Abstract
对生物和/或非生物表面白色念珠菌生物膜发展代表对于住院患者特定威胁。到目前为止，C。白念珠菌生物膜已主要研究了在体外 ，但存在用于在体内条件下更好地理解本动力过程的一个关键需求。我们开发了一种在体内的皮下大鼠模型来研究C.白色念珠菌生物膜的形成。在我们的模型中，多个（最多9） -感染念珠菌的设备被植入到该动物的背部的部分。这给了我们一个主要的优势中央静脉导管模型系统，因为它可以让我们学习几个独立的生物膜在一个动物。最近，我们适应这个模型来研究C.白色念珠菌生物膜发展在BALB / c小鼠。在这种模式下，成熟的C。白色念珠菌生物膜内的48小时开发和示范典型的三维生物膜结构。真菌生物膜的量化传统上分析验尸并要求主机牺牲。因为这需要使用许多动物来进行动力学研究，我们采用非侵入性的生物发光成像（BLI）纵向跟进体内成熟C.白色念珠菌生物膜发展在我们皮下的模型。C.白念珠菌细胞被工程化以表达附着到细胞壁的Gaussia princeps的荧光素酶基因（GLUC）。生物发光信号是由所加的基板腔肠素转换成光，可测得的萤光素酶生成。在BLI信号相似，从植导管获得的细胞计数。非侵入性成像的体内生物膜形成定量提供即时申请在体内条件下筛选和抗真菌药验证，以及用于基于宿主-病原体相互作用的研究，在此有助于更好地理解荷兰国际集团的导管相关感染的发病机制。
Introduction
白色念珠菌是一种共生生物，它可以在不同的地点健康个体中找到，例如在皮肤上或作为胃肠道和阴道菌群的一部分。然而，在住院治疗，尤其是免疫功能低下的患者，可能会造成大范围感染1。在这样的个人，削弱免疫系统使念珠菌细胞传播到血液中，并侵入深层组织造成危及生命的感染。此外，非生物基材如中心静脉和导尿管的存在下，人工心脏瓣膜和关节可提供一个利基念珠菌附件2。粘附于这种基材是用于进一步生物膜发展，它代表一个层嵌入在细胞外聚合物材料酵母和菌丝细胞，主要由多糖2的一个先决条件。C.白色念珠菌导管机相关性感染与高死亡率有关。生物膜的一般特征是它们减少的易感性的已知抗真菌剂，如唑类3,4。仅新类抗真菌药物，例如棘白菌素和两性霉素B的脂质体制剂被证明是有效对抗导管相关感染5-7。由于生物膜抵御抗真菌剂，治疗方法非常有限，往往导致拔除尿管及其后续替代作为唯一的解决方案。
我们大部分的电流C.理解白念珠菌生物膜发展来源于在非生物基质如聚苯乙烯，或塑料用于上述装置， 即，有机硅，聚氨酯2的制造体外研究。这些模型是相当先进的，并试图尽可能接近模拟体内的情况成为可能。然而，这些系统不涉及连续血流量和叔他宿主的免疫系统。这导致了在体内模型系统，诸如在中央静脉导管（CVC）模型8-10，口腔念珠菌11义齿口腔炎模型和导管相关念珠菌12小鼠模型的发展。此外，C。白色念珠菌生物膜发展进行了研究在体内的粘膜表面，如那些从阴道13和口腔14上。我们的实验室贡献了建立皮下的C.白念珠菌生物膜模型，这是基于对受感染的导管件上Sprague Dawley大鼠15的背面的植入物。被成功地用于在我们的实验室该模型以测试生物膜易感性氟康唑和棘白菌素药物5,16，以研究双氯芬酸和卡泊芬净17的组合治疗的效果。最近，我们采用了这种系统在BALB / c小鼠18,19使用。在与其它体内模型相比，本皮下模型的主要优点是研究每只动物植入的导管件的管腔内部开发多种生物膜的可能性。
以减少实验动物的数量，我们已经适应了这个模型来研究C的发展白色念珠菌生物膜的非侵入性地用生物发光成像（BLI）18,19。这种方法被证明是一个功能强大的技术，它可以用来通过测量在感兴趣的区域（植入导管的区域中的情况下）特定BLI信号进行量化生物膜，避免动物牺牲。相比于细菌，其可以同时表达该基因和所需的生物发光反应基板由于引入一个特定勒克斯操纵子20的，大多数真核有机体，包括C。白色念珠菌，依赖于荧光素酶基因的异源表达加上特定基底，例如D-萤光素或腔肠素21的外部施用。这可能是由于真菌细胞壁和C的存在下白色念珠菌形态发生，细胞内输送的底物萤光素酶是一种主要挑战21。为了解决这个问题，Enjalbert 等人 22工程化的菌株，其中的合成C.该基因的天然分泌的Gaussia princeps的荧光素酶（GLUC）的白色念珠菌的密码子最优化形式融合到到C.白色念珠菌PGA59基因，GPI-锚定的细胞壁蛋白。因为荧光素酶的细胞壁中存在的，可避免关于基板的胞内可用性问题。这个特殊的系统被用来研究引起C.浅表感染念珠菌 22。最近，BLI也被用来跟踪口咽念珠菌及其possibl的进展Ë治疗23。这样的研究结果支持使用BLI作为有前途的技术，研究引起自由生活的细胞，而且还与设备相关的感染的感染。
在这项研究中，我们描述了C.白念珠菌生物膜发展上的聚氨酯导管件在BALB / c小鼠和其量化使用BLI。我们期间密合性的时期，随后通过植入小鼠和随后的生物膜发展在活的动物提供体外定植聚氨酯导管的详细协议。除了 测量由C.发射的BLI信号白色念珠菌细胞，我们也决定了菌落形成单位与标准技术生物膜真菌负荷的定量比较。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：所有的动物实验批准了鲁汶大学（项目编号090/2013）的伦理委员会。维持动物按照鲁汶大学动物护理准则。
1. C.白色念珠菌生长
- 动物实验开始二十四小时之前，通过加入10克的酵母提取物的造粒，将20g细菌蛋白胨，和15g造粒琼脂制备的YPD平板上。弥补体积至900毫升Milli-Q水和高压釜中。
- 加50毫升无菌的40％的葡萄糖。调匀，倒入培养皿中。离开琼脂板上以冷却和固化。
注：在本研究中，使用两个株，即野生型C.白色念珠菌 SC5314 - GLUC阴性菌株（称为WT）和C.白色念珠菌 SKCA23菌株，它是一种野生型C.白色念珠菌 SC5314转化Clp10 :: Act1p-gLUC59质粒22。在这株（命名为SKCA23- 一CTgLuc）GLUC融合到内源PGA59基因ACT1（肌动蛋白）启动子的控制下（该启动子被激活，在酵母，以及菌丝真菌的生长阶段）。这株可以从教授帕特里克·范·Dijck，鲁汶大学，比利时鲁汶的实验室要求。质粒Clp10 :: Act1p-gLUC59质粒22好心教授C. D'Enfert，巴斯德研究所，法国巴黎的捐赠。 - 在-80℃下保持两个菌株中的甘油的库存和存储。
- 在此之前的任何实验连胜株上的YPD板。孵育板在37℃下过夜。
2.导管件准备
- 实验前，确定需要多少导管。因此能够植入高达每鼠标器6的导管件（3导管在左侧和3导管在右侧的动物（ 图2A的）。
- 二十四小时之前，动物外科手术，打开包年龄含有生物安全柜下三腔导管。移除所有不必要的部分，用无菌镊子和切断附连到所述导管，用无菌解剖刀的部分。放置标尺下的塑料包，并根据标尺上的刻度（图1）切聚氨酯导管件恰好1厘米。
注意：一提的是这种类型的导管件不是磷光，因此，适合于BLI 18,19是重要的。 - 最多15个切割导管件（步骤2.2）将分为2 ml离心管中。总是准备3件额外，其用于粘附力的时间后，以列举附着念珠菌细胞的装置上的量。
- 补充导管具有约100％的胎牛血清（FBS）的1.8毫升。
- 大力涡和增加额外的100-200微升100％FBS的。完全覆盖所有的导管部分血清。
- 孵育在37℃下过夜。
3.动物和抑制免疫系统
- 保持雌性BALB / c小鼠（约8周龄）的独立通风过滤器上笼免费获得食物的标准和水自由采食 。
- 通过加入地塞米松（0.4毫克/升），以动物的饮用水发起抑制动物手术前的免疫系统24小时的。为了避免宿主的任何细菌污染，补充饮用水与抗生素， 例如氨苄西林钠粉末（0.5克/升）。
- 保持整个实验（6天）期间的动物的免疫抑制。
4. 体外白色念珠菌黏附在FBS涂聚氨酯底材
- 将每个血清涂层的导管件到一个新的1.5 ml离心管。
- 刮去一些C.白念珠菌细胞生长在YPD平板（第1步），并暂停它们在1ml PBS中。
- 稀能迪达细胞（1：100），在一个单独的离心管中。取10微升的稀释样品和其应用在一个细胞计数室。算上至少16个小方格。
- 准备在RPMI 1640培养基念珠菌细胞（每个菌株分别）至5×10 4个细胞/ ml的终浓度。
- 加入1毫升细胞悬液以每血清涂覆导管件。
- 大力旋涡振荡，并确保该导管浸没在介质和不浮在顶部。
- 孵育导管在37℃下90分钟（密合性的周期）。
- 除去导管，用无菌镊子并用1ml的PBS洗两次它们。在该步骤中做出肯定的洗涤流体通过保持导管在垂直位置，同时轻轻地冲洗导管穿过内腔。重要的是，不使用强流动，这可能会导致除去附着的细胞。
- 每次洗导管转移到一个干净的离心管（每一块涂定）。
- 置于冰上，并保持在那里，直到手术。
5.麻醉
- 通过混合75微升氯胺酮（100毫克/毫升）用100μl美托咪定（1毫克/毫升）和825微升无菌盐水制备麻醉。辖腹膜内（IP）60-80微升每10g体重麻醉鸡尾酒，导致45-60毫克/千克氯胺酮和0.6-0.8毫克/千克美托咪定的剂量。
- 逆转麻醉，稀释50微升阿替美唑（5毫克/毫升）在4.95毫升盐水，施用的ip每10g体重100μl的作为解毒剂，造成了0.5毫克/公斤的剂量。
- 注射麻醉后，将动物到一个单独的笼子里，等待，直到它完全睡着了。
- 确认动物的光皮捏和脚趾捏，不造成对皮肤的损害适当的麻醉。任何观察到的运动指示该动物不能充分麻醉进行外科手术。如果发生这种情况，等待腠分钟的时间，直至该动物的PLE不显示运动后的皮肤或脚趾捏任何迹象。
6.动物手术
- 转移从一个干净的纸巾盛放在加热垫笼麻醉动物，预先温热至37℃（ 图2A，（1））。
注：一个便宜的替代方法是使用电热毯。另外，也可以使用等温垫，必须升温中之前，动物外科手术的微波。 - 对眼睛应用眼药膏。
- 剃动物的下背部用电动剃刀。删除所有的动物毛发和干净的纸巾转移动物。皮肤消毒（ 例如 ，用1％的碘的异丙醇或70％的乙醇为0.5％氯己定），并离开该消毒区干燥大约1分钟（ 图2A，（2））。
- 做一个小切口，在皮肤（一个在左边，一个在右侧的动物）（约0.5＆＃8211 1厘米）（ 图2A，（3））。
- 剖析皮下组织用剪刀创建两个皮下隧道。每个隧道应该是大约1.5厘米长，1厘米宽。
- 插入三个导管件，先前感染念珠菌 ，在每个隧道。确保该导管处在一个水平布置成彼此相邻并且它们不相互覆盖，使六个导管片段在总的注入（ 图2A，（4））。
- 关闭与缝合切口。或者，使用DERMABOND来闭合伤口。
- 消毒伤口轻轻地用0.5％氯己定在70％的醇或与碘的异丙醇（1％）。
- 应用局部麻醉剂（利多卡因凝胶，2％），直接在伤口上。
- 辖逆转麻醉（协议5，步骤2）：腹膜内100μl的每10g体重。
- 转移动物到一个干净笼子先前放置在加热板上。保持动物独立和温暖，直到动物是完全清醒的。同时，继续进行下一个动物的动作和植入物。一旦所有的操作都是动物完全清醒。转移到一个笼子里。定期监测动物。
7.生物发光成像：腔肠（CTZ）的制备，基材为G. princeps的荧光素酶
- 通过将5毫克/毫升CTZ在酸化乙醇或根据制造商的说明准备新鲜腔肠素（CTZ）原液。
- 通过稀释在无菌PBS原液1:10的制备1.2毫工作溶液。
