Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte doi: 10.3791/52237 Published: December 9, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu protokolü kullanarak, biz görselleştirme ve encysting parazitin enfekte nöron arasındaki mekansal ilişkinin analizini sağlayan parazit Toxoplasma gondii ile enfekte farelerde görüntü 160 mikron kalınlığında beyin bölümlerine başardık.

Abstract

Toxoplasma gondii, insanlarda ve kemirgenler dahil olmak üzere, geniş bir konak yelpazesi ile bir obligat hücre içi parazit. Hem insanlarda hem de kemirgenler ise, Toxoplasma beyinde bir ömür boyu kalıcı enfeksiyon oluşturur. Bu beyin enfeksiyonu gelişmekte olan fetus ya da beyinde kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AİDS) hasta için bu tercihte ve sebat gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde, çoğu immün sistemi kişilerde asemptomatik iken yıkıcı nörolojik hastalığa yol açabilir. Böylece,-beyin-Toxoplasma etkileşim Toksoplazma tarafından üretilen semptomatik hastalığı kritik, henüz biz merkezi sinir sistemi (MSS) ve parazit hücreleri arasındaki hücresel veya moleküler etkileşim az bir anlayışa sahip olduğu açıktır. CNS fare modelinde bu nöronlar parazit devam ettiği hücreler 30 yıldır bilinmektedir toksoplazmozis, ama çok az bilgi hangi kullanılabilirnöronun parçası genellikle (soma, dendrit, akson) bulaşmış ve bu hücresel ilişki suşları arasında değişir eğer. Bölümünde, bu eksikliği görüntüleme zorluk sekonder ve bir hayvandan bütün enfekte nöronlar görselleştirme olduğunu. Bu tür görüntüler tipik seri kesitlerinin ve elektron mikroskobu veya immün sonra konfokal mikroskobu ile görüntülü doku dikiş gerektirir. Çeşitli teknikler birleştirerek, burada açıklanan yöntem immün gerek kalmadan üç boyutlu görselleştirme ve bireysel, kronik olarak enfekte nöronların analizini sağlayan, tespit ve kistler içeren görüntü tüm hücreleri kalın bölümlerin kullanımını (160 mikron) sağlayan, elektron mikroskobu veya seri kesit ve dikiş. Bu tekniği kullanarak, parazit ve enfekte nöron arasındaki hücresel ilişkiyi anlamak başlayabilirsiniz.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yöntemin genel amacı yüksek çözünürlük, zorunlu hücre içi parazit Toxoplasma gondii ile enfekte olan bireysel nöronlar üç boyutlu görüntüler elde etmektir.

Toksoplazma sık sık insanları ve kemirgenler içeren geniş ara konak aralığı, en başarılı parazitlerin biri olarak kabul edilir. Insanlarda ve kemirgenler hem de, kontamine yiyecek veya su tüketilmesi yoluyla akut enfeksiyondan sonra, Toxoplasma formunu yavaş-kopyalayan onun hızlı kopyalayan formu (tachyzoite) dönüştürme ve encysting ile MSS kalıcı enfeksiyona neden yapabiliyor (bradyzoite ). Bağışıklığa sahip bireylerde bu gizli merkezi sinir sistemi enfeksiyonu nispeten asemptomatik olduğu düşünülmektedir, ancak, AİDS hastalarında ya da transplant alıcıları gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde, parazitin açılma ölümcül Toksoplazma ensefalit 1,2 yol açabilir. Buna ek olarak, son çalışmalar hamekanizma bilinmemektedir olsa Toksoplazma latent infeksiyon, kemirgenler 3,4 davranışsal değişikliklere yol açabilir göstermiştir ettik.

Şaşırtıcı, CNS- Toxoplasma etkileşimin önemini vurgulayarak, bu verilere rağmen, nispeten daha az, özellikle hücresel ve moleküler düzeyde, bu ilişki hakkında bilinmektedir. Beyin-parazit etkileşimi bile basit yönlerini incelemek için yeteneği teknolojik sınırlamalar kısmen engel olmuştur. Örneğin, işin çoğunluğu nöronlar kistler elektron mikroskobu (EM) 5,6 ile yapılmıştır devam ettiği hücrelerin olduğunu gösteren. EM yüksek çözünürlük verir rağmen, zaman alıcı, emek yoğun ve pahalı. İmmünofloresan (IF) tahlilleri son zamanlarda EM 7 tarafından yapılan işi onaylamak için konfokal mikroskobu ile birlikte kullanılmıştır. Deneyleri gerçekleştirmek için teknik olarak kolay ve nispeten ucuz, ama under bu teknikleri kullanarak IFtand kist ve enfekte nöron arasındaki mekansal ilişki süresi, teknik olarak zor alıcı ve değerli bilgiler kaybına yol açabilir seri rekonstrüksiyon gerektirir. Böylece, biz MSS toksoplazma fare modeli ile kullanılan ve EM veya immünohistokimyasal (İHK) olmadan görüntü enfekte nöronların tamamını bize izin verir edilebilir bir yöntem geliştirdik. Böyle bir teknik geliştirerek, biz nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde enfekte hücre ve kist arasındaki ilişkiyi keşfetmeye hücresel başlayabilirsiniz.

Geliştirdiğimiz yöntem parazit proteinleri 9,10 ile enjekte edilmiş in vivo hücrelerinde işaretleri bir sistem ile konfokal mikroskopi 8 ile optik takas ve görüntüleme kalın beyin bölümleri için yeni teknikler birleştirir. Bu sistemde, Toksoplazma rekombinasyonu 11 Kre-aracılı sonra yeşil floresan protein (GFP) ifade Cre raportör fareleri enfekte 9 içine Cre recombinase enjekte suşları. Bu kombinasyon MSS enfeksiyonu kurulduktan sonra, enfekte fare beyin hasat kalın beyin bölümleri kesip, hızla RFP + kistleri bularak görüntüye uygun alanları belirlemek için bize izin verir. Bu GFP konakçı hücre GFP + hücrelerinin sayısı parazitleri 10 içermez, enfeksiyon parazitlerin Cre enjeksiyon yalnızca bağlıdır olup olarak dikkat etmek önemlidir. Bu protokolün amacı görüntü tüm enfekte nöronlar edebilmek için olduğu gibi, odak sadece GFP + ayrıca bir RFP + kist ihtiva nöronlar üzerinde, ancak protokol de görüntü GFP + / RFP kullanılabilir - nöronlar.

Enfekte beyin hasat ve bölümlere sonra, bölümler gliserol takas yoluyla şeffaf hale getirilir. Bölümlerin uygun bölgeler daha sonra konfokal mikroskopi, arkadaşları ile görüntülüenfekte olmuş bir ev sahibi hücreleri ve bunların bir bütün olarak, keseli parazitlerin belirtilenlerin benzeri görüntüleme. Burada bir tanımlama için tam protokol, optik takas ve görüntüleme enfekte nöronlar sağlamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Not: Fareler, Arizona Üniversitesi, yiyecek ve su ad libitum ile ışık / karanlık döngüsü ters yetiştirilen 12 saat olan bir sıcaklık ve nem kontrollü bir odada muhafaza edildi. Deneyler kurallar ve Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında gerçekleştirilmiştir. Tüm çabalar acı en aza indirmek için yapılmıştır. Kre-raportör fareler, C57BL / 6 arka 11 ve ticari olarak temin edilebilir.

1. Fare Enfeksiyon

Not: - 12, aşağıda tarif edilen Toxoplasma gondii fare enfeksiyon gibi bir yöntem, daha önce 10 yayınlanan çalışmalarda kullanılmıştır.

  1. Fibroblastlar (dikey paketleme) insan alın derisi Toxoplasma suşları büyümek Dulbecco Yüksek Glikoz kültürlenmiş Kartal Ortamı (DMEM),% 10 FBS ile takviye edilmiş, 100 U / ml penisilin, 100 mg / ml strept% 5 CO2 inkübatör içinde, bir T-25 balonuna omycin, ve 2 mM L-glutamin (cDMEM) parazitler, büyük parasitophorus vacuoles gelişimine dek.
  2. Daha sonra, bir 27 gog iğne bağlanan bir 5 mi şırınga halinde bütün olarak solüsyon bir şişe içinde 2 kez şişenin tabanından hücreler kazıma ve 3 mi bir şırıngaya bağlanmış bir 25 gauge iğne yoluyla elde edilen solüsyon geçirilerek şırınga tahliye parazitler bu ters 15 ml konik bir tüp içinde yerleştirilmiştir. Şırıngaya pistonu bağlayın ve konik tüp içine parazit çözümü geçmektedir.
  3. Santrifüj 300 x g, 10 dakika boyunca tüpü. Yüzer madde daha sonra 4-6 ml steril USP 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS), pH 7.4 (stok çözelti) pelet tekrar süspansiyon aspire.
  4. Parazitler orta büyük karenin dört köşe ve orta kareler parazitlerin sayısını daha sonra yerleşmek saymak için stok solüsyonu 10 ul Hemasitometre yükleyin, 5-10 dakika bekleyin.
  5. Paragraf seyreltin100K / 200 ul, uygun inokulum boyutuna the PBS daha sonra 200 ul toplam hacim periton içine (ip) enjekte fareler 1x.
    NOT: Bu prosedür için, fareler 100 K Tip III (CEP) PBS 1x 200 ul 13 takizoit aşılanmıştır. Toksoplazma diğer suşları ile fareler enfekte olduğunda, inokulum konsantrasyonunun hastalık oluşturma etkisi hesaba ayarlanması gerekebilir.

2. Perfüzyon ve Beyin Hasat

Not: Bu kistlerin tepe numaraları fare beyninde bulunan olduğu zaman noktasını temsil eder Bu protokol, 21 gün sonra enfeksiyonu (dpi) yapıldı, ancak diğer zaman noktaları kullanılabilir. 17 - kist boyutu, sayısı, yeri ve varlığı ya da yokluğu fare zorlanma, parazit gerilme türü yanı sıra aşı miktarı 7,14 dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Müfettişler tek tek fare ve Toxoplas için uygun inokülumu belirlemek gerekirma suşu o / o kullanır.

  1. Kur tüm cerrahi hasat aletleri (Şekil 1).
  2. Her bir fare için, hazırlama ve buz üzerinde tutulur:% 0.9 sodyum klorid (NaCl) ile doldurulmuş 20 ml şırınga + 10 U / ml Heparin 1x steril USP PBS (Heparin / tuzlu su) içinde; 20 ml'lik bir enjektör% 4 paraformaldehit (PFA) ile doldurulmuştur; 15 mi% 4 PFA ile sintilasyon şişesi. Birden fareleri için, daha sonra her bir perfüzyon için solüsyonu ile dolu yeni bir şırınga hazırlamak her fare için gerekli olan her bir çözeltinin toplam miktarı ile dolu bir beher hazırlar.
  3. 200 ul / Ketamin / Ksilazin kokteyli vücut ağırlığı 25 g (24 mg / ml ve 4.8 mg / ml) ilgi günde fare ip anestezisi. Ayak tutam refleksi kontrol ederek anestezi düzeyi için fare izleyin. Fare bir firma ayak tutam hiçbir yanıt gösterir sadece bir kez protokol ile devam edin.
    Not: anestezi uygun seviyede ulaşılırsa Anestezi başka yöntemler sürece kullanılabilecektirprotokol ile devam.
  4. Kapalı köpük platformda yatar pozisyonda fare yerleştirin. Sonra% 70 Etanol (EtOH) (Şekil 2A) ile göğüs ve karın sprey ayaklarına dört uzuvları dışarı Pin. Fare altında birkaç steril kağıt havlu eklenmesi perfüzyon sıvı taşma edilmesine yardımcı olmak için kullanılabilir.
  5. Sadece forseps ile sternum altında kaldırın ardından cilde bir kesi yapmak için makas kullanın. Göğüs (Şekil 2B) ortaya çıkarmak için geri cilt çekin.
  6. Süreci kılıç şeklinde kaldırın ve açık açık uzakta diyaframdan disseke edilir karaciğer açığa hemen diyaframın altında bir karın kesi yapmak. İki insizyon, solda diğeri diyafram aracılığıyla sağ ve kaburga altındaki birini yapın. Yaklaşık 1 / 2-2 / 3 yollu kadar sonra göğüs boşluğuna (Şekil 2C) açmak için geri yansır göğüs kafesi, sol ve sağ kesiler uzatın.
    NOT: Take bakım herhangi bir organ kesmek için değil ya da büyük kan damarları duperfüzyon kalitesini tehlikeye sokacaktır Bunu yaparken bu işlemi halka.
  7. 10-20 ml% 4 PFA ve ardından 10-20 ml Heparin / tuzlu su ile transkardiyal serpmek.
    NOT: perfüzyon düzgün yapılırsa, karaciğer (Şekil 2D) tan kırmızı dönüşecektir. Eğer düzgün yapılmazsa, kan damarları görünür (Şekil 2E) olacaktır.
  8. Onun karın üzerine fareyi çevirin, yeniden-pin ayakları daha sonra% 70 EtOH ile baş ve boyun sprey. Boyun tabanından cilt kaldırın ve bir kesi yapmak. Kafatası (Şekil 2F) açığa cilt çıkarın. Omuz seviyesinde baş başını kesmek. Yavaşça beyin kaldırmak, kafatası çıkarın ve% 4 PFA (Şekil 2G-lH) ile dolu bir sintilasyon şişesine içine yerleştirin.
    NOT: iyi perfüze Eğer, beyin görünür kan damarları (Şekil 2I) beyaz görünecektir. Beyin iyi perfüze değilse, kan damarları görünür (Şekil 2J) olacaktır.
  9. Kıvılcımını yerleştirin4 ° C 'de% 4 PFA beyin yon şişe gece boyunca ışıktan sahiptir. Soğutulmuş 1X PBS ile donatılmış bir sintilasyon şişesine olmayan USP 1 x PBS'de beyin ve transfer yıkayın. Işıktan kapalı 4 ° C 'de 1 x PBS'de beyin, saklayın.
    NOT: Başarılı takas ve görüntüleme kadar bir ay süreyle 1x PBS içinde saklanan bölümler ile gerçekleştirilebilir, ancak PFA fiksasyon ters olacak ve PBS uzun süreli depolama gibi birkaç gün içinde beyin optimal görüntülerin daha az yol açabilecek bu bölümünde en iyi olduğunu olmuştur . Otofloresans ve artan bulanıklık bir ay veya daha uzun süre 1x PBS depolamadan sonra görüntülenmiş bazı bölümlerde not edilmiştir.

3. Beyin Kesit

  1. 1x PBS beyni çıkarın ve daha hassas sağlamak için bir beyin matrisi (Şekil 3A) içine yerleştirin ve hatta beynin içinden keser. Varsa, beyincik ve koku ampuller keserek, ve daha sonra 2 veya 3 bölüme koronal beyin kesti.
  2. Siyanoakrilat ile bir örnek montaj blok üzerine her beyin bölümü yapıştırın. Destek için beyin bölümünde (Şekil 3B) arkasında% 5 agaroz jel küçük bir blok yapıştırmayın.
    NOT: Diğer destek mekanizmaları kullanılabilir, ancak destek olmadan, Vibratome düzensiz kesitlerinin neden beyne itebilir.
  3. Vibratome kalın bölümler 4 hızı ve 9 genliği ayarlanmış 160 mikron (görüntüleme için kullanılan objektif çalışma mesafesi) içine doku kesin.
    Not: hız ve genliği ayarlar özellikle makineye bağlı olarak ayarlanabilir, daha yumuşak bölümleri elde etmek için kullanılır. Ayarları iseDoğru değil, sonuç düzensiz bölümleri, doku ya da sohbet işaretleri yırtılma olabilir.
  4. Onlar bir hafta içinde temizlenmiş olacak eğer 1x PBS soğutulmuş taze dolu bir parıldama şişesine, içine doku bölümleri toplayın. Bölümler bir hafta içinde temizlenmiş olacak değilseniz, -20 ° C'de karyo-koruyucu solüsyon ve mağaza ile dolu 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yer bölümleri.

Beyin Doku Bölüm 4. Optik Takas

NOT: Bu protokol daha önce yayımlanmış bir yönteme 8 modifiye edilmiştir.

  1. 1x PBS +% 2 Tween-20 (Gl / PBST),% 25,% 50,% 75 ve% 90 hacim / hacim Gliserol hazırlayın.
  2. Karyo-koruyucu olarak ise, 1 x PBS içerisinde çalkala ve% 25 Gl / PBST 10 ml su ihtiva eden bir parıltı şişesine transfer 1x PBS bölümleri çıkarmak ya da. 12 saat süre ile, maruz ışığa kapalı 4 ° C sıcaklıkta bir çalkalayıcı üzerinde yer tüpe konulmuştur.
  3. Tüm bölümler bo battı olduğunu onaylayınŞişenin ttom. Kesitler daha sonra 12 saat süre ile, ışığa maruz kalma ile ilgili kapalı, 4 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde 10 ml% 50 Gl / PBST ile şişe ve yerini doldurmak karşılamak için yeterli bırakarak,% 25 Gl / PBST aspire. % 75 Gl / PBST sonra% 90 Gl / PBST için bu işlemi tekrarlayın. Maksimal takas ulaşmak için 24 saat boyunca% 90 Gl / PBST bölümleri bırakın. Takas işleminin boyunca, kademeli optik takas (Şekil 4) gözlemlemek.
    NOT: çözüm bölümleri şişenin dibine battı hemen sonra değişti, bu süreç hızlandırılmış olabilir. % 75 ve% 90 çözümlerinde, bölümler şişenin dibine tüm yol lavabo olmaz ama ortada yüzer.

5. Montaj Beyin Doku Bölümler

  1. Bir ara parçası oluşturmak için 5 parçaya bir numaralı 1.5 lamel kesin. Şekil 5A gösterilen kesikli çizgiler boyunca lamel puan ve kırmak için bir cetvel ve elmas uçlu kalem kullanın. Sil to bir pencere oluşturmak için düz cam slayt 4 dış parçaları düzenlemek, parça merkezi, ve sonra doğru konfigürasyonda (Şekil 5B) slayt için aralama parçaları yapıştırmak için dikişleri üzerine şeffaf tırnak cilası fırça.
    NOT: boşluk slayt ve temizlenmiş bölümleri montajı için lamel arasında gerekli alan oluşturmak için kullanılır. lamel gerekli herhangi bir boyut penceresi oluşturmak için farklı şekillerde kesilebilir. Önceden kesilmiş köpük ara parçaları da ticari olarak temin edilebilir. Oje tamamen kuruması için, en az bir gün önce montaj bölümlere ayırıcılar ile slaytlar yapmak en iyisidir.
  2. Ucu ile plastik bir transfer pipeti kullanarak bir slayt aktarın bölümleri kesti. % 90 Gl / PBST ile çevredeki doldurmak için emin olun. Dikkatle emin herhangi bir kabarcıkları tanıtmak için değil yapım bölümler üzerinde bir lamel düşük. Aşırı Gl / PBST bir tüy bırakmayan silin uzakta wicked olabilir.
  3. Görüntü GFP + RFP içeren nöronlar + (Şekil 7A-B) Daha sonra mağaza slaytlar düz ve 4 ° C'de ışıktan kaplı ile Toxoplasma gondii kistler.
    NOT: Alternatif, mühür tamamen çevresindeki tüm kenarları saklamak ve daha sonra görüntülü slaytlar. Slayt mühür net oje kullanımı isteğe bağlıdır ve bir daha fazla işlem için daha sonraki bir tarihte slayt bölümleri kaldırmak olsaydı daha zor lamel kaldırmak için yapabilir.

6. Görüntüleme

NOT: Herhangi bir mikroskop yüksek çözünürlüklü z yığınları elde yeteneğine sahip olduğu kullanılabilir.

  1. Başlangıçta 10X de odak düzlemi bulduktan sonra, bir 20X objektif değiştirmek ve bir GFP + hücre içinde bulunan bir kist tespit etmek bölümü üzerinden tarama. Görüş alanında ilgi (ROI) bölgesi Merkezlenmesi.
  2. 40X objektif değiştirin. Emin olmak için tüm ROI ile yukarı ve aşağı odaklanın tüm hücre ve cySt görebilir.
    NOT: Görüntüler 40X / 1.30 Yağ DIC M27 amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilmiştir.
  3. Yüklü görüntüleme yazılımı kullanarak, kist ile tüm hücreyi içeren bir z-yığını edinin. Görüntüler elde etmek için kullanılan ortalama ayar, Şekil 6'da gösterilmiştir.
    NOT: Ayarlar her araştırmacılar doku kesitlerinde ve mikroskop özelliklerine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
  4. 64 projeksiyonlar sayısını ayarlayarak tam dönme görünüm elde 1. projeksiyonlar sayısını ayarlayarak z-yığını maksimum projeksiyon görüntü elde.
    NOT: Diğer yazılım paketleri mevcuttur ve maksimum projeksiyon elde etmek için kullanılabilir, dönme gibi z-yığın görüntüleri diğer görünümler.
  5. Görüntü analiz yazılımı ile görüntüyü analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 7, A ve B, bu yeni olduğu kist içeren iki farklı 160 mikron kalınlığında kesitler aynı zamanda Şekil 7B'de kist-hücre vücut mesafenin bir temsili ölçüm. Şekil gelen GFP + nöronlar göstermektedir Şekil 7, iki temsili görüntüleri içerir Protokol, bir bütün olarak enfekte nöron olarak gösterebilir. Şekil 7C, bu görüntüleme tekniği ile birlikte, kist ve hücre gövdesi (Imaris 7.7) arasındaki mesafeyi ölçmek için mümkün olduğunu göstermektedir. Şekil 7D, Şekil tam bir dönme görünüşüdür 7B. Bu şekilde z-yığının Görselleştirme hücre ve kist tamamen yakalama doğrulanması için izin verir. Şekil 7E 7D görüntü kist mesafeyi ölçmek için Imaris 7.7 yazılımı ile analiz edilebilir nasıl gösteren bir 3D dönme film hücre gövdesi birinden orta-to-orta or kenardan kenara. Gösterilen ölçüm hücresi vücuda gerçek GFP + sürecinin ardından kist ve hücre gövdesi, bir ölçüm arasında düz bir çizgi kullanılarak yapıldı olsa da oluşturulabilir (veriler gösterilmemiştir) olabilir.

Şekil 1,
Şekil 1: fare beyin çıkarılması için cerrahi ekipman. (A) Emici ped. Ayak aşağı pin (B) Köpük blok. (C) İğneler. (D) 25 G Kan toplama seti. (E) 3-yollu musluk. (F) Heparin / Tuzlu için 20 ml şırınga. ( G)% 4 PFA. (H) Thumb forseps için 20 ml şırınga. (I) Güzel makas, keskin keskin, yan açılı. (J) Keskin keskin makas. (K) Kelly hemostatlar. (L) Mayo makas. (M) (N) Skintilasyon flakon. Ölçek çubuğu = 8 cm.

Şekil 2,
Şekil 2: Hasat fare beyin. Yanlış perfüzyon sonra (A) Fare sıkıştırdılar ve göğüs% 70 EtOH ile püskürtülür. (B) Maruz göğüs. (C) Göğüs boşluğu açık. Doğru perfüzyon sonra (D) Karaciğer. (E) Karaciğer. (F) Maruz kafatası. ( kaldırıldı yarım kafatası G) Beyin. (H) uygun perfüzyon sonra% 4 PFA. (I) Beyin ile dolu şişe içinde hasat beyin. (J) Beyin uygunsuz perfüzyon sonra.

Şekil 3,
Şekil 3: fare beyin Kesit. (A) Fare beyin matri x. (B) Fare beyin ve agaroz jel soğutulmuş 1x PBS ile dolu Vibratome odasının içine siyanoakrilat ile blok montaj yapıştırılmış.

Şekil 4,
Şekil 4: işlemi temizleme temizleme sürecinin her aşamasında bir fare beyin bölümünün Temsilcisi görüntüleri..

Şekil 5,
Şekil 5: Kesme ve slayt ayırıcı sabitleme. 5 parçaya lamel kesmek için temsili işaretleri ile. No 1.5 lamel. B. Kesme lamel her parça ile düz cam slayt bir pencere oluşturmak için şeffaf tırnak cilası ile yerine sabitlenir.

2237 / 52237fig6highres.jpg "/>
Şekil 6: görüntü elde etmek için kullanılan genel parametreler ekran görüntüsü.

Şekil 7,
Şekil 7:. Toxoplasma gondii kistler uzak nöronal süreçler içinde bulunabilir (AB) maksimum projeksiyon GFP görüntüleri + RFP + kistler (beyaz oklar) içeren nöronlar. Ölçü bar = 20 um. (CE) B'de gösterilen kist nöron ilişkisinin ek görselleştirme ve analiz sağlar. Hücre gövdesinin kenarına kist kenarından mesafe (C) Imaris oluşturulan doğrudan hattı ölçümü (149μm ). (D) 3-D dönme film . (E) Imaris oluşturulanwww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Şekil 7E.avi "target =" _ blank "den kist-to-hücre vücut ölçümü gösteren> 3-D film hem orta-orta (163 mikron) ve kenardan kenara (149 mikron).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Enfekte konak hücrelerde hücresel değişiklikler gibi HIV, kuduz, ve Chlamydia 18,19 gibi diğer hücre içi organizmalar ile enfeksiyonlarda hastalık sonuçları ile bağlantılı olduğunu göz önüne alındığında, bize MSS arasında meydana samimi etkileşimleri çalışmak için izin verecek bir teknik geliştirdi hücre ve Toxoplasma ev sahipliği. Burada anlatılan yöntem kronik olarak enfekte nöronların verimli görüntüleme sağlayarak bu hedefe gerçekleştirir. Bu yöntemin gelişmesi önce, bu tür bir görüntüleme zaman alıcıdır, pahalı veya mümkün değildi.

Biz şimdi böyle parazit hedeflenen spesifik nöronal alanlar olarak Toxoplasma -neuron etkileşimi ile ilgili temel sorulara cevap için bu tekniği kullanabilir? Bu Toxoplasma suşları arasında farklılık mı? Kist (yani enfekte yapmak ve aynı nöron bulaşmamış dendritler dikenler aynı sayıda hücrenin geri kalanından farklı bulunduğu hücresel alanlar mı)? Enfekte nöronlar tarafından paylaşılan cep özellikleri nelerdir? Bu tür sorulara cevap yeteneği Toxoplasma enfeksiyonu davranış düzeyinde olmak üzere, CNS değişiklikleri nasıl anlayış esastır.

