Abstract
Candida albicans biofilm utveckling biotiska och / eller abiotiska ytor utgör ett specifikt hot för inneliggande patienter. Hittills C. albicans biofilmer har studerats främst in vitro men det finns ett stort behov av bättre förståelse av denna dynamiska process under in vivo-förhållanden. Vi utvecklade en in vivo subkutan råttmodell för att studera C. albicans biofilm formation. I vår modell, multipel (upp till 9) Candida infekterade enheter implanteras i den bakre delen av djuret. Detta ger oss en stor fördel över central venkateter modellsystem eftersom det ger oss möjlighet att studera flera oberoende biofilmer i ett djur. Nyligen, vi anpassat denna modell för att studera C. albicans biofilm utveckling i BALB / c möss. I denna modell mogen C. albicans biofilmer utvecklas inom 48 timmar och demonstrera typiska tredimensionella biofilm arkitektur. Kvantifieringen av svamp biofilmär traditionellt analyseras efter slakt och kräver värd offer. Eftersom detta kräver användning av många djur att utföra kinetiska studier, tillämpade vi icke-invasiv mareld imaging (BLI) till längdled uppföljning in vivo mogna C. albicans Biofilmer utvecklas i vår subkutana modellen. C. albicans-celler utformas för att uttrycka den Gaussia princeps luciferasgenen (Gluc) fäst till cellväggen. Den bioluminescens-signal alstras genom luciferas som omvandlar den tillsatta substrat coelenterazin till ljus som kan mätas. Den BLI signalen liknade celltal erhållna från explanterade katetrar. Icke-invasiv avbildning för att kvantifiera in vivo biofilmbildning ger omedelbara tillämpningar för screening och validering av svampdödande läkemedel under in vivo förhållanden, samt för studier baserade på värd-patogen interaktioner, härmed bidra till en bättre förståelseing av patogenesen av kateterrelaterade infektioner.
Introduction
Candida albicans är en kommen organism, som finns på olika platser i friska individer, till exempel på huden eller som en del av mag och vaginalfloran. Men i sjukhus, och i synnerhet patienter med nedsatt immunförsvar, kan det orsaka ett brett spektrum av infektioner 1. I sådana individer, tillåter försvagat immunförsvar Candida celler att sprida i blodet och att invadera djupare vävnader orsakar livshotande infektioner. Dessutom närvaron av abiotiska substrat såsom centrala venösa och urinkatetrar, kan konstgjorda hjärtklaffar och leder ger en nisch för Candida fäste 2. Adhesion till sådana substrat är en förutsättning för fortsatt biofilm utveckling, vilket motsvarar ett lager av jäst och hyfernas celler inbäddade i extracellulärt polymermaterial, som huvudsakligen består av polysackarider 2. C. albicans kateter -associated infektionerär förknippade med hög dödlighet. En allmän egenskap hos biofilmer är deras minskad känslighet för kända antimykotika, såsom azoler 3,4. Endast nyare klasser av svampdödande läkemedel, såsom echinocandiner och liposomberedning av amfotericin B visade sig vara aktiva mot kateterrelaterade infektioner 5-7. På grund av biofilm motståndskraft mot svampmedel, är terapeutiska metoder väldigt begränsad, vilket ofta leder till kateterborttagning och dess senare ersättning som en enda lösning.
De flesta av våra nuvarande förståelse av C. albicans biofilm utveckling härstammar från in vitro-studier på abiotiska substrat såsom polystyren, eller plast som används för tillverkning av ovan nämnda enheter, det vill säga, silikon, polyuretan 2. Dessa modeller är ganska avancerad och försöka efterlikna in vivo-situationen så nära som möjligt. Men dessa system inte innebära kontinuerliga blodflödet och tHan immunsystemet hos värden. Detta resulterade i utvecklingen av in vivo modellsystem, såsom central venkateter (CVC) modell 8-10, den stomatit modell av oral candidiasis 11 protes och en musmodell för kateterassocierade candiduri 12. Dessutom C. albicans biofilm utveckling studerades in vivo på slemhinnor, såsom de från slidan 13 och munhålan 14. Vårt laboratorium bidrog med inrättandet av en subkutan C. albicans biofilm modell, som bygger på implantatet av infekterade kateter bitar på baksidan av Sprague Dawley 15. Denna modell med framgång använts i vårt laboratorium för att testa biofilms känslighet för flukonazol och echinocandin droger 5,16, för att studera effekten av kombiterapi av diklofenak och caspofungin 17. På senare tid, anpassade vi detta system för användning i BALB / c möss 18,19. Ijämförelse med andra in vivo-modeller, är den största fördelen med denna subkutan modellen möjlighet att studera flera biofilmer per djur utvecklats inuti lumen implanterade kateterstycken.
