Abstract
Biyotik ve / veya abiyotik yüzeylerde Candida albicans biyofilm gelişimi yatan hastalar için özel bir tehdit oluşturmaktadır. Şimdiye kadar, C albicans biyofilm in vitro ağırlıklı incelenmiştir, ancak, in vivo koşullar altında bu dinamik işlemin daha iyi anlaşılması için önemli bir ihtiyaç vardır. Biz C çalışma bir in vivo deri altı sıçan modeli geliştirdi albicans biyofilm oluşumu. Bizim modelde, (9'a kadar) birden Candida enfekte olan cihazlar hayvanın arka kısmına implante edilir. Bize bir hayvanda birçok bağımsız biyofilm çalışma sağlar gibi bu santral venöz kateter modeli sistemi üzerinden bize büyük bir avantaj sağlıyor. Son zamanlarda, biz C incelemek için bu modeli adapte BALB / c farelerine albicans biyofilm gelişimi. Bu modelde, C olgun albicans biyofilm 48 saat içinde geliştirmek ve tipik üç-boyutlu biyofilm mimarisi göstermektedir. mantar biyofilm ölçümügeleneksel analiz otopsi ve ev sahibi fedakarlık gerektirir. Bu kinetik çalışmalar yapmak birçok hayvan kullanımını gerektirdiğinden, biz uzunlamasına olgun in vivo takip C'ye non-invaziv biyoluminesans görüntüleme (BLI) uygulanan albicans, bizim deri altı modeli gelişmekte biyofilm. C albicans hücreleri hücre duvarına bağlı Gaussia princeps lusiferaz geni (glukozit) ifade etmek için tasarlanmış edildi. biyoışıldama sinyali ölçülebilir ışık ilave edilmiş substrat koelenterazin dönüştürür lusiferaz tarafından üretilir. BLI sinyal Eksplante kateter elde edilen hücre sayımları benziyordu. In vivo biyofilm oluşumu ölçülmesi için Non-invaziv görüntüleme daha iyi anlamak için, burada katkı yanı sıra konak-patojen etkileşimleri dayalı çalışmalar için in vivo koşullarda tarama ve antifungal ilaçların doğrulama için acil uygulamalar sağlarKateter ilişkili enfeksiyonların patogenezi ing.
Introduction
Candida albicans, deri üzerinde ya da gastrointestinal ve vajinal florasının bir parçası olarak, örneğin, sağlıklı bireylerin farklı yerlerde bulunan bir ortakçı bir organizmadır. Bununla birlikte, içinde yatan ve özellikle immünokompromize hastalar, bu enfeksiyonların 1 geniş bir neden olabilir. Bu tür kişilerde, bağışıklık sisteminin zayıflamasına Candida hücreleri kan dolaşımına yaymak ve yaşamı tehdit eden enfeksiyonlara neden olan derin dokuları istila sağlar. Buna ek olarak, örneğin merkezi venöz ve idrar sondaları gibi abiyotik alt-tabakaların mevcudiyeti, suni kalp kapakçıkları ve eklemler, Candida ek 2 için bir niş sağlayabilir. Bu tür substratlara yapışma esas polisakaritlerin 2 oluşan hücre dışı bir polimerik malzeme içinde gömülü maya ve hifal hücre katmanı temsil daha biyofilm gelişimi için bir ön koşuldur. C albicans kateter enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde enfeksiyonlaryüksek mortalite ile ilişkilidir. Biyofilm genel karakteristiği gibi azollerin 3,4 olarak bilinen antifungal, onların azalmış duyarlılık olduğunu. Bu tür ekinokandinler ve amfoterisin B lipozom formülasyonu olarak antifungal ilaçların yalnızca yeni sınıflar, kateter ilişkili enfeksiyonların 5-7 karşı aktif olduğunu kanıtladı. Için anti-fungal maddeler ile biyofilm esneklik terapötik yaklaşımlar çok sık kateter çıkarılması ve tek çözüm olarak daha sonraki değiştirilmesine yol açacak şekilde sınırlıdır.
C bizim mevcut anlayış çoğu albicans biyofilm geliştirme, yukarıda belirtilen aygıtlar, örneğin, silikon, poliüretan, 2 imalatında kullanılan abiyotik polistiren gibi substratları ya da plastik üzerinde in vitro çalışmalar kaynaklanır. Bu modeller oldukça gelişmiş ve mümkün olduğunca yakından in vivo durumu taklit deneyin. Bununla birlikte, bu sistemler, sürekli bir kan akışı ve t içermeyenO konağın bağışıklık sistemi. Bu tür santral venöz kateter (SVK) modeli 8-10, oral kandidiyazis 11 protez stomatit modeli ve kateter ilişkili kandidüri 12 için bir fare modelinde olarak in vivo model sistemlerinde, geliştirme sonuçlandı. Buna ek olarak, C albicans biyofilm gelişimi vajina 13 ve ağız 14 gibi mukozal yüzeyler üzerinde in vivo incelenmiştir. Laboratuvarımız deri altı C kurulması ile katkıda Sprague Dawley sıçanların 15 arkasındaki enfekte kateter adet implant dayanmaktadır albicans biyofilm modeli. Bu model başarılı diklofenak ve Kaspofungin 17 kombinasyon tedavisinin etkisini incelemek için, uyuşturucu 5,16 Flukonazole biyofilm duyarlılığı test etmek ve ekinokandin bizim laboratuvarda kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, BALB / c farelerinde 18,19 kullanmak için bu uyum sağlamıştır. Içindein vivo modellerde diğer ile karşılaştırılması, bu deri altı modelin ana avantajı implante kateter adet lümen içinde geliştirilen hayvan başına birden fazla biyofilm çalışma imkanı vardır.
Deney hayvanlarının sayısını azaltmak için, biz C gelişimini incelemek için bu modeli adapte olması albicans biyoışıldama görüntüleme (BLI) 18,19 kullanılarak non-invaziv biyofilm. Bu yöntem, hayvan kurban kaçınarak, (bu durumda implant kateterlerin bölge) ilgi bölgesi spesifik BLI bir işaret ölçülerek biyofilm ölçmek için kullanılabilecek etkili bir teknik olduğunu kanıtladı. C de dahil olmak üzere bağlı bir özel lux operon'u 20 giriş geni ve biyoışıldama reaksiyon için gerekli olan alt-tabakanın her iki ifade bakterilerin göre, içinde, en ökaryotik organizmalar, albicans, ile birlikte bir lusiferaz geninin heterolog ekspresyonu bağlıdırD-luciferase veya koelenterazin 21 gibi belirli bir substrat, dış yönetim. Muhtemelen, fungal hücre duvarı ve C varlığına albicans morfonogenezi, lusiferaz enzim için substrat hücre içi teslimat ana zorluk 21 oldu. Bu sorunu çözmek için, Enjalbert ve ark. 22, bir yük tasarlanmış burada sentetik C doğal salgılanan Gaussia princeps lusiferaz için bir gen (glukozit) albicans kodon-optimize edilmiş türden C ile kaynaştırılır albicans PGA59 geni, bir GPI- hücre duvarı protein demirli. Çünkü hücre duvarındaki lusiferaz varlığı, substrat hücre içi temin edilebilirliğine ilişkin sorunlar önlenebilir. Bu özel sistem C'nin neden olduğu yüzeysel enfeksiyonları incelemek için kullanılan albicans 22. Çok yakın, BLI da orofaringeal kandidiyazis ve possibl ilerlemesini izlemek için kullanılmıştıre tedavisi 23. Bu bulgular serbest yaşayan hücreler aynı zamanda cihazın ilişkili enfeksiyonların yol açtığı enfeksiyonları incelemek için umut verici bir yöntem olarak BLI kullanımını desteklemektedir.
Bu çalışmada, C tarif BL kullanılan poliüretan kateter, BALB / c farelerinde parçaları ve nicelenmesine albicans biyofilm gelişimi. Biz canlı hayvan farelerde implantasyon ve sonraki biyofilm gelişimi takip yapışma döneminde poliüretan kateter in vitro kolonizasyonu ayrıntılı bir protokol sağlar. Apart C. tarafından yayılan BLI sinyalini ölçerek gelen albicans hücreleri, biz de biyofilm mantar yük ölçümü için standart tekniği ile karşılaştırma için birimleri oluşturan koloni belirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hayvan deneyleri KU Leuven (proje numarası 090/2013) etik komitesi tarafından onaylanmıştır. KÜ Leuven hayvan bakım talimatlarına uygun olarak hayvanları koruyun.
1. C. albicans Büyüme
- Yirmi dört saat hayvan deneyinde başlatılmasından önce, maya özü, Taneli 10 g, bakteriyolojik pepton 20 g ve granüle agar 15 g ekleyerek YPD plakaları hazırlamak. Milli-Q su ve otoklav ile 900 ml sesini olun.
- Steril% 40 glikoz, 50 ml ilave edilir. İyice karıştırın ve Petri kutularına dökün. Soğumaya ve katılaşmaya agar bırakın.
NOT: Bu çalışmada, iki suşları, yani vahşi tip C kullanın albicans SC5314 - glukozit negatif (WT olarak anılacaktır) soyu ve C. Bir vahşi tip C olan albicans SKCA23 suşu SKCA23- bir adında suşu (.in Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmid 22 ile transforme albicans SC5314CTgLuc) glukozit (bu promotör mantar büyümesinin yanısıra hipal aşaması, maya aktif) ACT1 (aktin) promoterinin kontrolü altında endojen PGA59 geni ile kaynaştırılır. Bu suş Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belçika laboratuvar talep edilebilir. Plazmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 plazmid 22 nazik Prof. C. d'Enfert, Pasteur Enstitüsü'nde, Paris, Fransa tarafından bağışlanmıştır. - -80 ° C'de gliserol stoku ve deposunda hem suşları koruyun.