Mümkün olan en iyi görüntü elde etmek için, doku hatta bölümler halinde kesilir emin olmak için çok önemlidir. Bölümler düzensiz ise, lamel alt optimum görüntüleme sonuçlanan amacı ile düzensiz temas giden bölümde düzgün oturmak değil. Bu protokolün optimizasyonu sırasında, bazı değişiklikler yapılmıştır. Orijinal temizleme işlemi SeeDB 20 olarak bilinen bir tekniğin kullanımı ile gösterilen sonuçları üretmek için bir girişim, fruktoz ile yapıldı. Bu RFP (özellikle mCherry) söndürüldü Bu yöntem, bu model ile uyumlu idi. Bir başka önemli bir adım ve tüm muhtemelen en önemli doku kesitlerinin maksimum temizlenmesi için izin veriyor. Düzgün temizlenmiş değil, arka plan ışığı kırınım yüksek olacaktır vegörüntüler gürültülü olur. Bu gliserol Tween-20 eklenmesi sadece gliserol biraz daha net bir görüntü verdiği bulunmuştur. Mevcut teknoloji bize 160μm kalınlığında beyin dokusu bölümleri ile z-yığın görüntüler elde etmek, ancak gelecekte, biz daha derinlemesine analiz izin vermek için 500 um ya da daha fazla bu kalınlığı artırmak için arıyoruz tanır.

Bu sadece tüm hücre ve beyin küresel Toksoplazma tarafından nasıl etkilendiğini bir mekanik fikir geliştirmek başlayabilirsiniz kendi bağlantıları bakarak gereğidir. Bu yeni protokol tek hücre düzeyinde Toxoplasma -neuron etkileşimi incelemek ve hızlı, ekonomik bir şekilde bunu yapmak için bir fırsat sunuyor. Biz bu protokol için potansiyel kullanım tüm keşfetmek için henüz ve diğer sistemlere çevirmek nasıl ama biz birden fazla uygulama olacaktır tahmin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz yararlı tartışmalar için tüm Koshy laboratuar teşekkür ederim. Biz Patty Jansma ve tavsiye için Arizona Sinirbilim Anabilim Dalı Üniversitesi teşekkür ve görüntüleme yardım. Biz de onların Vibratome kullanımı için Porreca laboratuar teşekkür ederiz. Bu araştırma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH NS065116, AAK) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Series 1000 Sectioning System Technical Products International, Inc. Other vibratomes are compatible
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Premium Slides Fisher Scientific 12-544-2
#1.5 Coverslips VWR 48393 251
Diamond Scriber VWR 52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope Zeiss LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml Western Medical Supply, Inc. 4165
AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml Lloyd Inc.
ZsGreen Mice Jackson Laboratories 7906 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) HyClone SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
200 mM L-alanyl-L-glutamine Corning 25-015-Cl
25 cm2 Canted neck flask Fisher Scientific 1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium VWR 45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade amresco K813-500ml
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Bright-Line Hemocytometer Sigma-aldrich Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS005-1
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-aldrich H3393-100KU
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042-500
20 ml Disposable Scintillation Vials Fisher Scientific FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof In-house 17212945 This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software Bitplane
Clear nail polish Other brands are compatible
10 ml Syringe with Luer-Lok VWR BD309604 Other syringes are compatible
Three-way Stopcock Any brand is compatible
Hypodermic needle Any brand is compatible - used to pin down mouse.
Cell Scraper Any brand is compatible
25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter Greiner Bio-One 450099 Other brands are compatible

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15, (2), 211-222 (1992).
  2. Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8, (10), 634-640 (2002).
  3. Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8, (9), 75246 (2013).
  4. Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
  5. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411, (1), 39-43 (1987).
  6. Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72, (4), 463-474 (1991).
  7. Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. (2010).
  8. Selever, J., Kong, J. -Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
  9. Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7, (4), 307-309 (2010).
  10. Koshy, A. a, Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8, (7), (2012).
  11. Madisen, L., Zwingman, T. a, et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, (1), 133-140 (2010).
  12. Caffaro, C. E., Koshy, A. s, Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9, (5), (2013).
  13. Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21, (10), 476-481 (2005).
  14. Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11, (2), 267-299 Forthcoming.
  15. Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29, (3), 205-214 (2014).
  16. Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6, (12), 28925 (2011).
  17. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73, (6), 483-491 (1987).
  18. De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46, (3), 614-638 (2012).
  19. Scott, C. a, Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82, (1), 513-521 (2008).
  20. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, (8), 1154-1161 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:

Anita A. Koshy, Carla M. Cabral

to:

Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte<em&gt; İn Vivo</em&gt; Ile<em&gt; Toxoplasma gondii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).More

Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter