Abstract
Candida albicans desenvolvimento de biofilmes em superfícies bióticos e / ou abióticos representa uma ameaça específica para os pacientes hospitalizados. Até agora, C. albicans biofilmes foram estudadas in vitro, mas predominantemente existe uma necessidade importante para uma melhor compreensão deste processo dinâmico em condições in vivo. Desenvolvemos um modelo de rato in vivo subcutânea para estudar C. formação de biofilme albicans. No nosso modelo, múltiplo (até 9) infectados com Cândida dispositivos são implantados para a parte de trás do animal. Isso nos dá uma grande vantagem sobre o sistema modelo de cateter venoso central, uma vez que nos permite estudar vários biofilmes independentes em um animal. Recentemente, nós adaptamos este modelo para estudar C. albicans desenvolvimento de biofilmes em ratinhos BALB / c. Neste modelo, amadurecer C. biofilmes albicans desenvolver dentro de 48 horas e demonstrar a arquitetura típica biofilme tridimensional. A quantificação de biofilme fúngicaé tradicionalmente analisada post mortem e exige sacrifício host. Uma vez que este requer o uso de muitos animais para realizar estudos cinéticos, aplicou-se a bioluminescência de imagem não invasiva (BLI) longitudinalmente para acompanhar amadurecem in vivo C. albicans biofilmes em desenvolvimento em nosso modelo subcutâneo. C. albicans células foram manipuladas para expressar o gene da luciferase princeps Gaussia (GLIC) ligado à parede celular. O sinal de bioluminescência é produzido pela luciferase que converte o substrato coelenterazina adicionada a luz que pode ser medida. O sinal BLI se assemelhava a contagem de células obtidas de cateteres explantados. Imagem não invasivo para a quantificação da formação de biofilme vivo fornece aplicações imediatas para a triagem e validação de drogas antifúngicas em condições in vivo, bem como para estudos baseados em interações patógeno-hospedeiro, vem contribuindo para uma melhor compreensãoing da patogenia das infecções associadas ao uso de cateter.
Introduction
Cândida albicans é um organismo comensal, que pode ser encontrada em diferentes locais de indivíduos saudáveis, por exemplo sobre a pele ou como uma parte do tracto gastrointestinal e a flora vaginal. No entanto, em hospitalizados, e especialmente pacientes imunocomprometidos, pode causar uma grande variedade de infecções 1. Nesses indivíduos, o sistema imunológico enfraquecido permite que as células de Candida de divulgar para a corrente sanguínea e invadir tecidos mais profundos causando infecções potencialmente fatais. Além disso, a presença de substratos abióticas, tais como cateteres venosos centrais e urinários, válvulas cardíacas artificiais, e as juntas podem proporcionar um nicho para Candida de fixação 2. Adesão ao tais substratos é um pré-requisito para um maior desenvolvimento de biofilme, o que representa uma camada de levedura e hifas células embutidos em material polimérico extracelular, que consiste principalmente de polissacarídeos 2. C. cateter -associated infecções albicansestão associados a alta taxa de mortalidade. A característica geral de biofilmes é a sua sensibilidade diminuída ao antifúngicos conhecidos, tais como azoles 3,4. Apenas as classes mais novas de drogas antifúngicas, como equinocandinas e formulação lipossomal da anfotericina B mostrou-se ativa contra as infecções associadas ao uso de cateter 5-7. Por causa do biofilme resiliência aos antifúngicos, abordagens terapêuticas são muito limitados, muitas vezes levando a remoção do cateter e sua posterior substituição como uma solução única.