- Bir YPD plaka üzerine herhangi bir deney çizgi suşları önce. Gece boyunca 37 ° C'de plaka inkübe edin.
2. Kateter adet Hazırlık
- Deneyden önce, gerekli olan kaç kateterler belirler. Bu fare başına 6 adet kateter (solda 3 kateterler ve hayvan (Şekil 2A'da sağ tarafında 3 kateter) kadar implant mümkündür.
- Yirmi dört saat hayvan cerrahisi öncesinde, paketi açmakbiyolojik güvenlik kabini altında üçlü lümen kateter içeren yaşı. Steril bir bisturi ile kateter bağlı kısmını steril bir cımbız ile tüm gereksiz parçalar çıkarın ve kesti. Plastik paketi altında cetvel yerleştirin ve cetvel üzerinde ölçek (Şekil 1) 'e göre tam 1 cm poliüretan kateter parçaları kesti.
NOT: Bu kateter parçasının bu tip fosforlu ve BL 18,19 nedenle uygun olmadığını belirtmek önemlidir. - 2 ml mikrosantrifüj tüpler içine 15 kesilmiş kateter parçaları (adım. 2.2) maksimum yerleştirin. Daima yapışma süre sonra cihaz üzerinde takılı Candida hücrelerinin miktarını numaralandırmak için kullanılan ekstra 3 adet, hazırlamak.
- Yaklaşık 1.8 ml% 100 fetal sığır serumu (FBS) eklenmiştir ile kateterler Ek.
- Şiddetle vorteks ve% 100 FBS ek 100-200 ul ekleyin. Tamamen serum Tüm kateter parçaları kapsamaktadır.
- Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
3. Hayvanlar ve Bağışıklık Sistemi Bastırma
- Standart gıda ve su ad libitum ücretsiz erişim ile bireysel havalandırılan filtre üst kafeslerde dişi BALB / c fareleri (yaş yaklaşık 8 hafta) tutun.
- Hayvanların içme suyuna deksametazon (0.4 mg / L) ilave edilerek, hayvan cerrahi öncesi bağışıklık sistemi 24 saat bastırılmasını başlatın. Ev sahibi herhangi bir bakteri kirlenmesini önlemek amacıyla, bir antibiyotik ile içme suyu ilave, örneğin, ampisilin, sodyum tozu (0.5 gr / L).
- (6 güne kadar) tüm deney sırasında hayvanların bağışıklık tutun.
4. ex vivo C. albicans Yapışma FBS kaplı Poliüretan Yüzeyler
- Taze 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine her serum kaplı kateter parçası aktarın.
- Bazı C. kazıyarak albicans hücreleri YPD kapları (Aşama 1) üzerinde büyütüldü ve PBS, 1 ml askıya.
- Seyreltik CanAyrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde: ggmmok hücreleri (100 1). Seyreltilmiş örnek 10 ul alın ve bir hücre sayımı odasının üzerine uygulayın. En az 16 küçük kareler sayın.
- 5 x 10 4 hücre / ml 'lik bir nihai konsantrasyona RPMI 1640 ortamı Candida hücreleri (her biri ayrı ayrı suş) hazırlayın.
- Her serum kaplı kateter birim hücre süspansiyonu 1 ml ilave edilir.
- Şiddetle girdap ve kateterler, ortam içine ve üstünde yüzen değildir emin olun.
- 90 dakika için 37 ° C (yapışma süresi) en kateterler inkübe edin.
- Steril cımbız ile kateterler çıkarın ve PBS 1 ml ile iki kez yıkayın. Bu adım sırasında yıkama sıvısı çok nazikçe kateter yıkama sırasında dikey konumda kateter tutarak lümen yoluyla gider emin olun. Önemli bir şekilde, birleşmiş hücrelerin çıkarılması yol açabilir güçlü bir akış kullanmayın.
- Tu başına temiz bir mikrosantrfuj tübü (tek parça her yıkandı, kateter aktarma) olmak.
- Buz üzerinde yerleştirin ve ameliyat kadar orada tutun.
5. Anestezi
- Medetomidin, 100 ul (1 mg / ml) ve steril tuzlu su içinde 825 ul ketamin 75 ul (100 mg / ml) ile karıştırmak suretiyle anestezi hazırlayın. 45-60 mg / kg ketamin ve 0.6-0.8 mg / kg medetomidin dozunda elde edilen 10 g vücut ağırlığı başına anestetik kokteyli intraperitonal (ip), 60-80 ul uygulayın.
- Anestezi ters için, 0.5 mg / kg'lık bir dozda elde edilen, panzehir olarak IP uygulanması, 4.95 mi tuzlu su içinde 10 g vücut ağırlığı başına 100 ul 50 ul atipamezol (5 mg / ml) seyreltin.
- Anestezi enjeksiyonundan sonra, ayrı bir kafes içine hayvan koyun ve tamamen uykuda kadar bekleyin.
- Açık ten tutam ve cilde herhangi bir zarar vermez ayak tutam, hayvansal uygun anesthetization onaylayın. Gözlemlenen hareket hayvan yeterli ameliyat için anestezi olduğunu gösterir. Bu durumda, bir cou bekleyinuzun hayvanın kadar dakika ple deri veya ayak tutam üzerine hareket herhangi bir belirti göstermez.
6. Hayvan Cerrahisi
- Aktarım ısıtma pedi üzerine yerleştirilmiş temiz bir doku üzerine kafes hayvan anestetize, 37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış (Şekil 2A, (1)).
NOT: Daha ucuz bir alternatif elektrikle ısıtılan battaniye kullanmaktır. Hayvan ameliyat öncesinde mikrodalga fırında ısıtılan gereken izotermik yastıkları, kullanmak da mümkündür. - Gözleri oftalmik merhem sürün.
- Elektrikli ustura ile hayvanın alt arka Tıraş. Tüm hayvan tüyleri ve temiz bir dokusu üzerinde hayvan aktarın. (% 1 iyot izopropanol ya da% 70 alkol içinde% 0.5 klorheksidin ile, örneğin), cilt dezenfekte ve yaklaşık olarak 1 dakika boyunca kurumaya dezenfekte bölgeyi terk (Şekil 2A (2)).
- (Deride yaklaşık 0.5 (hayvanın sağ tarafında solda) diğeri küçük bir kesi yapmak ve# 8211; 1 cm) (Şekil 2A, (3)).
- İki deri altı tünelleri oluşturmak için bir makas ile subcutis ayır. Her bir tünel yaklaşık 1.5 cm uzunluğunda ve 1 cm genişliğinde olacaktır.
- Her tünelde, daha önce Candida ile enfekte üç kateter parçaları, yerleştirin. Kateterler yatay düzende birbirine yalan emin olun ve toplam altı kateter parçalarının implantasyonu sağlamak için birbirlerine kapatmayın ki (Şekil 2A (4)).
- Sütür ile kesiler kapatın. Alternatif olarak, yarayı kapatmak için Dermabond kullanın.
- % 70 alkol veya iyot izopropanol (% 1) ile çok yavaşça% 0.5 klorheksidin ile yarayı dezenfekte edin.
- Doğrudan yaranın üzerine lokal anestezi (xylocaine jel,% 2) uygulayın.
- Anestezi tersine (protokolünü 5, adım 2) yönetme: intraperitoneal 100 ul 10 başına g vücut ağırlığı.
- Temiz bir kafes transfer hayvan, daha önce bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirilmiştir. Hayvan tutunAyrı ve sıcak hayvan tamamen uyanık kadar. Bu arada, bir sonraki hayvanın operasyon ve implant ile devam ediyor. Bir kez tüm çalışan hayvanlar tamamen uyanık. Bir kafese transfer. Düzenli hayvanları izleyin.
7. Biyoparlaklık Görüntüleme: coelenterazine (CTZ) hazırlanması G. için, Yüzey princeps lusiferaz
- Asidifiye etanol içinde 5 mg / ml CTZ çözülmesi ya da imalatçının talimatlarına göre taze coelenterazine (CTZ) stok çözelti hazırlayın.
- Steril PBS içinde stok çözelti 1:10 seyreltilmesiyle 1.2 mM'lik çalışma çözeltisi hazırlayın.
NOT: kateterleri çevredeki 100 ul CTZ çalışma çözümleri deri altına enjekte edilir. CTZ ve deri altına enjeksiyon için, insülin şırınga kullanın. - Her zaman karanlıkta CTZ tutmak (örneğin, alüminyum folyo ile CTZ içeren mikrosantrifüj tüpler kapak). Deneyler süresince -80 ° C'de stok solüsyonu saklayın. 8. Biyoparlaklık Görüntüleme
- BLI Fotoğraf makinesini sıfırlayın.
- Bir indüksiyon kutusunu kullanarak hayvanları uyutmak. % 2-3, oksijen N2 O / O 2, veya hava izofluran bir gaz karışımı kullanın.
- Indüksiyon sonrası, indüksiyon kutusunda ve% 1.5-2 olarak görüntüleme odasında anestezi korumak.
- Görüntüleme oturumu başlamadan önce, 10 cm FOV karşılık A konumunda görüntüleme plaka, yerleştirin. Emin olun kutusuna bir uyku hayvan koyarak anestezi çıkışları ve hayvanın doğru pozisyonda olduğunu.
- Hayvan hakkı kamera altında FOV içinde, istenen görüntüleme konuma gelene kadar birkaç fotoğraf çekin.
- İnsülin şırınga CTZ hazır çözelti, her biri 100 ul hazırlayın.
- Bankta bir hayvan koyun ve gaz anestezi sağlayan bir burun konisi vasıtasıyla uykuda tutmak.
- Kateterler deri çevreleyen bir yerde şırınga iğneleri getirin ve enjekteCTZ aynı anda kateter üstüne.
- Enjeksiyondan hemen sonra, kamera kutusu sıcak plaka üzerinde hayvan koyun ve biyoışıldama görüntü alımı başlatabilirsiniz.
- 20 maksimum sinyal yoğunluğu ulaşana kadar 60 saniye (sinyal yoğunluğuna bağlı olarak) arasında değişen satın alma süreleri ile ardışık taramaları Edinme. Bir sonraki karenin alımı sırasında, bu ROI ile foton akı her kateterler üçlü üzerinde bir yatırım getirisi yerleştirerek ve ölçerek, daha önce edinilmiş kare BLI sinyal yoğunluğunu ölçmek.
- Bir sonraki hayvanın (ler) için 7. adımdan tekrarlayın.
- Görüntüleme sonra, kendi kafesine hayvanları dönün. Biyofilm oluşumu uzunlamasına, non-invaziv takip için bir deney sırasında BLI tekrarlayın.
- Yaşam Görüntü yazılımı kullanılarak BLI verileri analiz. Her kateter üçlüsü üzerinde sabit boyutta bir dikdörtgen ROI ve her ROI ile foton akı (parlaklık) ölçün. Her hayvan için bu işlemi tekrarlayın.
- RaporSaniyede foton akı olarak her kateter üçlüsü BLI sinyal yoğunluğu. Ortalama ve her grup için saniyede foton akı SD çizerek logaritmik ölçekte BLI verileri temsil. Günlük 10 dönüştürülmüş veriler üzerinde istatistiksel analiz.
- Her kateter cihaz için PBS, biri 1 ml içeren mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
- Servikal dislokasyon ile hayvanlar öldürülür (Şekil 2B, (1)).
- % 70 alkol içinde ya da iyot izopropanol (% 1) ile% 0.5 klorheksidin ile sırtın deri dezenfekte.
- Kateter üzerinde bir kesi (yaklaşık 3 cm) yapın.
- Deri altı doku kesin ve steril cımbız kullanarak deri altı doku altına birer kateter fragmanlarını birini kaldırmak (Şekil 2B, (2)).
- Dikey konumda yavaşça kateter işlemek ve steril 1 ml PBS ile iki kez yıkanır. Her kateter yerleştirinAyrı bir mikrosantrifüj tüpü içine bir parça (Kademe 1 de elde edilmiş).
- Sonikasyon kateterler, daha önce bir su banyo sonikatörü içinde 40,000 Hz 10 dakika için 1 ml PBS içine yerleştirilir ve buz üzerine yerleştirin.
- Sonikasyonun sonra, şiddetle buz üzerinde tekrar 30 sn ve yer girdap.
- PBS 900 ul ihtiva eden iki ek mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın.
- Orijinal numunenin (kateter içeren bir) 100 dilüsyonları ve buz üzerinde tüm mikrosantrifüj tüpleri tutmak: 01:10 ve 1 yapın.
- Plaka, orijinal numune, 100 ul, 1:10 ve 1: iki kez YPD agar plakaları üzerinde 100 seyreltme.
- 37 ° C'de 2 gün süreyle inkübe edin ve CFU sayısı.
- YPD agar plakaları üzerinde büyüyen kolonilerin (kolonilerin sayılabilir miktarda, maksimum 300 koloni / plaka) Sayım ve uygun Dilu bunları çarpınyon faktörü (1x-orijinal, 10x veya 100x seyreltme). Ayrıca kateter içeren 1 ml tüp kolonilerin son miktarına tekabül 10x her kateter parça, çarpın. 10 hücre / standart sapma (SD) kateter parçası oturum kolonilerin son miktarda getirin. SD ± olarak veri Express.
- Yukarıda belirtilen hesaplamalar ve istatistiksel analizler gerçekleştirmek için, bir elektronik tablo ve / veya istatistik programına her kateter ve belirli bir grup için tüm değerleri yerleştirin. Karşılaştırmak için özel gruplar belirtiniz, yani WT vs mutant ya da 2 gün vs. 6 gün biyofilm oluşumu ve log10-dönüştürülmüş veriler Tukey post-testi ile bağımsız gruplar t-testi ve ANOVA gerçekleştirin.