För att minska antalet försöksdjur, har vi anpassat denna modell för att studera utvecklingen av C. albicans Biofilmer icke-invasivt med hjälp bioluminiscens imaging (BLI) 18,19. Denna metod visade sig vara en kraftfull teknik, som kan användas för att kvantifiera biofilmer genom att mäta den specifika BLI signalen vid regionen av intresse (i vårt fall området implanterade katetrar), undviker djuroffer. I jämförelse med bakterier, vilket kan uttrycka både genen och substratet krävs för mareld reaktion på grund av införandet av en särskild lux operon 20, de flesta av de eukaryota organismer, inklusive C. albicans, är beroende av det heterologa uttrycket av en luciferasgen kopplad medextern administration av ett specifikt substrat, såsom D-luciferin eller coelenterazine 21. Förmodligen på grund av närvaron av svampens cellvägg och C. albicans morfogenes, den intracellulär tillförsel av substratet för luciferasenzymet var en största utmaningen 21. För att lösa detta problem, Enjalbert et al. 22 engineered en stam där en syntetisk C. albicans kodon-optimerad version av genen för den naturligt utsöndras Gaussia princeps luciferas (Gluc) fuserades till till C. albicans PGA59 gen, en GPI- förankrade cellväggsprotein. På grund av närvaron av luciferas vid cellväggen, kunde problemen med den intracellulära tillgängligheten av substratet undvikas. Just detta system användes för att studera ytliga infektioner orsakade av C. albicans 22. Helt nyligen, BLI användes också för att följa framskridandet av orofaryngeal candidiasis och dess possible behandling 23. Sådana fynd stödjer användningen av BLI som en lovande teknik för att studera infektioner orsakade av fritt levande celler utan också enhetsrelaterade infektioner.
I denna studie beskriver vi C. albicans biofilm utveckling på polyuretan kateter bitar i BALB / c möss och dess kvantifiering med hjälp BLI. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll av in vitro kolonisering av polyuretankatetrar under perioden av vidhäftning följt av implantation hos möss och efterföljande biofilm utveckling med levande djur. Förutom mätning BLI-signalen emitterad av C. albicans celler, också bestämma att vi kolonibildande enheter för jämförelse med standardteknik för biofilm svamp last kvantifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök godkändes av etiska kommittén i KU Leuven (projektnummer 090/2013). Behåll djur i enlighet med riktlinjerna för KU Leuven djurskötsel.
1. C. albicans Tillväxt
- Tjugofyra timmar innan initieringen av djurförsök, förbereda YPD-plattor genom att tillsätta 10 g jästextrakt granulerad, 20 g bakteriologisk pepton och 15 g granulerat agar. Späd volymen till 900 ml med Milli-Q-vatten och autoklav.
- Tillsätt 50 ml av steril 40% glukos. Blanda väl och häll i petriskålar. Lämna agarplattor svalna och stelna.
OBSERVERA: I denna studie använder två stammar, nämligen vild typ C. albicans SC5314 - Gluc negativ stam (kallat WT) och C. albicans SKCA23 stam, som är en vild typ C. albicans SC5314 transformerad med Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmid 22 .I denna stam (som heter SKCA23- ACTgLuc) gluk fuserades till den endogena PGA59 genen under kontroll av ÄRV1 (aktin) promotom (denna promotor är aktiv i jäst, liksom hyfal stadium svamptillväxt). Denna stam kan begäras från laboratoriet av professor Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgien. Plasmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmiden 22 var vänligt done av Prof. C. d'Enfert, Institut Pasteur, Paris, Frankrike. - Behåll båda stammarna i glycerol lager och förvara vid -80 ° C.