A maioria de nossa compreensão atual do C. albicans desenvolvimento do biofilme se origina a partir de estudos in vitro sobre substratos abióticas, tais como poliestireno, ou plásticos utilizados para o fabrico dos dispositivos acima mencionados, ou seja, silicone, poliuretano 2. Estes modelos são bastante avançado e tentar simular a situação in vivo, tanto quanto possível. No entanto, estes sistemas não envolvem o fluxo sanguíneo contínuo e tele sistema imune do hospedeiro. Isto resultou no desenvolvimento de sistemas modelo in vivo, tais como o modelo de cateter venoso central (CVC) 8-10, o modelo de estomatite dentadura candidíase oral 11 e um modelo murino para associada a cateter candidúria 12. Além disso, C. albicans desenvolvimento de biofilme foi estudado in vivo sobre as superfícies das mucosas, tais como aqueles a partir da vagina 13 e cavidade oral 14. Nosso laboratório contribuiu com a criação de um C. subcutânea albicans modelo biofilme, que se baseia no implante de peças cateter infectados no dorso de ratos Sprague-Dawley 15. Este modelo foi utilizado com sucesso em nosso laboratório para testar a suscetibilidade biofilme ao fluconazol ea equinocandina drogas 5,16, para estudar o efeito da terapia combinatória de diclofenaco e caspofungin 17. Mais recentemente, este sistema adaptado para utilização em ratinhos BALB / c 18,19. Emcomparação com outros modelos in vivo, a principal vantagem deste modelo subcutânea é a possibilidade de estudar vários biofilmes por animal desenvolvido no interior do lúmen do cateter implantado peças.
Para reduzir o número de animais de laboratório, que se adaptaram este modelo para estudar o desenvolvimento de C. albicans biofilmes não-invasiva usando imagem de bioluminescência (BLI) 18,19. Este método provou ser uma técnica poderosa que pode ser utilizada para quantificar os biofilmes medindo o sinal específico BLI na região de interesse (no nosso caso, a área de cateteres implantados), evitando-se o sacrifício dos animais. Em comparação com as bactérias, o que pode expressar o gene e o substrato necessário para a reacção de bioluminescência devido à introdução de um operão lux específico 20, a maioria dos organismos eucariotas, incluindo C. albicans, são dependentes da expressão heteróloga de um gene da luciferase, juntamente com oadministração externa de um substrato específico, tal como D-luciferina ou coelenterazina 21. Provavelmente devido à presença da parede da célula fúngica e C. morfogénese albicans, a entrega intracelular do substrato para a enzima luciferase foi um desafio principal 21. A fim de resolver este problema, Enjalbert et al. 22 de engenharia em que uma estirpe de um C. sintético albicans versão optimizada do codão para o gene naturalmente secretada Gaussia princeps luciferase (GLIC) foi fundida com a da C. gene albicans PGA59, um GPI- ancorada proteínas da parede celular. Devido à presença de luciferase na parede celular, problemas de disponibilidade intracelular do substrato pode ser evitada. Este sistema em particular foi utilizado para estudar as infecções superficiais causadas por C. albicans 22. Muito recentemente, a BLI também foi utilizado para seguir a progressão da candidíase orofaríngea e a sua postratamento e 23. Tais resultados suportam o uso de BLI como uma técnica promissora para estudar infecções causadas por células de vida livre, mas também infecções associadas aos dispositivos.
Neste estudo, descrevemos a C. albicans desenvolvimento de biofilme em peças de cateter de poliuretano em camundongos BALB / c e sua quantificação usando BLI. Nós fornecer um protocolo detalhado de colonização in vitro de cateteres de poliuretano durante o período de adesão, seguido pela implantação em ratinhos e subsequente desenvolvimento de biofilme em animais vivos. Para além de medir o sinal emitido pelo BLI C. células albicans, nós também determinar a unidades formadoras de colónias de comparação com a técnica padrão para biofilme fúngico carga quantificação.
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Protocol
NOTA: Todas as experiências com animais foram aprovados pelo comitê de ética da KU Leuven (número do projeto 090/2013). Manter animais em conformidade com as orientações de cuidados de animais KU Leuven.
1. C. Crescimento albicans
- Vinte e quatro horas antes do início da experiência animal, para preparar as placas de YPD por adição de 10 g de extracto de levedura granulado, 20 g de peptona bacteriológica, e 15 g de agar granulado. Certifique-se o volume para 900 ml com água Milli-Q e autoclave.
- Adicionar 50 ml de estéril de glicose a 40%. Misture bem e despeje em placas de Petri. Deixar placas de agar para esfriar e solidificar.
NOTA: Neste estudo, use duas linhagens, ou seja, do tipo selvagem C. albicans SC5314 - Gluc tensão negativa (referido como WT) e C. albicans estirpe SKCA23, que é um tipo selvagem C. albicans SC5314 transformada com Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmídeo 22 .Neste estirpe (nomeado SKCA23- ACTgLuc) gluc foi fundida com o gene endógeno PGA59 sob o controlo de ACT1 (actina) promotor (isto é promotor activo na levedura, bem como fase de crescimento de hifas de fungos). Esta variedade pode ser solicitado ao laboratório do Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, na Bélgica. Plasmídeo Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmídeo 22 foi gentilmente doado pelo Prof. C. d'Enfert, Instituto Pasteur, Paris, França. - Manter ambas as estirpes em stock glicerol e armazenar a -80 ° C.
