡소 플라스마에 의해 영향을받는 방법에 대한 기계적인 아이디어를 개발하기 시작할 수의 연결을보고있다. 이 새로운 프로토콜은 단일 세포 수준에서 톡소 -neuron 상호 작용을 연구하고 신속하고 경제적 인 방식으로이를 수행 할 수있는 기회를 제공한다. 우리는이 프로토콜에 대한 사용 가능성을 모두 탐험 아직 그것은 다른 시스템으로 변환 할 수있는 방법 그러나 우리는 여러 응용 프로그램을 것으로 예상.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 도움이 토론 전체 Koshy 실험실 감사합니다. 우리는 패티 Jansma과 조언을 애리조나 신경 과학학과의 대학 감사 및 이미징에 도움이됩니다. 우리는 또한 자신에 vibratome의 사용을 Porreca 실험실 감사합니다. 이 연구는 미국 국립 보건 연구소 (NIH NS065116, AAK)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-Cl | |
| 200 mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25 cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20 ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10 ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible - used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
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신경 생물학 문제 94 신경 과학 공 초점 현미경 마우스 뇌 지우기 형광 단백질,Erratum
Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015.
Citeable Link.
A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy
