3-D Imaging og analyse av nevroner Infected Published: December 9, 2014 doi: 10.3791/52237

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Carla M. Cabral¹, Anita A. Koshy^1,2,3

¹Bio5 Institute, University of Arizona, ²Department of Neurology, University of Arizona, ³Department of Immunobiology, University of Arizona

Summary

Ved hjelp av denne protokollen, var vi i stand til bilde 160 mikrometer tykk hjerne seksjoner fra mus infisert med parasitten Toxoplasma gondii, som gjør det mulig for visualisering og analyse av romlige forholdet mellom encysting parasitt og den infiserte nervecellen.

Abstract

Toxoplasma gondii er en obligat, intracellulær parasitt med et bredt vertsområde, inkludert mennesker og gnagere. I både mennesker og gnagere, etablerer Toxoplasma en livslang vedvarende infeksjon i hjernen. Mens denne hjerneinfeksjon er asymptomatisk i de fleste immunkompetente mennesker, i fosteret eller immunsupprimerte individer som ervervet immunsvikt syndrom (AIDS) pasienter, dette forkjærlighet for og utholdenhet i hjernen kan føre til ødeleggende nevrologisk sykdom. Således er det klart at hjerne Toxoplasma interaksjonen er kritisk for symptomatisk sykdom produsert av Toxoplasma, men vi har liten forståelse av cellulær eller molekylær interaksjon mellom cellene i sentralnervesystemet (CNS) og parasitten. I musemodell for CNS toksoplasmose det har vært kjent i over 30 år at nevroner er de cellene der parasitten vedvarer, men lite informasjon er tilgjengelig om hvilkedel av nervecellen er generelt infisert (soma, Dendritt, axon) og hvis dette cellulære forhold endrer mellom stammer. Delvis er denne mangelen sekundært til vanskelighetene med bildebehandling og visualisere hele infiserte nevroner fra et dyr. Slike bilder vil vanligvis krever serie seksjonering og søm av vev avbildes ved elektronmikroskopi eller konfokalmikroskopi etter farging. Ved å kombinere flere teknikker, fremgangsmåten som beskrives her muliggjør bruk av tykke seksjoner (160 um) for å identifisere og bilde hele celler som inneholder cyster, slik tredimensjonal visualisering og analyse av individuelle, kronisk infiserte neuroner uten behov for farging, elektronmikroskopi eller seriell seksjonering og søm. Ved hjelp av denne teknikken, kan vi begynne å forstå den cellulære forholdet mellom parasitt og den infiserte nervecellen.

Introduction

Det overordnede målet med denne metoden er å oppnå høy oppløsning, tredimensjonale bilder av individuelle nerveceller som er infisert av den obligat intracellulær parasitt Toxoplasma gondii.

Toxoplasma er ofte betraktet som en av de mest vellykkede parasitter på grunn av sin store mellomvert utvalg, som omfatter mennesker og gnagere. I både mennesker og gnagere, etter akutt infeksjon gjennom inntak av forurenset mat eller vann, er Toxoplasma stand til å forårsake en vedvarende infeksjon i CNS ved å konvertere fra sin raske reproduserende form (den tachyzoite) til sin langsomme reproduserende og encysting form (den bradyzoite ). I immunkompetente individer, er dette latent CNS infeksjon antas å være relativt asymptomatisk, men hos immunsupprimerte individer som AIDS-pasienter eller resipienter, kan recrudescence av parasitten føre til dødelig toxoplasmic encefalitt ^1,2. I tillegg nyere studier hahar vist at latent infeksjon med Toxoplasma kan føre til forandringer i oppførselen hos gnagere ^3,4, men mekanismen er ikke kjent.

Overraskende, til tross for disse data fremhever viktigheten av CNS Toxoplasma samhandling, relativt lite er kjent om dette forholdet, spesielt på cellulært og molekylært nivå. Evnen til å studere selv enkle aspekter av hjerne-parasitt interaksjon har vært hemmet delvis av techno begrensninger. For eksempel, det meste av arbeidet som viser at nerveceller er celler som cyster vedvarer har blitt gjort med elektronmikroskopi (EM) ^5,6. Selv om EM gir høy oppløsning, er det tidkrevende, arbeidskrevende og dyrt. Immunfluorescens (If) assays har nylig blitt anvendt i forbindelse med konfokal mikroskopi for å bekrefte arbeid utført av EM ^7. Hvis analyser er teknisk enkel å utføre og relativt billig, men ved anvendelse av disse teknikker for å understand det romlige forhold mellom cyste og infisert neuron krever serie rekonstruksjon, noe som er tidkrevende, teknisk vanskelig, og kan føre til tap av verdifull informasjon. Derfor har vi utviklet en metode som kan brukes med musemodell for CNS toksoplasmose og lar oss bilde helheten av infiserte nevroner uten EM eller immunhistokjemi (IHC). Ved utvikling av en slik teknikk, kan vi begynne å utforske den cellulære forholdet mellom den infiserte celle og cyste i en forholdsvis rask og rimelig måte.

Metoden utviklet vi kombinerer nyere teknikker for optisk avregning og avbildnings tykke hjerneseksjoner ved konfokal mikroskopi ⁸ med et system som markerer in vivo-celler som har blitt injisert med parasittproteiner ^9,10. I dette systemet, vi infisere Cre-rapportør mus som uttrykker et grønt fluorescerende protein (GFP) først etter at Cre-formidlet rekombinasjon ¹¹ med Toxoplasma 9. Denne kombinasjonen gjør at vi kan høste den infiserte mus hjernen etter CNS infeksjon er etablert, kutte tykke hjerne seksjoner, og raskt identifisere relevante områder til bilde ved å finne den RFP ⁺ cyster. Det er viktig å merke seg at som vertscelle ekspresjon av GFP avhenger utelukkende på injeksjon av Cre av parasitter, og ikke på infeksjon, en rekke av de GFP ⁺ celler inneholder ikke parasitter ^10. Som mål for denne protokollen er å være i stand til bilde hele infiserte nevroner, er fokuset kun på GFP ⁺ nevroner som også inneholder en RFP ⁺ cyste, men protokollen kan også brukes til å avbilde GFP ⁺ / RFP ^- nevroner.

Når den infiserte hjernen blir høstet og seksjonert, blir seksjonene gjøres gjennomsiktig ved glycerol clearing. Passende regioner av seksjoner blir deretter avbildes med konfokalmikroskopi, algende enestående visualisering av infiserte vertsceller og de innkapslede parasitter i sin helhet. Her tilbyr vi en komplett protokoll for å identifisere, optisk clearing, og bildebehandling smittet nevroner.

Protocol

MERK: Mus ble avlet og vedlikeholdes på en temperatur og luftfuktighet kontrollert rom med 12 timers reversert lys / mørke sykluser med mat og vann tilgjengelig ad libitum ved University of Arizona. Forsøkene ble utført under retningslinjer og godkjenning av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Arizona. Alle forsøk ble gjort for å minimere lidelse. De Cre-rapportør musene er på en C57BL / 6 bakgrunn ¹¹ og er kommersielt tilgjengelige.

1. Mouse Infeksjon

MERK: Fremgangsmåte for museinfeksjon med Toxoplasma gondii rives nedenfor er blitt brukt i tidligere publiserte studier ^{10 - 12.}

1. Vokser Toxoplasma-stammer i human forhud fibroblaster (HFFS) dyrkes i Dulbeccos høy glukose modifisert Eagles Medium (DMEM) supplert med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin (cDMEM) i en T-25-kolbe i en 5% _CO2 inkubator før parasitter har dannet store parasitophorous vakuoler.
2. Sprøyte frigivelse parasitter ved å skrape cellene fra bunnen av kolben og føring av den resulterende oppløsning gjennom en 25 gauge nål koblet til en 3 ml sprøyte to ganger inne i kolben og deretter overføre hele løsningen på en 5 ml sprøyte tilfelle forbundet med en 27 gauge nål som er plassert opp-ned inne i et 15 ml konisk rør. Kobler stemplet til sprøyten og passerer parasitten løsning i det koniske rør.
3. Sentrifuger røret i 10 minutter ved 300 x g. Aspirer supernatanten deretter resuspender pelleten i 4-6 ml sterilt USP klasse 1x Phosphate saltvann (PBS) pH 7,4 (Stock Solution).
4. Legg i en hemocytometer med 10 mL av stamløsning, vente 5-10 min for parasitter å bosette deretter telle antall parasitter i de fire hjørne og senter torg i midten store plassen.
5. Fortynne paraområder til passende inokulum størrelse på 100K / 200 pl 1 x PBS og deretter injisere mus intraperitonealt (ip) med et totalt volum på 200 ul.
   MERK: For denne prosedyren, ble mus inokulert med 100K Type III (CEP) ¹³ tachyzoites i 200 mL 1x PBS. Ved å infisere mus med andre stammer av Toxoplasma, kan konsentrasjonen av inokulum må justeres for å ta hensyn til nivået av virulens.

2. Perfusjons og Brain Høsting

NB: Denne protokollen ble utført ved 21 dager etter infeksjon (ppt), da dette representerer tidspunktet ved hvilket topp antall cyster som finnes i musehjerne, men på andre tidspunkter kan anvendes. Størrelse, antall, plassering og tilstedeværelse eller fravær av cyster avhenger av mange faktorer, inkludert mus belastning, parasitt belastning typen samt pode størrelse ^{7,14 - 17.} Etterforskerne må individuelt bestemme passende inoculum for musen og Toxoplasma belastningen han / hun bruker.

1. Oppsett alle kirurgiske høsting verktøy (figur 1).
2. For hver mus, forberede og holde på is: 20ml sprøyte fylt med 0,9% natriumklorid (NaCl) + 10 U / ml Heparin i 1x sterile USP klasse PBS (Heparin / Saline); 20 ml sprøyte fylt med 4% Paraformaldehyde (PFA); Scintillasjonsglass med 15 ml 4% PFA. For flere mus, forberede et beger fylt med hele beløpet av hver løsning er nødvendig for alle mus deretter utarbeide en ny sprøyte full av løsning for hver perfusjon.
3. Bedøve mus ip med 200 mL / 25 g kroppsvekt av ketamin / xylazin cocktail (24 mg / ml og 4,8 mg / ml) på dag er av interesse. Overvåke musen for nivået av anestesi ved å sjekke tå klype refleks. Fortsett med protokollen bare én gang musen viser ingen reaksjon på en fast tå klype.
   MERK: Andre metoder for anestesi kan benyttes så lenge den riktige grad av anestesi blir nådd førfortsetter med protokollen.
4. Plasser musen i liggende stilling på dekket skum plattform. Pin alle fire lemmer ut ved føttene så spray brystet og magen med 70% etanol (EtOH) (Figur 2A). Tilsetning av flere sterile papirhåndklær under mus kan brukes for å bidra til å absorbere overløp av perfusjon fluider.
5. Løft huden rett under brystbenet med pinsett deretter bruke saks for å lage et snitt. Trekk huden tilbake utsette brystet (figur 2B).
6. Løft xifoid prosessen og foreta en abdominal innsnitt rett under membranen, eksponere leveren som er rett ut dissekert vekk fra membranen. Lage to snitt, en på venstre og en på høyre gjennom membranen og bunnen av ribbeina. Utvide venstre og høyre snitt ca 1 / 2-2 / 3 vei opp brystkasse, som deretter reflekteres tilbake for å åpne brysthulen (figur 2C).
   MERK: Pass på å ikke kutte noen organer eller store blodkar DUring denne prosedyren som gjør dette vil gå ut over kvaliteten på perfusjon.
7. Perfuse transcardially med 10-20 ml Heparin / Saline fulgt av 10-20 ml 4% PFA.
   MERK: Hvis perfusjon er gjort riktig, vil leveren slå fra rød til tan (figur 2D). Hvis det ikke gjøres riktig, vil blodårene være synlig (figur 2E).
8. Snu musen over på magen, re-pinners føtter så spray hode og nakke med 70% EtOH. Løft huden fra bunnen av nakken og gjøre et snitt. Fjerne hud for å avsløre skallen (figur 2F). Decapitate hodet på nivået av skuldrene. Fjern skallen, forsiktig fjerne hjernen, og legg den i en scintillasjonsflaske fylt med 4% PFA (figur 2G-H).
   MERK: Hvis vel perfusert, vil hjernen vises hvitt uten synlige blodårer (Figur 2i). Hvis hjernen ikke er godt perfusert, vil blodårene være synlig (Figur 2J).
9. Plasser scintillasjon ampulle med hjerne i 4% PFA ved 4 ° C over natt, dekket mot lys. Skyll hjernen i ikke-USP grade 1 x PBS og overfør til et nytt scintillasjonsglass fylt med avkjølt 1 x PBS. Oppbevar hjernen i 1 x PBS ved 4 ° C, dekket mot lys.
   MERK: Vellykket rydding og bildebehandling er gjort med deler som er lagret i 1x PBS i opptil en måned, men det er best å seksjonen hjernen i løpet av få dager som langvarig lagring i PBS vil reversere PFA fiksering og kan føre til mindre enn optimale bilder . Autofluorescence og økt uklarhet har vært registrert i noen deler fotografert etter lagring i 1x PBS for en måned eller lenger.

3. Brain Seksjonering

1. Fjerne hjernen fra 1x PBS og plassere den i en hjerne matrise (figur 3A) for å tillate mer nøyaktig og jevn skjærer gjennom hjernen. Klippe av lillehjernen og olfactory pærer, hvis de finnes, og deretter kutte hjernen coronally inn i 2 eller 3 seksjoner.
   
2. Fest hver hjernedelen på en prøvemontering blokk med cyanoakrylat. Fest en liten blokk med 5% agarosegel bak hjernen seksjon for støtte (Figur 3B).
   NB: Se støtte mekanismer kan benyttes, men uten støtte, kan den Vibratome presse på hjernen forårsaker ujevn snitting.
3. Skjær vevet inn 160 mikrometer (arbeidsavstand til målet som brukes for imaging) tykke seksjoner med Vibratome satt til en hastighet på 4 og amplitude av 9.
   MERK: Innstillingene for fart og amplitude kan justeres avhengig av den aktuelle maskinen er blitt brukt for å få enda, glatte seksjoner. Hvis innstillingene erikke er riktig, kan resultatet bli ujevnt seksjoner, rive av vev eller skurestriper.
4. Samle vevssnitt i en scintillasjonsflaske fylt med fersk, kjølt 1x PBS hvis de kommer til å bli slettet i løpet av én uke. Dersom deler ikke kommer til å bli slettet i løpet av én uke, sted seksjoner i 1,5 ml mikrosentrifugerør fylt med cryopreserveringsmiddel løsning og oppbevares ved -20 ° C.

4. Optisk Clearing av hjernevev Seksjoner

MERK: Denne protokollen har blitt forandret fra en tidligere publisert metode ^8.

1. Forbered 25%, 50%, 75% og 90% volum / volum glycerol i 1 x PBS + 2% Tween-20 (Gl / PBST).
2. Fjerne deler fra 1x PBS eller, hvis i cryopreserveringsmiddel, skyll i 1x PBS og overføre til en scintillasjonsflaske inneholder 10 ml 25% Gl / PBST. Plasser flasken på et risteapparat ved 4 ° C, dekket mot eksponering for lys, i 12 timer.
3. Bekrefter at alle deler har sunket til bottom av hetteglasset. Aspirer 25% Gl / PBST, slik at bare nok til å dekke delene deretter fylle flasken med 10 ml 50% Gl / PBST og plassere på et risteapparat ved 4 ° C, dekket mot eksponering for lys, i 12 timer. Gjenta denne prosessen for 75% Gl / PBST deretter 90% Gl / PBST. La seksjoner i 90% Gl / PBST for 24 timer for å oppnå maksimal clearing. I løpet av ryddeprosessen, observere gradvis optisk clearing (figur 4).
   MERK: Denne prosessen kan bli fremskyndet hvis løsninger endres umiddelbart etter seksjoner har sunket til bunnen av flasken. I 75% og 90% løsninger vil seksjonene ikke synke helt ned til bunnen av flasken, men vil flyte i midten.

5. Montering hjernevev Seksjoner

1. Skjær en nr 1,5 dekk inn fem stykker for å lage en spacer. Bruk en linjal og diamant-tipped blyant å score og bryte dekk langs de stiplede linjene som vist i figur 5A. Forkast than sentrere stykke, ordne de 4 ytre stykker på en vanlig glass lysbilde for å opprette et vindu, og deretter børste klar neglelakk på sømmene for å overholde bitene av spacer til raset i riktig konfigurasjon (Figur 5B).
   MERK: spacer vil bli brukt til å skape den nødvendige avstanden mellom raset og dekkglass for montering av ryddet seksjoner. Dekkglass kan bli kuttet i ulike måter å lage alle størrelser vindu nødvendig. Pre-cut skum avstandsstykker er også kommersielt tilgjengelige. Å tillate neglelakk tørke helt, er det best å lage lysbilder med avstandsstykker minst en dag før monterings seksjoner.
2. Overføre deler til et lysbilde som bruker en plast overføring pipette med spissen avskåret. Sørg for å fylle i nærområdet med 90% Gl / PBST. Senk en dekkglass over seksjonene gjør at ikke å innføre noen bobler. Overflødig Gl / PBST kan det kjempe bort med en lofri tørk.
3. Bilde GFP ⁺ nevroner som inneholder RFP ⁺ (Figur 7A-B) og deretter lagre lysbilder flat og dekket fra lys ved 4 ° C.
   MERK: Alternativt segl glir helt rundt alle kanter for å lagre og fotografert på et senere tidspunkt. Bruk av klar neglelakk for å forsegle lysbilde er valgfritt, og kan gjøre det vanskeligere å fjerne dekk hvis man skulle fjerne seksjoner fra raset på et senere tidspunkt for videre behandling.

6. Imaging

MERK: Enhver mikroskop kan brukes som har evnen til å oppnå høy oppløsning z-stabler.

1. Etter først å finne fokusplanet på 10X, endre til en 20X objektiv og skanne gjennom kapittelet for å finne en cyste som ligger inne i en GFP ⁺ celle. Sentrere regionen av interesse (ROI) i synsfeltet.
2. Bytt til en 40X objektiv. Fokus opp og ned gjennom hele ROI for å sørge for at hele cellen og cyst er synlige.
   MERK: Bilder ble innhentet ved hjelp av et konfokal mikroskop med en 40X / 1.30 Oil DIC M27 objektiv.
3. Ved hjelp av den installerte bildebehandlingsprogrammer, få en z-stack som inkluderer hele cellen med cyste. Gjennomsnittlig innstillinger som brukes for å oppnå bilder er vist i figur 6.
   MERK: Innstillinger kanskje må justeres avhengig av hver etterforskere vevssnitt og mikroskop evner.
4. Skaff en maksimal projeksjon bilde av z-stack ved å sette antall anslag til 1. Få en full rotasjons visning ved å sette antall anslag til 64.
   MERK: Andre programvarepakker er tilgjengelige og kan brukes for å oppnå maksimal projeksjon, rotasjons samt andre visninger av z-stack bilder.
5. Analyser bilde med bildeanalyse programvare.

Representative Results

Figur 7 inneholder representative bilder av to cyste-inneholdende GFP ⁺ neuroner fra to forskjellige 160 um tykke seksjoner samt en representativ måling av avstanden fra cyste-til-celle-legemet for figur 7B. Figurer 7 A og B viser at denne nye Protokollen muliggjør visualisering av den infiserte neuron i sin helhet. Figur 7C viser at med denne avbildningsteknikk, er det nå mulig å kvantifisere avstanden mellom cyste og cellelegemet (Imaris 7.7). Figur 7D er en full rotasjonsriss av figur 7B. Visualisering av z-stakken på denne måte gjør det mulig for verifisering av den komplette fangst av cellen og cyste. Figur 7E er en 3D rotasjons film som viser hvordan bildet fra 7D kan analyseres ved Imaris 7.7 programvare for å måle avstanden fra cyste til cellen kroppen enten fra midten til midten or kant til kant. Selv om den viste målingen ble gjort ved hjelp av en rett linje mellom cyste og cellelegemet, en måling etter selve GFP ⁺ fremgangsmåte til cellelegemet kan også bli generert (data ikke vist).

Figur 1: kirurgisk utstyr for fjerning av musehjerne. (A) Absorberende pad. (B) Skum blokk. (C) Nåler til å peke ut føtter. (D) 25 G Blood samling sett. (E) 3-veis stoppekran. (F) 20 ml sprøyte for Heparin / Saline. ( G) 20 ml sprøyte for 4% PFA. (H) Thumb tang. (I) Fin saks, vinklet til side, skarp-skarp. (J) Sharp-skarp saks. (K) Kelly hemostats. (L) Mayo saks. (M) (N) scintillasjonsampulle for 4% PFA. Skala bar = 8 cm.

Figur 2: Høsting mus hjernen. (A) Mouse låste ned og brystet sprayet med 70% EtOH. (B) Exposed brystet. (C) Bryst hulrom åpen. (D) Liver etter skikkelig perfusjon. (E) Liver etter feilaktig perfusjon. (F) Exposed skallen. ( G) Brain med halve skallen fjernet. (H) Slaktet hjernen i hetteglass fylt med 4% PFA. (I) Brain etter skikkelig perfusjon. (J) Brain etter feilaktig perfusjon.

Figur 3: Snitte mus hjernen. (A) Mouse hjernen Matri x. (B) Mouse hjerne og agarosegel festet til montering blokk med cyanoacrylate inne Vibratome kammer fylt med kjølt 1x PBS.

Figur 4: Fjerne prosess Representative bilder av en musehjerne seksjon under hvert trinn av clearing prosessen..

Figur 5: Skjære og fikse spacer å gli. A. No. 1.5 dekkglass med representative karakterer for å kutte dekk inn 5 stk. B. Vanlig glass lysbilde med hvert stykke kutt dekk tacked på plass med klar neglelakk for å skape et vindu.

2237 / 52237fig6highres.jpg "/>
Figur 6: Skjermbilde av generelle parametere som brukes for bildeopptak.

Figur 7:. Toxoplasma gondii cyster kan ligge innenfor fjerne nevrale prosesser (AB) Maks projeksjon bilder av GFP ⁺ nevroner som inneholder RFP ⁺ cyster (hvite piler). Skala bar = 20 mikrometer. (CE) gi ytterligere visualisering og analyse av cyste-nevron forholdet vist i B. (C) Imaris generert direkte linje måling av avstanden fra kanten av cyste til kanten av cellen kroppen (149μm ). (D) 3-D rotasjons film . (E) Imaris generertwww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Figur 7E.avi "target =" _ blank "> 3-D film som viser cyste-til-celle-body måling fra både midtre til midten (163 mikrometer) og kant-til-kant (149 mikrometer).

Discussion

Gitt at celleforandringer i infiserte vertsceller har vært knyttet til sykdoms utfall i infeksjoner med andre intracellulære organismer som HIV, Rabies, og Chlamydia ^18,19, har vi utviklet en teknikk som ville tillate oss å studere de intime samspillet som oppstår mellom CNS vert celle og Toxoplasma. Metoden som beskrives her oppnår dette målet ved at effektiv avbildning av kronisk infiserte neuroner. Forut for utviklingen av denne fremgangsmåte, slik avbilding var tidkrevende, kostbare, eller ikke mulig.

Vi kan nå bruke denne teknikken for å svare på grunnleggende spørsmål vedrørende Toxoplasma -neuron samhandling, som er spesifikke nevronale områder målrettet av parasitten? Betyr dette varierer mellom Toxoplasma stammer? Har de cellulære områder hvor cyste befinner forskjellig fra resten av cellen (dvs. ikke infiserte og ikke-infiserte dendritter fra samme neuron har samme antall pigger)? Hva er de cellulære egenskaper deles av infiserte nevroner? Evnen til å svare på slike spørsmål er viktig å forstå hvordan Toxoplasma infeksjon endrer CNS, blant annet på nivået av virkemåten.

For å få de beste bildene mulig, er det svært viktig å sørge for at vevet er skåret i like deler. Hvis delene er ujevn, ikke dekk ikke sitte ordentlig på den delen som fører til ujevn kontakt med objektiv som resulterer i sub-optimal bildebehandling. Under optimalisering av denne protokollen, ble gjort flere modifikasjoner. Den opprinnelige avregningsprosess utført med fruktose i et forsøk på å reprodusere resultatene vist i en teknikk kjent som SeeDB ^20. Denne metoden var uforenlig med denne modellen som det slukket RFP (spesielt mCherry). Et annet viktig skritt, og sannsynligvis det viktigste av alt er slik at for maksimal clearing av vevssnitt. Hvis ikke ryddet skikkelig, vil bakgrunnslys diffraksjon være høyere ogbildene blir støyende. Vi har funnet at tilsetning av Tween-20 til glyserol ga en noe klarere bilde enn glycerol alene. Dagens teknologi gjør det mulig for oss å få tak z-stack bilder gjennom 160μm tykke hjernen vevssnitt men i fremtiden, er vi ute etter å øke denne tykkelsen til 500 mikrometer eller mer for å tillate enda mer dyptgående analyse.

Det er bare ved å se på hele cellen og dens forbindelser som vi kan begynne å utvikle en mekanistisk idé om hvordan hjernen er globalt påvirket av Toxoplasma. Denne nye protokollen gir en mulighet til å studere Toxoplasma -neuron samhandling på celle-nivå og gjøre det på en rask, økonomisk måte. Vi har ennå til å utforske alle de potensielle bruksområder for denne protokollen og hvordan det kan oversette til andre systemer, men vi regner med det vil ha flere programmer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System	Technical Products International, Inc.		Other vibratomes are compatible
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Premium Slides	Fisher Scientific	12-544-2
#1.5 Coverslips	VWR	48393 251
Diamond Scriber	VWR	52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope	Zeiss	LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml	Western Medical Supply, Inc.	4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml	Lloyd Inc.
ZsGreen Mice	Jackson Laboratories	7906	B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment			Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells			These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)	HyClone	SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine	Corning	25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask	Fisher Scientific	1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium	VWR	45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade	amresco	K813-500ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-aldrich	Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-aldrich	H3393-100KU
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials	Fisher Scientific	FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof	In-house	17212945	This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software	Bitplane
Clear nail polish			Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok	VWR	BD309604	Other syringes are compatible
Three-way Stopcock			Any brand is compatible
Hypodermic needle			Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper			Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter	Greiner Bio-One	450099	Other brands are compatible