- Bir p değerine göre anlamlılık düzeyini ifade eder. Olarak temsil p değeri <0.05, şu, bu çalışmada önemi gösterir: * p <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005.
9. Kateter Eksplantasyon
Koloni Oluşturma Birimleri Kont (CFU) ve Sonuçlar İstatistiksel Analizler tarafından 10. Niceliklendirilmesi Biyofilm ilişkili Hücreler
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, bir farede in vivo olarak, C. albicans biyofilm gelişimi sırasında kateterin implant ve eksplant cerrahi bir işlemi göstermektedir. Ayrıca, klasik CFU numaralandırma tarafından değil, aynı zamanda BLI tarafından değil, sadece olgun biyofilm miktarının görüntüler.
Şekil 1A'da gösterildiği gibi, olmayan fosforlu poliüretan kateter adet 1 sm cihazları halinde kesilir ve daha sonra serum ile kaplandı. Candida hücreleri olmayan serum kaplı implantlar 15 ile karşılaştırıldığında daha hızlı yüzeye eklemek için izin verir, çünkü bu adım çok önemlidir. Herhangi C'ye o önce söz önemlidir albicans deneyi ilk bizim cihazların 18 arka plan lüminesans belgelenmiştir. Cihazın yüksek fosforesans gLuc- belirli biyoluminesan sinyal yoğunluğu ve sinyal kinetik değerlendirilmesi ile müdahale edecek, çünkü bu adım, herhangi BLI yapmadan önce önemlidirifade eden hücrelerin. Daha sonra, C albicans hücreleri, serum kaplı kateter parçaları ile inkübe edilir. Kateter parçaları daha sonra deri altından insizyon (Şekil 2A) sonra hayvanın arka kısmında yerleştirilir. Bu kurmak in vivo, iki kesiler her kesi içinde deri altı tünelleri oluşumu takip (sağ ve bir fare arka sol tarafında başka bir teke tek) yapılmaktadır (Şekil 2A (3)). Daha sonra, önceden Candida hücreleri ile enfekte üç cihazlar, her işlem site içinde implante (Şekil 2A (3 ve 4)) vardır. Bu kurmak bize hayvan başına altı biyofilm kadar çalışma sağlar. Bu iki operasyon bölgesi aynıdır hayvanda, örneğin, vahşi tip ve mutant için, ilgilenilen iki farklı suşları biyofilm oluşumunu çalışmak için bir olasılık sağlamaktır dikkat çekicidir. Şekil 2B Cihazın çıkarılması ve sonraki yıkama aşamasından önce, kateterler yara gösterir.Hayvanın arka kısmında içinde geliştirilen Biyofilmler biyoışıldama sinyal ölçümleri değerlendirildi. Çevrede bölge (ROI) karakterize dikdörtgenler ile birlikte biyoışıldama sinyalini gösteren temsili hayvanlardan biri, Şekil 3 'de gösterilmiştir. Son BLI zaman noktasından sonra, kateterler, eksplante sonikasyona tabi tutulur ve daha sonra vortekslendi ve daha biyofilm oluşturan hücreler için değerlendirilir CFU ile ölçümü. Biyofilm geliştirilmesi ve eksplantasyonu Şekil 4A'da gösterilen sonra verileri, her bir kateter birim elde Giriş 10 CFU gösteren analizleri. Bunun yanında, CFU BLI sinyal yoğunluğu ile karşılaştırılmış ve bu veriler Şekil 4B'de gösterilmektedir. Doksan dakika implantasyon sonrası berrak BLI sinyal, doğal tipte suşlarda, neredeyse hiç ışık üretilir ise ACTgLuc biyofilm -expressing ile üretilir; ACTgLuc -expressing bulgulanan ışık şiddetibiyofilm aynı farenin (Şekil 4C), aşağıdaki, burada oluşturulduğu gibi biyofilm önemli ölçüde artmaktadır. Işığında bu artış, biyofilm (Şekil 4A) başına CFU artış ile aynı eğilimi takip eder. Deneylerde da (değil lusiferazı eksprese etmek üzere), normal doğal tipte suş, aynı zamanda alt-tabakanın eklenmesi üzerine ışık üretimi ile sonuçlanır görülmektedir. Ancak, foton akı mühendislik suşu için elde daha düşüktü.
Birlikte ele alındığında, bizim veri BLI C izlemek ve ölçmek in vivo olgun güçlü bir teknik olduğunu göstermektedir Bir deri altı fare modelinde albicans biyofilm oluşumu.
Şekil 1: Poliüretan cihazların Hazırlama 1 cm'lik parçalar halinde kesilir, kateterin poliüretan parçası.. Plastik pocKateter paketten çıkarılır dışında ket içeren kateter, steril şartlarda ve tüm parçaları altında açıktır. İkincisi, plastik cebinde altında cetvel yerleştirin ve tam olarak 1 cm poliüretan parçalar kesilir. Bu tür cihazlar, daha sonra mikrosantrifüj tüpleri (en fazla 15 adet / tüp) dağıtılır ve 37 ° C'de gece boyunca inkübasyon ve ardından% 100 fetal sığır serumu içinde monte edilmiştir.