- Antes de todas as estirpes experimento raia numa placa de YPD. Incubar a placa a 37 ° C durante a noite.
2. Cateter Pieces Preparação
- Antes do experimento, determinar quantos cateteres são necessários. É possível implantar até 6 partes de cateter por ratinho (3 cateteres no lado esquerdo e 3 do cateter no lado direito do animal (Figura 2A).
- Vinte e quatro horas antes da cirurgia animal, abra o pacoteidade contendo cateter triplo-lúmen sob a cabine de segurança biológica. Remova todas as peças desnecessárias com pinças estéreis e cortar a parte ligada ao cateter com um bisturi estéril. Coloque governante no âmbito do pacote de plástico e cortar pedaços de cateter de poliuretano de exatamente um centímetro de acordo com a escala da régua (Figura 1).
NOTA: É importante mencionar que este tipo de peça cateter não é fosforescente e, portanto, adequado para BLI 18,19. - Coloque um máximo de 15 peças de corte de cateter (passo. 2.2) em 2 ml microtubos. Sempre preparar 3 peças adicionais, que são usadas para enumerar a quantidade de células de Candida em anexo no dispositivo após o período de adesão.
- Suplemento cateteres com aproximadamente 1,8 ml de 100% de soro fetal bovino (FBS).
- Vortex vigorosamente e adicionar adicional 100-200 ul de 100% de FBS. Cobrir completamente todas as peças de cateter com soro.
- Incubar a 37 ° C durante a noite.
3. Animais e supressão do sistema imunitário
- Mantenha feminino camundongos BALB / c (cerca de 8 semanas de idade) no topo gaiolas com filtro ventilado individualmente com acesso livre à comida padrão e água ad libitum.
- Iniciado supressão do sistema imunológico 24 horas antes da cirurgia de animais adicionando dexametasona (0,4 mg / L) na água de beber dos animais. A fim de evitar qualquer contaminação bacteriana do hospedeiro, completar a água potável com antibiótico, por exemplo, pó de ampicilina de sódio (0,5 g / L).
- Manter imunossupressão dos animais durante toda a experiência (até 6 dias).
4. Substratos poliuretano ex vivo C. albicans Aderência em FBS revestidas
- Transferir cada peça cateter revestido de soro para um tubo de 1,5 mL de microcentrífuga fresco.
- Raspe alguns C. albicans células cultivadas em placas de YPD (Passo 1) e suspendê-las em 1 ml de PBS.
- Diluir Candida células (1: 100) em um tubo de microcentrífuga separados. Tomar 10 ml da amostra diluída e aplicá-lo em uma câmara de contagem de células. Contagem pelo menos 16 pequenos quadrados.
- Preparar as células de Candida (cada estirpe em separado) em meio RPMI 1640 para uma concentração final de 5 x 10 4 células / ml.
- Adicionar 1 ml de suspensão de células a cada pedaço do cateter revestido de soro.
- Vigorosamente vórtice e garantir que os cateteres estão submersos no meio e não flutuando em cima.
- Incubar cateteres em 37 ° C durante 90 min (tempo de adesão).
- Remover cateteres com pinças estéreis e lavar duas vezes com 1 ml de PBS. Durante esta etapa, certifique-se de que o líquido de lavagem passa através do lúmen, mantendo o cateter em posição vertical durante a lavagem muito suavemente os cateteres. É importante notar que não utilize um fluxo forte que pode conduzir à eliminação de células ligadas.
- Transferência de cada cateter lavada para um tubo de microcentrífuga limpo (uma peça por tuser).
- Coloque no gelo e manter lá até a cirurgia.
5. Anestesia
- Prepare a anestesia por mistura de 75 ul de cetamina (100 mg / ml) com 100 ul de medetomidina (1 mg / ml) e 825 ul de solução salina estéril. Administrar por via intraperitoneal (ip) de 60-80 ul de coquetel de anestésico por 10 g de peso corporal, o que resulta em uma dose de 45-60 mg / kg de cetamina e 0,6-0,8 mg / kg de medetomidina.
- Para inversão da anestesia, diluir 50 ul atipamezol (5 mg / ml) em 4,95 ml de solução salina, administrar ip 100 ul por 10 g de peso corporal como antídoto, resultando numa dose de 0,5 mg / kg.
- Após a injeção de anestesia, colocar o animal em uma gaiola separada e esperar até que esteja totalmente adormecido.
- Confirme anesthetization adequada do animal por pitada pele clara e pitada toe, que não causam qualquer dano à pele. Qualquer movimento observado indica que o animal não é suficientemente anestesiados para realizar a cirurgia. Se isso acontecer, espere um couple de minutos a mais até que o animal não mostra qualquer sinal de movimento sobre a pele ou toe pitada.
6. Cirurgia animal
- Transferência anestesiados animal a partir da gaiola sobre um tecido limpo colocado sobre a almofada de aquecimento, pré-aquecido a 37 ° C (Figura 2A, (1)).
NOTA: Uma alternativa mais barata é usar cobertores elétricos. É também possível a utilização de almofadas de isotérmicas, que deve ser aquecido no forno de microondas, antes da cirurgia animal. - Aplicar pomada oftálmica para os olhos.
- Raspar a parte inferior das costas do animal com um barbeador elétrico. Remova todos os pêlos de animais e transferir animais em um tecido limpo. Desinfecção da pele (por exemplo, com 1% de isopropanol iodo ou clorexidina 0,5% em álcool a 70%) e deixar a área desinfectada para secar durante cerca de 1 min (Figura 2A, (2)).
- Fazer uma pequena incisão na pele (um à esquerda e uma no lado direito do animal) (aproximadamente 0,5 &# 8211; 1 cm) (Figura 2A, (3)).
- Dissecar o tecido subcutâneo com uma tesoura para criar dois túneis subcutâneos. Cada túnel deve ser de aproximadamente 1,5 centímetros de comprimento e 1 cm de largura.
- Insira três peças cateteres, previamente infectados com Candida, em cada túnel. Certifique-se de que os cateteres caber ao lado uns dos outros numa disposição horizontal, e que eles não cobrem o outro para permitir a implantação de seis fragmentos de cateter no total (Figura 2A, (4)).
- Feche as incisões com suturas. Alternativamente, usar Dermabond para fechar a ferida.
- Desinfectar a ferida muito suavemente com 0,5% de cloro-hexidina em 70% de álcool ou de isopropanol com iodo (1%).
- Aplicar anestésico local (xilocaína gel, 2%) directamente na ferida.
- Administrar reversão da anestesia (protocolo de 5, passo 2): por via intraperitoneal 100? L por 10 g de peso corporal.
- Transferência dos animais a uma gaiola limpa previamente colocados sobre uma placa de aquecimento. Mantenha o animalseparado e quente até que o animal está completamente acordado. Enquanto isso, continue com a operação e implante do próximo animal. Uma vez que todos os animais operados está totalmente acordado. Transfira para uma gaiola. Monitorar os animais regularmente.
7. A bioluminescência Imagem: Preparação de celenterazina (CTZ), o substrato para G. luciferase princeps
- Preparar fresco coelenterazina (CTZ) solução estoque por dissolução de 5 mg / ml em etanol acidificado CTZ ou de acordo com as instruções do fabricante.
- Preparar a solução de trabalho de 1,2 mM, por diluição da solução de reserva de 1:10 em PBS estéril.
NOTA: injectar 100 ul CTZ soluções de trabalho por via subcutânea na área em torno dos cateteres. Use seringas de insulina por injecção subcutânea de CTZ. - Sempre mantenha CTZ no escuro (por exemplo, cobrir microtubos contendo CTZ com folha de alumínio). Guardar a solução estoque a -80 ° C durante a duração das experiências. 8. A bioluminescência Imagem
- Inicializar a câmera BLI.
- Anestesiar os animais utilizando uma caixa de indução. Utilize uma mistura gasosa de isofluorano em oxigénio, N 2 O / O 2, ou ar em 2-3%.
- Após a indução, manter a anestesia na caixa de indução e na câmara de imagem em 1,5-2%.
- Antes de iniciar a sessão de imagem, colocar a placa de imagiologia, na posição A, que corresponde a um campo de visão de 10 cm. Certifique-se que a posição correta dos pontos de venda de anestesia e os animais, colocando um animal dormir na caixa.
- Tire algumas fotografias até que animal é na posição de imagem desejada, no campo de visão direita sob a câmera.
- Prepare duas seringas de insulina, cada um contendo 100 ul da solução de trabalho CTZ.
- Coloque um animal no banco e mantê-lo no sono por meio de um cone do nariz proporcionando anestesia gás.
- Traga as agulhas das seringas num local circundante cateteres e injectar subcutaneamenteo CTZ simultaneamente no topo dos cateteres.
- Imediatamente após a injeção, coloque o animal na chapa quente na caixa de câmera e começar a aquisição de imagem de bioluminescência.
- Adquirir verificações consecutivas com tempos de aquisição que variam de 20 a 60 segundos (dependendo da intensidade do sinal) até que a intensidade máxima do sinal é alcançado. Durante a aquisição do quadro seguinte, medir a intensidade de sinal BLI dos quadros previamente adquiridos pela colocação de um ROI sobre cada trio cateteres e medindo o fluxo de fotões através desta ROI.
- Repita a partir do passo 7 para o animal seguinte (s).
- Depois de imagem, retornar os animais para sua gaiola. Repita BLI durante o curso de um experimento para longitudinal, não-invasivo follow-up de formação de biofilme.
- Analisar os dados BLI usando Viver software de imagem. Coloque um ROI retangular de tamanho fixo em cada trio cateter e medir o fluxo de fótons (radiação) por cada ROI. Repita esse procedimento para cada animal.
- Relatórioa intensidade do sinal de cada BLI trio cateter como fluxo de fótons por segundo. Representam os dados BLI numa escala logarítmica através da representação gráfica da média e desvio padrão de fluxo de fotões por segundo para cada grupo. Realizar análise estatística sobre os log 10 dados transformados.
- Preparar tubos de microcentrífuga contendo 1 ml de PBS, uma para cada dispositivo de cateter e mantê-los em gelo.
- Eutanásia dos animais por deslocamento cervical (Figura 2B, (1)).
- Desinfecção da pele do dorso com 0,5% de cloro-hexidina em 70% de álcool ou com isopropanol iodo (1%).
- Realizar uma incisão (cerca de 3 cm) acima dos cateteres.
- Corte o tecido subcutâneo e remover os fragmentos de cateter, um por um de debaixo do tecido subcutâneo utilizando pinças estéreis (Figura 2B, (2)).
- Pega cateter suavemente na posição vertical e lavá-lo duas vezes com 1 ml de PBS estéril. Coloque cada cateterpedaço para um tubo de microcentrífuga separados (preparado na Fase 1).
- Sonicar cateteres colocados previamente em 1 ml de PBS durante 10 min a 40.000 Hz, em um banho de água sonicador e colocá-los em gelo.
- Depois de ultra-sons, vigorosamente vortex por 30 segundos e coloque novamente no gelo.
- Preparar dois tubos de microcentrífuga adicionais contendo 900 ul de PBS.
- Adicione 1:10 e 1: 100 a partir de diluições sua amostra original (aquele que contém o cateter) e manter todos os tubos de microcentrífuga em gelo.
- Placa de 100 ul das amostras originais, 1:10 e 1: 100 diluições em placas de YPD-agar em duplicado.
- Incubar as placas durante 2 dias a 37 ° C e contagem de UFC.
- Contar as colônias cultivadas em placas de ágar YPD (valor contábil de colônias, máximo de 300 colônias / placa) e multiplicá-los pelo bom Dilufator mento (1x-original, 10x ou diluição 100x). Além disso multiplicar cada pedaço de cateter por 10x, o que corresponde ao valor final das colônias em um tubo ml contendo o cateter. Traga o montante final das colônias para log 10 células / pedaço de cateter com desvio padrão (SD). Expresso de dados como a média ± SD.
- Coloque todos os valores para cada cateter e grupo específico para um programa de folha de cálculo e / ou estatístico, para realizar os cálculos e as análises estatísticas acima mencionados. Indique grupos específicos para comparar, ou seja, WT vs. mutante ou 2 dias vs. 6 dias de formação de biofilme e realizar teste t não pareado e ANOVA com pós-teste de Tukey com os dados transformado-log10.