- Före någon experiment streak stammar på en YPD-platta. Inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
2. Kateter Pieces Framställning
- Före experimentet avgöra hur många katetrar behövs. Det är möjligt att implantera upp till 6 kateter bitar per mus (3 katetrar till vänster och 3 kateter på högra sidan av djuret (figur 2A).
- Tjugofyra h före djuret kirurgi, öppnar säckenålder innehåller trippellumenkateter under biologisk säkerhet skåp. Ta bort alla onödiga delar med sterila pincett och skär den del fäst katetern med en steril skalpell. Placera linjalen under plastpaketet och skär polyuretankateter bitar av exakt 1 cm enligt skalan på linjalen (Figur 1).
OBS: Det är viktigt att nämna att denna typ av kateter bit är inte fosforescerande och därför lämplig för bli 18,19. - Placera högst 15 skurna kateterstycken (steg. 2.2) i 2 ml mikrorör. Förbereda alltid 3 stycken extra, som används för att räkna antalet anslutna Candida celler på enheten efter den period av vidhäftning.
- Komplettera katetrar med ca 1,8 ml 100% fetalt bovint serum (FBS).
- Kraftfullt virvel och lägga till ytterligare 100-200 pl 100% FBS. Helt täcka alla kateter bitar med serum.
- Inkubera vid 37 ° C över natten.
3. Djur och bekämpande av immunförsvaret
- Håll BALB / c möss (ca 8 veckors ålder) i individuellt ventilerade filtertopp burar med fri tillgång till vanlig mat och vatten efter behag.
- Initiera suppression av immunsystemet 24 h före djur kirurgi genom tillsats dexametason (0,4 mg / L) till dricksvattnet för djur. För att undvika eventuell bakteriell kontaminering av värd, komplettera dricksvatten med antibiotikum, t.ex., ampicillin natrium pulver (0,5 g / L).
- Håll immunosuppression av djur under hela experimentet (upp till 6 dagar).
4. Ex vivo C. albicans Adhesion på FBS-belagda Polyuretan substrat
- Överför varje serum belagd kateter bit in i en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Skrapa bort lite C. albicans celler odlas på YPD-plattor (Steg 1) och stänga av dem i 1 ml PBS.
- Späd CanDida celler (1: 100) i en separat mikrocentrifugrör. Ta 10 | il av det utspädda provet och tillämpa den på en cellräkningskammare. Räkna med minst 16 små rutor.
- Förbered Candida-celler (varje stam för sig) i RPMI 1640-medium till en slutlig koncentration av 5 x 10 4 celler / ml.
- Tillsätt 1 ml cellsuspension till varje serum-belagda kateterstycke.
- Kraftfullt virvel och se till att katetrarna är nedsänkta i mediet och inte flyter ovanpå.
- Inkubera katetrar vid 37 ° C i 90 min (period vidhäftning).
- Avlägsna katetrar med sterila pincett och tvätta dem två gånger med 1 ml PBS. Under detta steg att säkerställa att tvättvätskan går genom hålrummet genom att hålla katetern i vertikal position medan mycket försiktigt spola katetrarna. Viktigt Använd inte ett starkt flöde som kan leda till avlägsnande av bifogade celler.
- Överför varje tvättad kateter till ett rent mikrocentrifugrör (ett stycke per tuvara).
- Placera på is och hålla där tills operationen.
5. Anestesi
- Förbered anestesi genom att blanda 75 | il av ketamin (100 mg / ml) med 100 | il av medetomidin (1 mg / ml) och 825 | il av steril saltlösning. Administrera intraperitonealt (ip) 60-80 pl av bedövningsmedel cocktail per 10 g kroppsvikt, vilket resulterar i en dos av 45 till 60 mg / kg ketamin och 0,6 till 0,8 mg / kg medetomidin.