Şekil 2: hayvan cerrahisi sırasında önemli adımlar. (A) kateter implant Prosedürü. (1) Yer kağıt doku içeren bir sıcak pad üzerinde hayvan anestezi ve gözleri oftalmik merhem uygulayın. (2) sırt ve dezenfekte alt kısmını Tıraş. (3) solda ve arka sağ tarafındaki deri yoluyla iki küçük (yaklaşık. 0.5 cm) kesiler oluşturun. Her kesi içinde deri altı tünel oluşturun ve içine 3 kateterleri yerleştirin. (4) wo kapatın sıcak bir pad üzerinde sütür ve yer hayvanla und. kurtarmak kateter çıkarılması (B) Prosedür için. (1) Yer yastığı üzerinde hayvan kurban ve işletilen yan içeren kateter dezenfekte. Doğru kateter üzerinde yara kesin. (2) yavaşça her kateter dışarı atın ve PBS 1 ml ile iki kez yıkayın. Ayrı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
Şekil 3:. Biyoparlaklık sinyal ölçümü in vivo BLI görüntü bir temsili fare biyofilm gelişimi 6 gün sonra görüntülenmiş. Sinyal yoğunluğu ölçümü, her ROI ile saniyede foton akısı ölçülmesi ile takip kateter çevresinde (dikdörtgen) İlgi (ROI) bir bölge yerleştirerek gerçekleştirilir.
fig4highres.jpg "/>
Şekil 4: koloni oluşturan birim (CFU) tarafından ve BLI tarafından olgun Candida albicans biyofilm miktarının belirlenmesi. (A), in vivo C olgun albicans SKCA23- ACTgLuc ve SC5314 (WT) 90 dakika, 2 gün ve biyofilm gelişimi 6 gün sonra Log10 CFU tarafından biyofilm ölçümü. (B) SKCA23- ACTgLuc tarafından ve C tarafından oluşturulan in vivo biyofilm gelen Biyoparlaklık sinyal yoğunluğu ölçümü albicans WT. Sinyal 90 dakika boyunca (yapışma süresi), 2 gün ile biyofilm gelişme 6 gün sonra belirlendi. Bir kontrol olarak, non-kolonize kateter implante edildi ve deri altından CTZ enjekte edilmiştir fareler kullanıldı. Bu farelerde elde edilen foton akısı eden bir arka zemin sinyali (BG) ile sonuçlanır. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. Aşağıdaki gibi istatistiksel anlamlılık gösterilir: * p <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
konak bağışıklık sistemi in vitro modeller için hesap edemez biyofilm oluşumunda önemli bir faktör olarak mikrobiyal biyofilm adanmış çalışmalar için hayvan modellerinde, özellikle kemirgen modellerin kullanılması çok önemlidir. Bu çalışmada, oldukça basit bir deri altı C tarif Kolayca bir araştırma laboratuvarında kabul edilebilir ve güçlü teknik beceri gerektirmez albicans biyofilm fare modeli. Bu model, ilk olarak bir sıçanın 24 epidermidis biyofilm oluşumunu çalışmak için geliştirilmiştir.
Sunulan modelde, serum kaplı poliüretan kateterler yapışma süresi (90 dakika, 37 ° C) sırasında, Candida hücrelerinin ex vivo olarak maruz bırakılmıştır. Bu ilk in vitro adım nedeniyle biyofilm enfeksiyon sürecinin ilk aşamalarında bağışıklık sisteminin eksikliği bir sınırlayıcı faktör olarak düşünülebilir. Yapışma ve önce aşağıdakiKateter implant olmayan alet ilişkili hücreler ile yıkama ile ayrılmıştır. Yapışma bir süreden sonra yıkama adımı kaçınmak cihaz ile bağlantılı hücrelerin kontrol edilemeyen miktarda yaratabilir. Bu nedenle, biz yapıştırılır hücrelerden gelişimini başlatmak için, önce implant ve bu nedenle kateterler yıkamak öneririz. Bu ilk yapışma süresinden sonra, kateterler 15 lümen kateter yanında yayılmış yaklaşık 2,0-2,5 Log 10 CFU / cihaz içerir. Bu aşama sırasında, Candida alt-tabaka üzerine bağlandıkları tohum tüpü oluşturur.