- Expresse o nível de significância por um valor de p. Neste estudo indicam significância, se o valor de p <0,05, representado como se segue: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.
9. Cateter Explant
10. As células A quantificação do biofilme-associados por Formadoras de Colônias Conde Units (UFC) e Análise estatística dos resultados
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Representative Results
Neste estudo, nós mostramos o procedimento cirúrgico de implante do cateter e explante durante in vivo C. albicans desenvolvimento de biofilme em um mouse. Além disso, exibimos a quantificação dos biofilmes maduros não só por classical UFC enumeração, mas também por BLI.
Como mostrado na Figura 1A, não fosforescentes peças cateter de poliuretano foram cortadas em dispositivos 1 cm e subsequentemente revestidas com soro. Esta etapa é muito importante, pois permite que as células de Candida para anexar ao substrato mais rapidamente em comparação com os não-soro implantes revestidos 15. É importante mencionar que, antes de qualquer C. experimento albicans nós primeiro documentou a luminescência dos nossos dispositivos de 18 fundo. Este passo é essencial antes de executar qualquer BLI porque alta fosforescência do dispositivo irá interferir com a avaliação dos sinais de intensidade e sinal cinética bioluminescentes específicos de gLuc-expressando células. Em seguida, C. albicans células são incubadas com as peças de cateteres revestidos de soro. Cateter fragmentos são então implantados na parte de trás do animal após a incisão subcutânea (Figura 2A). Neste in vivo criado, duas incisões são realizadas (uma à direita e outra no lado esquerdo das costas de um rato) seguido por formação de túnel subcutâneo, no interior de cada incisão (Figura 2A (3)). Posteriormente, três aparelhos, previamente infectados com células de Candida, são implantados dentro de cada local de operação (Figura 2A (3 e 4)). Esta configuração permite-nos estudar até seis biofilmes por animal. Vale ressaltar que dois sites em operação proporcionar uma possibilidade de estudar a formação de biofilme por duas cepas de interesse, por exemplo, do tipo selvagem e mutante no mesmo animal. Figura 2B mostra a ferida contendo cateteres antes do explante dispositivo e subsequente etapa de lavagem.Os biofilmes desenvolvidas no interior da parte traseira do animal foram avaliados para as medições de sinal de bioluminescência. Um dos animais representativos que indicam o sinal de bioluminescência juntamente com rectângulos que caracterizam as regiões de interesse (ROI) é mostrado na Figura 3. Após o último ponto de tempo BLI, cateteres são explantadas, sonicada e agitada em vórtice e subsequentemente ainda avaliado para as células de formação de biofilme quantificação por UFC. A análise dos dados demonstrando os Log 10 UFC obtidas de cada pedaço de cateter após o desenvolvimento de biofilme e explantation são mostrados na figura 4A. Alem disso, as UFC foram comparados com a intensidade do sinal do BLI e estes dados são apresentados na Figura 4B. Noventa minutos após o implante de um sinal claro BLI é produzido pela ACTgLuc -expressing biofilmes Considerando que na linhagem selvagem, quase nenhuma luz é produzida; A intensidade da luz detectada do -expressing ACTgLucbiofilme está a aumentar significativamente à medida que o biofilme é formado, aqui a seguir o mesmo rato (Figura 4C). Este aumento de luz segue a mesma tendência que o aumento em CFU por biofilme (Figura 4A). Nas nossas experiências observamos também que uma estirpe de tipo selvagem normal (não modificada para expressar luciferase) também resulta na produção de luz após a adição do substrato. No entanto, o fluxo de fotões foi significativamente menor do que o obtido para a estirpe de engenharia.
Tomados em conjunto, os nossos dados mostram que as BLI é uma técnica poderosa para monitorizar e quantificar amadurecem in vivo C. formação de biofilme albicans no modelo subcutâneo mouse.
Figura 1: Preparação de dispositivos de poliuretano poliuretano parte do cateter cortado em pedaços 1 centímetro.. Poc Plasticket contendo cateter é aberta sob as condições estéreis e todas as partes, excepto cateter são removidos da embalagem. Em segundo lugar, colocar régua sob o bolso de plástico e cortado exactamente 1 cm pedaços de poliuretano. Tais dispositivos são em seguida distribuídas a tubos de microcentrifugação (máximo de 15 unidades / tubo) e imersos em 100% de soro bovino fetal, seguido por incubação durante a noite a 37 ° C.
Figura 2: Principais passos durante a cirurgia animal. (A) Processo de cateter de implante. (1) Coloque anestesiados animais em uma almofada morna contendo tecido de papel e aplicar a pomada oftálmica nos olhos. (2) Shave parte inferior das costas e desinfectar. (3) Criar dois pequenos (aprox. 0,5 centímetros) incisões através da pele do lado esquerdo e do lado direito das costas. Criar túnel subcutâneo dentro de cada incisão e colocar 3 cateteres dentro. (4) Feche o wo und com suturas e lugar de animais em uma almofada quente para se recuperar. (B) Procedimento de remoção do cateter. (1) Coloque animal sacrificado em uma almofada e desinfectar os cateteres secundários contendo operados. Cortar a ferida logo acima os cateteres. (2) Retire cada cateter suavemente e lavar duas vezes com 1 ml de PBS. Coloque o tubo de microcentrífuga separado.
Figura 3:. Medição do sinal de bioluminescência Na imagem BLI vivo a partir de um ratinho representativo trabalhada após 6 dias de desenvolvimento de biofilme. A quantificação da intensidade do sinal é realizada por colocação de uma região de interesse (ROI) (rectangular) em torno dos cateteres, seguido por medição do fluxo de fótons por segundo através de cada ROI.
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Figura 4: Quantificação de biofilmes de Candida albicans maduros por unidades formadoras de colónias (CFUs) e pela BLI. (A) In vivo amadurecer C. albicans SKCA23- ACTgLuc e SC5314 (WT) biofilme quantificação por Log10 CFU após 90 min, 2 dias e 6 dias de desenvolvimento de biofilme. (B) A bioluminescência intensidade de sinal quantificação de biofilmes formados in vivo por SKCA23- ACTgLuc e por C. WT albicans. O sinal foi determinado após 90 min (período de adesão), 2 dias e 6 dias de desenvolvimento de biofilme. Como controlo, utilizou-se ratos que foram implantados com cateteres não colonizados e que foram injectados por via subcutânea com CTZ. O fluxo de fótons obtidos nestes ratinhos resulta na nossa sinal de fundo (BG). Os dados foram expressos em média ± desvio padrão (SD). A significância estatística é indicada como segue: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.
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Discussion
O uso de modelos animais, e modelos especialmente roedores, para estudos dedicados a biofilmes microbianos é muito importante porque o sistema imune do hospedeiro é um fator essencial na formação de biofilme que modelos in vitro não pode dar conta. Neste estudo, descrevemos um C. subcutânea relativamente simples albicans modelo biofilme rato, que pode ser facilmente adotada em um laboratório de pesquisa e não requer habilidades técnicas fortes. Este modelo foi inicialmente desenvolvido para estudar a formação de biofilme por Staphylococcus epidermidis em um rato 24.
No modelo apresentado, cateteres de poliuretano revestido de soro foram desafiados com células de Candida ex vivo durante o período de adesão (90 min, 37 ° C). Este primeiro passo in vitro pode ser considerado como um factor limitante devido à falta do sistema imunológico nas primeiras fases do processo de infecção biofilme. Após a adesão e antescateter de implante, as células não relacionadas com o dispositivo são removidos por lavagem. Evitando o passo de lavagem após o período de adesão pode criar quantidade incontrolável de células associadas com o dispositivo. Devido a esta razão, sugerimos a lavar cateteres antes do implante e, por conseguinte, ao iniciar o seu desenvolvimento a partir de células aderentes. Após este período de adesão inicial, cateteres conter aproximadamente 2,0-2,5 Log 10 UFC / dispositivo espalhado ao lado do cateter lúmen 15. Durante esta fase Candida forma tubos germinativos, que estão ligados no substrato.
De modo a assemelhar-se à situação em doentes hospitalizados, dos quais o sistema imunitário está frequentemente comprometida, os ratos imunossuprimidos no nosso sistema modelo subcutâneo 15. Deficiência parcial do sistema imune de um rato, antes do implante do dispositivo e ao longo do período de desenvolvimento de biofilme, resultou num aumento da reprodutibilidade das células formadoras de biofilme recuperados decateteres implantados no mesmo hospedeiro, e também a partir de dispositivos obtidos a partir de animais adicionais. Devido a estes achados sugerimos immunosuppress os ratos antes de cateter do implante e também durante o período de formação do biofilme. No entanto, os nossos resultados mostram que a variabilidade em ratinhos imunocompetente é muito menor em comparação com a observada em ratos, o que faz com que o sistema de modelo de ratos também adequado para estudar o papel do sistema imune do hospedeiro em biofilmes. No nosso modelo de rato original e também no mesmo modelo traduzida a ratinhos, amadurecer C. biofilmes albicans desenvolver dentro de 48 horas demonstrada pela quantidade similar de UFC e arquitetura biofilme entre 2 e 6 dias 15,18,19.
O modelo de biofilme subcutânea foi usada com sucesso para acompanhar o desenvolvimento de biofilme por vários mutantes 15. Foi demonstrado anteriormente por Nobile et al. 25 que C. albicans BCR1 Δ / BCR1 Δ não conseguiubiofilmes formulário em um modelo central cateter venoso (CVC). Esta estirpe exibida características biofilme rudimentares no nosso modelo subcutâneo que aponta para o facto de que as alterações fenotípicas encontrados no modelo de CVC pode ser reproduzida no modelo subcutâneo 15.
Em comparação com outros modelos existentes, ie., CVC modelo ou dentadura modelo estomatite 8,9,11, o modelo subcutânea permite acompanhar o desenvolvimento do biofilme em várias partes do cateter obtidos a partir de um animal, reduzindo assim o número de animais necessários para estudos de biofilme. Apesar destas vantagens, uma deficiência pode ser a falta de fluxo de sangue que pode conduzir a certos privação de nutrientes no biofilme. Portanto, em termos de fontes de nutrientes e condições ambientais, o modelo subcutânea está mais relacionado com as infecções associadas aos dispositivos desenvolvidos em próteses articulares, próteses de voz e marca-passos do que os formados em cateteres intravenosos. Ainda mais importante,traduzindo o rato sistema biofilme subcutânea a ratinhos feitas neste modelo animal compatível com BLI, o que reduz ainda mais os custos e o mais importante, o número de animais necessários. Além disso, a tradução do modelo de rato para ratos permite a utilização de modelos de camundongos transgênicos para estudar os fatores do hospedeiro relevantes para estudos de infecções associadas ao uso de cateter.
A principal vantagem da utilização de BLI para quantificar biofilmes em animais vivos reside não só no carácter não invasivo do presente método, mas também na sua capacidade para fornecer informação dinâmica sobre o desenvolvimento de uma infecção. Neste estudo, glic expresso na parede celular de C. albicans permitiu uma melhor acessibilidade e interação direta com o celenterazina substrato, que são cruciais para a detecção do sinal bioluminescente in vivo. No estudo de Vande Velde et al. 18, fomos capazes de seguir o sinal bioluminescente de C. albicans biofilmes desenvolvido em FOREIcorpos gn in vitro. A intensidade do sinal correspondia BLI fortemente com os dados obtidos a partir de técnicas de quantificação de biofilme adicional, isto é, determinação das UFC e redução de ensaio de XTT. A seguir a estes resultados, nós mostramos que o sinal bioluminescente de in vivo biofilmes estava de acordo com a quantidade de células-associado biofilme recuperados de biofilmes explante. Além disso, Vande Velde et al. 18 BLI demonstrado que pode ser utilizado para seguir o desenvolvimento do biofilme por um tipo selvagem e também por C. albicans bcr1Δ / bcr1Δ (biofilme estirpe deficiente) no mesmo animal, ao mesmo tempo. Tais resultados suportam fortemente o uso de BLI durante os estudos dedicados a avaliar a evolução temporal do desenvolvimento de biofilme e infecção no mesmo animal.
Com isso, nós descrevemos um procedimento experimental para in vivo implante subcutâneo de dispositivos Candida infectado com o monitoramento com subsequentef in vivo desenvolvimento de biofilme pela BLI. Tomados em conjunto, BLI mostrou ser uma técnica confiável, o que nos permitiu seguir uma infecção ao longo do tempo evitando o sacrifício de animais em cada momento de análise de dados.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
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