- För återföring av anestesi, späd 50 pl atipamezol (5 mg / ml) i 4,95 ml saltlösning, administrera ip 100 l per 10 g kroppsvikt som motgift, vilket resulterar i en dos av 0,5 mg / kg.
- Efter injektion av anestesi, placera djuret i en separat bur och vänta tills den är helt sover.
- Bekräfta korrekt anesthetization av animaliska ljus hud nypa och tå nypa, som inte orsakar några skador på huden. Alla observerade rörelsen visar att djuret inte är tillräckligt sövd för att utföra operationen. Om detta händer, vänta ett papel minuter längre tills djuret inte visar några tecken på rörelse vid hud eller tå nypa.
6. Djur Kirurgi
- Överföring sövda djur från buren på en ren vävnad placerades på värmedyna, förvärmda till 37 ° C (Figur 2A, (1)).
OBS: Ett billigare alternativ är att använda eluppvärmda filtar. Det är även möjligt att använda isotermiska dynor, som måste värmas upp i mikrovågsugn innan djuret kirurgi. - Applicera oftalmologiska salva på ögonen.
- Raka nedre ryggen av djuret med en elektrisk rakapparat. Ta bort alla djurhår och överföra djur på en ren vävnad. Desinficera huden (t.ex. med 1% jod isopropanol eller 0,5% klorhexidin i 70% alkohol) och lämna desinficeras området torka i cirka 1 minut (Figur 2A, (2)).
- Gör ett litet snitt i huden (en på vänster och en på höger sida av djuret) (ca 0,5 &# 8211; 1 cm) (Figur 2A, (3)).
- Dissekera huden med en sax för att skapa två subkutana tunnlar. Varje tunnel ska vara ca 1,5 cm långa och 1 cm breda.
- Sätt tre kateterstycken, som tidigare infekterats med Candida, i varje tunnel. Säkerställ att katetrarna ligger bredvid varandra i ett horisontellt arrangemang, och att de inte täcker varandra för att möjliggöra implantering av sex kateterfragment i totalt (figur 2A, (4)).
- Stäng snitt med suturer. Alternativt kan du använda Dermabond att stänga såret.
- Desinficera såret mycket försiktigt med 0,5% klorhexidin i 70% alkohol eller med jod isopropanol (1%).
- Applicera lokalbedövning (xylokain gel, 2%) direkt på såret.
- Administrera återföring av anestesi (protokoll 5, steg 2): intraperitonealt 100 l per 10 g kroppsvikt.
- Överför djuret till en ren bur tidigare släppts ut på en värmeplatta. Hålla djuretseparat och varm tills djuret är helt vaken. Samtidigt fortsätter med driften och implantat av nästa djuret. När alla drivs djur är helt vaken. Överföring till en bur. Övervaka djur regelbundet.
7. Bioluminescens Imaging: Beredning av Coelenterazine (CTZ), substrat för G. princeps luciferas
- Bered färsk coelenterazin (CTZ) stamlösning genom upplösning av 5 mg / ml CTZ i surgjord etanol eller enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered 1,2 mM arbetslösning genom att späda stamlösningen 1:10 i steril PBS.
OBS: Injicera 100 l CTZ arbetslösningar subkutant i området kring katetrarna. Använd insulinsprutor för subkutan injektion av CTZ. - Förvara alltid CTZ i mörker (t.ex. täcka mikrocentrifugrör innehållande CTZ med aluminiumfolie). Förvara stamlösning vid -80 ° C under den tid experimenten. 8. Bioluminescence Imaging
- Initiera BLI kameran.
- Bedöva djuren med användning av en induktionslåda. Använd en gasblandning av isofluran i syre, N 2 O / O 2, eller luft vid 2-3%.
- Efter induktion, upprätthålla anestesi i induktions rutan och i bildbehandling kammaren vid 1,5-2%.
- Innan du startar bildsession, placera bildplattan i position A, vilket motsvarar en FOV på 10 cm. Se till att rätt läge för anestesi försäljningsställen och djur genom att placera en sovande djur i rutan.
- Ta några bilder tills djuret är i önskad bildläge, i FOV höger under kameran.
- Förbered två insulinsprutor vardera innehållande 100 mikroliter av CTZ arbetslösning.
- Placera ett djur på bänken och hålla den sovande medelst en noskon som tillhandahåller gas anestesi.
- Ta med nålar av sprutorna på en plats kring katetrar subkutant och injiceraden CTZ samtidigt ovanpå katetrarna.
- Omedelbart efter injektionen, placera djuret på den varma plattan i kameralådan och starta mareld bild förvärvet.
- Förvärva varandra följande svep med förvärvstider från 20 till 60 sek (beroende på signalstyrkan) tills maximal signalstyrkan är uppnådd. Under förvärvet av nästa ram, mäta BLI signalstyrkan av de tidigare förvärvade ramar genom att placera en ROI över varje katetrar trio och mäta fotonflödet genom denna ROI.
- Upprepa från steg 7 för nästa djuret (s).
- Efter avbildning, återgår djur till sin bur. Upprepa BLI under ett experiment för longitudinell, non-invasiv uppföljning av biofilmbildning.
- Analysera BLI data med hjälp av Living bildbehandlingsprogram. Placera en rektangulär ROI av fast storlek över varje kateter trio och mät fotonflödet (strålglans) genom varje ROI. Upprepa detta för varje djur.
- RapportBLI-signalstyrkan för varje kateter trio som fotonflödet per sekund. Föreställ The Bli data på en logaritmisk skala genom uppritning av medelvärde och SD för fotonflödet per sekund för varje grupp. Utför statistisk analys på log 10 transformerade data.
- Förbered mikrocentrifugrör innehållande 1 ml PBS, en för varje kateter enhet och hålla dem på is.
- Euthanize djuren genom cervikal dislokation (Figur 2B, (1)).
- Desinficera huden av ryggen med 0,5% klorhexidin i 70% alkohol eller med jod isopropanol (1%).
- Gör ett snitt (ca 3 cm) ovanför katetrar.
- Klipp subkutan vävnad och ta bort katetern fragmenten en efter en från under den subkutana vävnaden med sterila pincett (Figur 2B, (2)).
- Handtag kateter försiktigt i vertikalt läge och tvätta den två gånger med 1 ml steril PBS. Placera varje kateterbit in i ett separat mikrocentrifugrör (framställd i steg 1).
- Sonikera katetrar som tidigare placeras i 1 ml PBS i 10 min vid 40.000 Hz i ett vattenbad sonicator och placera dem på is.
- Efter ultraljudsbehandling, kraftigt virvel i 30 sekunder och plats igen på is.
- Förbered två ytterligare mikrocentrifugrör innehållande 900 l PBS.
- Gör 1:10 och 1: 100 späd från din ursprungliga urvalet (den som innehåller katetern) och hålla alla mikrocentrifugrör på is.
- Plate 100 | il av de ursprungliga proverna, 1:10 och 1: 100 spädningar på YPD agarplattor i två exemplar.
- Inkubera plattorna under 2 dagar vid 37 ° C och räkna CFU.
- Räkna kolonierna odlas på YPD agarplattor (uppräknelig mängd kolonier, max 300 kolonier / platta) och multiplicera dem med rätt dilufaktor (1x-original, 10x eller 100x utspädning). Multiplicera Vidare varje kateter bit 10x, vilket motsvarar det slutliga beloppet för kolonier i 1 ml rör innehållande katetern. Ta det slutliga beloppet för kolonier att logga 10 celler / kateter stycke med standardavvikelse (SD). Express data som ett medelvärde ± SD.
- Placera alla värden för varje kateter och specifik grupp i ett kalkylblad och / eller statistikprogram, för att utföra de ovan nämnda beräkningar och statistiska analyser. Ange specifika grupper att jämföra, det vill säga WT kontra mutant eller 2 dagar vs. 6 dagar biofilmbildning och utföra oparat t-test och ANOVA med Tukey efter provet på log10-transformerade data.
- Uttryck den signifikansnivå av ett p-värde. I denna studie indikerar signifikans om p-värde <0,05, företräddes av följande: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.
9. Kateter explantation
10. Kvantifiering av Biofilm-associerade celler av kolonibildande enheter Count (CFU) och Statistiska analyser av resultat
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie visar vi den kirurgiska proceduren av kateter implantatet och explantatet under in vivo-C. albicans biofilmutveckling i en mus. Dessutom visar vi kvantifieringen av mogna biofilmer inte bara av klassisk CFU uppräkning utan även av BLI.
Som visas i figur 1A, var icke-fosforescerande polyuretankateterstycken skurna i 1 cm-enheter och därefter belagd med serum. Detta steg är mycket viktigt eftersom det tillåter Candida celler att fästa på underlaget snabbare i jämförelse med icke-serum belagda implantaten 15. Det är viktigt att nämna att innan C. albicans experiment vi först dokumenterade bakgrunden luminiscens av våra enheter 18. Detta steg är avgörande innan någon BLI eftersom höga fosforescens av enheten kommer att störa utvärderingen av de specifika bioluminiscenta signalintensitet och signal kinetik från gLuc-uttryckande celler. Nästa, C. albicans celler inkuberas med serumbelagda kateterstycken. Kateter fragment implanteras sedan på den bakre delen av djuret efter den subkutana snitt (Figur 2A). I detta in vivo inrättat, är två snitt utförs (en på höger och en annan på vänster sida av ryggen av en mus) följt av bildning av subkutana tunnlar inuti varje snitt (Figur 2A (3)). Därefter tre enheter, som tidigare infekterats med Candida-celler, implanteras inuti varje operationsstället (Figur 2A (3 och 4)). Detta ställer upp gör att vi kan studera upp till sex biofilmer per djur. Det är anmärkningsvärt att två operations webbplatser ger en möjlighet att studera biofilm bildning av två olika stammar av intresse, till exempel vildtyp och mutant i samma djur. Figur 2B visar såret innehåller katetrar före enheten explantatet och efterföljande tvättsteg.Biofilmer utvecklats inne i bakre delen av djuret bedömdes för mareld signalmätningarna. En av de representativa djur som uppvisar bioluminiscensen signal tillsammans med rektanglar karakteriserar regionerna av intresse (ROI) visas i figur 3. Efter den sista BLI tidspunkt, är katetrar explanteras, sonikerades och därefter virvlades och utvärderas ytterligare för biofilmbildande celler kvantifiering av CFU. Data analyser demonstrera Log 10 CFU erhållits från varje kateter bit efter biofilm utveckling och explantation visas i figur 4A. Bredvid det var CFU jämfört med BLI signalintensitet och dessa data visas i figur 4B. Nittio minuter efter implantering en tydlig BLI-signal alstras genom den ACTgLuc uttryckande biofilmer medan det i vildtypstammen, knappast något ljus alstras; Intensiteten hos ljuset som detekteras från ACTgLuc uttryckandebiofilmer ökar kraftigt när biofilmen bildas, här följer samma mus (Figur 4C). Denna ökning i ljuset följer samma trend som ökningen av CFU per biofilm (Figur 4A). I våra experiment observerade vi också att en normal vildtyp-stam (ej konstruerad för att uttrycka luciferas) resulterar också i produktion av ljus vid tillsats av substratet. Emellertid fotonflödet var signifikant lägre än den som erhölls för den manipulerade stammen.
Taget tillsammans, våra data illustrerar att BLI är en kraftfull teknik för att övervaka och kvantifiera in vivo mogna C. albicans biofilmbildning i en subkutan musmodell.
Figur 1: Framställning av polyuretananordningar Polyuretan del av katetern skärs i 1 cm bitar.. Plast pocnaden innehållande kateter är öppen under sterila betingelser och alla delar, med undantag katetern avlägsnas från förpackningen. För det andra, placera linjalen under plastfickan och skär exakt 1 cm polyuretan bitar. Sådana anordningar därefter distribueras till mikrocentrifugrör (max 15 bitar / rör) och nedsänktes i 100% fetalt bovint serum, följt av inkubation över natt vid 37 ° C.