Bağışıklık sistemi genellikle tehlikeye kime yatan hastalarda durumu benzemeye için, bizim deri altı model sistemde 15 sıçan bağışıklık sistemi baskılanmış. Bir sıçan bağışıklık sisteminin kısmi bozukluğu, cihaz implanta ve biyofilm gelişme süresi boyunca önce, alınan biyofilm oluşturan hücrelerin artan bir yeniden üretilebilirlik ile sonuçlandıaynı ana ve ek hayvanlardan elde edilen cihazlardan implante kateterler. Çünkü bu bulguların biz kateter implant öncesi ve biyofilm oluşumu döneminde fareler immunosuppress öneririz. Ancak, sonuçlar bağışıklığı yeterli farelerde değişkenlik de biyofilm ile konukçu bağışıklık sisteminin rolünü incelemek için uygun olan bu fare modeli sistemi yapan farelerde gözlenen, çok daha az karşılaştırıldığında olduğunu göstermektedir. Bizim asıl sıçan modelinde ve ayrıca farelere tercüme aynı modelde, C olgun albicans biyofilm 2 ve 6 gün 15,18,19 arasında benzer CFU miktarı ve biyofilm mimarisi gösterdiği 48 saat içinde gelişir.
derialtı biyofilm modeli başarıyla birkaç mutantlar 15 ile biyofilm gelişimini takip etmek için kullanıldı. Bu Nobile ve diğerleri tarafından daha önce gösterilmiştir. 25 o C albicans BCR1 Δ / Δ başarısız BCR1Santral venöz kateter (SVK) modelinde form biyofilm. Bu suş CVC modelinde bulunan fenotipik değişiklikler deri altı modelde 15 çoğaltılamaz olabilir aslında bizim deri altı modeli işaret ilkel biyofilm özelliklerini gösterdi.
Diğer mevcut modelleri ile karşılaştırıldığında yani., CVC model ya da protez stomatit modeli 8,9,11, deri altı modeli böylece biyofilm çalışmaları için ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltarak, bir hayvandan elde edilen çoklu kateter adet biyofilm gelişimini takip sağlar. Bu avantajlara rağmen, bir eksiklik biyofilm besinlerin belirli yoksunluk yol açabilir kan akışının olmaması olabilir. Bu nedenle, besin malzemeleri ve çevre koşullarına vadede, deri altı modeli intravenöz kateterler üzerinde oluşturulan olanlardan daha eklem protezleri, ses protezleri ve kalp pili üzerinde geliştirilen cihaz ilişkili enfeksiyonlara daha ilgili olduğunu. Daha da önemlisi,ayrıca en önemlisi maliyetleri azaltır ve BL, gerekli hayvan sayısı ile bu hayvan modeli uyumlu hale farelere sıçan deri altı biyofilm sistemini çeviri. Ayrıca, farelere sıçan modeli çeviri kateter ilişkili enfeksiyon çalışmalarıyla ilgili konak faktörleri incelemek için transgenik fare modellerinin kullanılmasını sağlar.
Canlı hayvanların biyofilm ölçmek için BLI kullanmanın başlıca avantajı, sadece bu yöntemin invazif olmayan karakter yatıyor, aynı zamanda, bir enfeksiyonun gelişmesine dinamik bilgi sağlama yeteneği. Bu çalışmada, glukozit C hücre duvarı ifade albicans. vivo bioluminescent sinyalinin bir tespiti için önemli olan substrat koelenterazin, daha iyi erişilebilirlik ve doğrudan etkileşim izin Vande Velde ve ark. 18 çalışmada, C den bioluminescent sinyal takip başardık albicans yabancı trade.It üzerinde geliştirilen biyofilmlerdein vitro gn organları. BLI sinyal yoğunluğu güçlü, yani ek biyofilm ölçüm teknikleri, CFU belirlenmesi ve XTT azaltma deneyi elde edilen veriler ile geldi. Bu sonuçlara yanında, biz in vivo biyofilm gelen bioluminescent sinyal Eksplante biyofilm kurtarıldı biyofilm ilişkili hücrelerin miktarı ile anlaşma olduğunu gösterdi. Buna ek olarak, Vande Velde ve ark. 18 BL C ile de, vahşi tip ile biyofilm gelişimi takip etmek için kullanılabilir olduğunu göstermiştir Aynı anda aynı hayvanda albicans bcr1Δ / bcr1Δ (biyofilm eksikliği suş). Bu bulgular kuvvetle aynı hayvanda biyofilm gelişimi ve enfeksiyon zaman sürecini değerlendiren adanmış çalışmaları sırasında BLI kullanımını desteklemektedir.
Bu vesile ile, biz sonraki izleme o ile Candida enfekte olan cihazların in vivo deri altı implant için bir deney prosedürü tarifBLI tarafından f in vivo biyofilm gelişimi. Birlikte ele alındığında, BLI bize veri analizleri her zaman noktasında hayvan kurbanlar kaçınarak zamanla bir enfeksiyon takip için izin, güvenilir bir teknik olduğu gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