Figur 2: Viktiga steg under djuret kirurgi. (A) rättegångskateterimplantat. (1) Placera sövda djur på en varm dyna som innehåller papper vävnad och tillämpa oftalmologiska salva på ögonen. (2) Raka nedre delen av ryggen och desinficera. (3) Skapa två små (ca 0,5 cm.) Snitt genom huden på vänster sida och på höger sida av ryggen. Skapa subkutan tunnel inuti varje snitt och placera 3 katetrar inne. (4) Stäng wo und med suturer och plats djur på en varm pad att återhämta sig. (B) rättegångs kateter borttagning. (1) Placera offrade djur på ett block och desinficera de opererade sidan innehåller katetrar. Skär såret höger ovanför katetrar. (2) Ta ut varje kateter försiktigt och tvätta två gånger med 1 ml PBS. Placera det separata mikrocentrifugrör.
Figur 3:. Bioluminescens signalmätning In vivo BLI bild från en representant mus avbildas efter 6 dagar av biofilm utveckling. Kvantifieringen av signalintensitet utförs genom att placera en region av intresse (ROI) (rektangulär) runt katetrarna följt av mätning av fotonflödet per sekund genom varje ROI.
fig4highres.jpg "/>
Figur 4: Kvantifiering av mogna Candida albicans biofilmer från kolonibildande enheter (CFU) och genom BLI. (A) In vivo mogna C. albicans SKCA23- ACTgLuc och SC5314 (WT) biofilmen kvantifiering med log10 CFU efter 90 min, 2 dagar och 6 dagar av biofilmutveckling. (B) Bioluminescens signalintensitet kvantifiering från in vivo biofilmer som bildas av SKCA23- ACTgLuc och av C. albicans WT. Signal bestämdes efter 90 min (period av vidhäftning), två dagar och sex dagar av biofilmutveckling. Som kontroll använde vi möss som implanterats med icke-koloniserad katetrar och som subkutant injicerade med CTZ. Den fotonflödet som erhölls i dessa möss resulterar i vår bakgrundssignal (BG). Data uttrycktes som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Statistisk signifikans indikeras enligt följande: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av djurmodeller, och särskilt gnagarmodeller, för studier tillägnade mikrobiella biofilmer är mycket viktigt eftersom värdimmunsystemet är en viktig faktor i biofilm formation som in vitro-modeller inte kan stå för. I denna studie beskriver vi en relativt enkel subkutan C. albicans biofilm musmodell, som lätt kan antas i ett forskningslaboratorium och inte kräver stark teknisk kompetens. Denna modell utvecklades ursprungligen för att studera Staphylococcus epidermidis biofilmbildning i en rått 24.
I den presenterade modellen testades serumbelagda polyuretankatetrar utmanas med Candida-celler ex vivo under perioden av vidhäftning (90 min, 37 ° C). Denna första in vitro steg skulle kunna betraktas som en begränsande faktor på grund av bristen på immunsystemet hos de allra första stegen i biofilmen infektionsprocessen. Efter vidhäftning och förekateterimplantat, är icke-device associerade celler avlägsnades genom tvättning. Undvika tvättsteget efter den period av vidhäftning kan skapa okontrollerbar mängd celler associerade med enheten. På grund av denna anledning föreslår vi att tvätta katetrar före implantatet och därmed att inleda sin utveckling från vidhäftade celler. Efter denna inledande vidhäftning period, katetrar innehåller ca 2,0-2,5 Log 10 CFU / enhet sprids längs katetern lumen 15. Under detta stadium Candida bildar köns rör, som är fästa på underlaget.
För att likna situationen i inlagda patienter varav immunförsvaret ofta äventyras, immunsupprimerade vi råttorna i vårt underhudsfett modellsystem 15. Partiell försämring av immunsystemet hos en råtta, innan implantatet enheten och under hela perioden av biofilm utveckling, resulterade i ökad reproducerbarhet biofilmbildande celler som hämtas frånkatetrar implanteras i samma värd och även från enheter som erhållits från ytterligare djur. På grund av dessa fynd föreslår vi att immunosuppress mössen innan kateterimplantat och även under tiden för biofilmbildning. Men våra resultat visar att variationen i immunkompetenta möss mycket mindre jämfört med den som observerats hos råttor, vilket gör att möss modellsystem också lämplig för att studera rollen av värdens immunsystem på biofilmer. I vår ursprungliga råttmodell och även i samma modell översatt till möss, mogna C. albicans biofilmer utvecklas inom 48 timmar visas av liknande mängd CFU och biofilmarkitektur mellan två och sex dagar 15,18,19.
Den subkutana biofilm modellen framgångsrikt används för att följa biofilm utveckling genom flera mutanter 15. Det har visats tidigare av Nobile et al. 25 att C. albicans BCR1 Δ / BCR1 Δ misslyckades med attformulär biofilmer i en central venkateter (CVC) modell. Denna stam visas rudimentära biofilm funktioner i vår subkutana modellen som pekar på det faktum att de fenotypiska förändringar som finns i CVC-modellen kan reproduceras i den subkutana modellen 15.
I jämförelse med andra befintliga modeller, det vill säga., CVC modell eller protes stomatit modell 8,9,11, låter den subkutana modell att följa biofilm utveckling i flera kateterstycken som erhållits från ett djur, vilket minskar antalet djur som behövs för biofilmstudier. Trots dessa fördelar, kan en brist vara bristen på blodflödet som kan leda till viss förlust av näringsämnen i biofilmen. Därför, i tid av näringsförsörjningen och miljöförhållanden, är den subkutana modellen mer relaterade till enhetsrelaterade infektioner som utvecklas på ledproteser, röst proteser och pacemakrar än de som bildas på intravenösa katetrar. Ännu viktigare,översätta råtta subkutana biofilmen systemet till möss gjort denna djurmodell förenligt med BLI, vilket ytterligare minskar kostnaderna och viktigast, antalet nödvändiga djur. Vidare översätta råttmodellen till möss möjliggör användningen av transgena musmodeller för att studera värdfaktorer som är relevanta för kateterassocierad infektionsstudier.
Den stora fördelen med att använda BLI att kvantifiera biofilmer med levande djur ligger inte bara i den icke-invasiv karaktär denna metod, utan också i dess förmåga att ge dynamisk information om utvecklingen av en infektion. I denna studie, Gluc uttrycktes vid cellväggen hos C. albicans tillät bättre tillgänglighet och direkt samverkan med substratet coelenterazine, vilket är avgörande för en upptäckt av självlysande signal in vivo. I studien av Vande Velde et al. 18, kunde vi följa den självlysande signalen från C. albicans Biofilmer utvecklats på utrikGN organ in vitro. Den BLI signalintensiteten motsvarade starkt med uppgifterna från ytterligare biofilm kvantifiering tekniker, dvs CFU beslutsamhet och XTT minskning analys. Bredvid dessa resultat visade vi att den självlysande signalen från in vivo biofilmer var överens med mängden biofilm associerade celler som återvunnits från explanterade biofilmer. Dessutom al. Vande Velde et 18 visade att BLI kan användas för att följa biofilmutveckling av en vild typ och även av C. albicans bcr1Δ / bcr1Δ (biofilmen fattiga stammen) i samma djur vid samma tidpunkt. Sådana resultat stöder starkt att använda BLI under studierna tillägnad bedöma tidsförloppet av biofilm utveckling och infektion i samma djur.
Härmed, beskrev vi en experimentell förfarande för in vivo subkutant implantat av Candida infekterade enheter med efterföljande övervakning of in vivo biofilm utveckling av BLI. Sammantaget visade BLI att vara en pålitlig teknik, som tillät oss att följa en infektion under tiden undviker djuroffer vid varje tidpunkt för dataanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