注：注入100微升CTZ工作溶液皮下注射在包围导管的区域。使用胰岛素注射器皮下注射CTZ的。 - 始终保持CTZ在黑暗中（ 例如 ，包括含CTZ用铝箔离心管）。储存原液在-80℃的实验的持续时间。 8.生物发光成像
- 初始化BLI相机。
- 麻醉使用感应框的动物。使用异氟醚的气体混合物中的氧气，N 2 O / O 2或空气中，在2-3％。
- 诱导后，维持麻醉在感应框和在1.5-2％的成像室。
- 开始成像会话之前，将成像板在位置A，其对应于10cm的视场。确保麻醉网点和动物通过放置一个沉睡的动物在框中的右侧位置。
- 采取一些照片，直到动物是在期望的成像位置时，在右视野的镜头下。
- 准备两个胰岛素注射器每片含100微升的CTZ工作液。
- 将一个动物在板凳上，并保持它睡着了鼻锥的方式提供气体麻醉。
- 把注射器针头的地方周围的皮下导管注入所述CTZ同时在导管的顶端。
- 立即注射后，将动物在暖板上在相机盒并启动生物发光图像采集。
- 获得连续扫描以采集时间范围从20至60秒（取决于信号强度），直到最大的信号强度被达到。在采集下一帧，通过这样的ROI放置一个ROI在每个导管三人并测量光子通量测量的先前获得的帧的BLI信号强度。
- 从下一个动物（S）第7步重复。
- 成像后，返回动物的笼子。一个实验的过程中为纵向的，非侵入性的后续的生物膜的形成过程中重复BLI。
- 分析用的图像生活软件BLI数据。放置固定尺寸的矩形的ROI在每个导管三人并测量光子通量（辐射率），通过每个ROI。重复此为每个动物。
- 报告每个导管三人每秒光子通量的BLI信号强度。通过绘制平均值和每秒的光子通量为每一组的SD表示以对数刻度的BLI数据。进行统计分析上的日志10转换后的数据。
- 准备包含每个导管装置1毫升的PBS，一种离心管，并让他们在冰。
- 通过颈脱位安乐死的动物的（ 图2B，（1））。
- 消毒用0.5％氯己定的回在70％的醇或与碘的异丙醇（1％）的皮肤上。
- 做一个切口（约3厘米）以上的导管。
- 切皮下组织和由一个从下使用无菌镊子皮下组织取出导管片段1（ 图2B，（2））。
- 在垂直位置轻轻处理导管并用1ml无菌PBS两次洗涤。将每个导管片到一个单独的离心管（在步骤1中制备的）。
- 声处理导管预先放入1ml的PBS中进行10分钟，以40,000赫兹在水浴超声波仪，把它们在冰上。
- 超声处理后，再次剧烈涡旋30秒并置于冰上。
- 制备含有900微升的PBS中两个额外的离心管。
- 使1:10 1：从原始样本（一个包含导管）100稀释，并将所有离心管冰上。
- 板100微升原始样品的1:10和1：在重复100稀释在YPD琼脂平板上。
- 孵育板2天，在37℃和计数的CFU。
- 计数生长在YPD琼脂板上的菌落（菌落可数量，最大300菌落/板），并通过适当的DILU它们相乘化因子（1X-原来，10倍或100倍稀释）。进一步乘以各导管件10倍，其对应于集落的最终量在1ml试管含有导管。带来菌落的最终金额记录10个细胞/导管件与标准偏差（SD）。表达数据作为平均值±SD表示。
- 放置每个导管和特定组的所有值到电子表格和/或统计程序，以执行上述的计算和统计分析。表明特定群体进行比较， 即 WT 与突变或2 天比。 6天生物膜形成，并与对log10的变换数据图基检测后进行非配对t检验和方差分析。
- 表达的意义通过的 p值的水平。在这项研究中表明的意义，如果P值<0.05，表示如下：* P <0.05，** P <0.005，*** P <0.0005。
9.导管植
通过菌落形成单位计数（CFU的）和结果的统计分析10定量生物膜相关细胞
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在这项研究中，我们表明导管植入和植体在小鼠体内的白念珠菌生物膜的发育过程中的外科手术。此外，我们显示成熟生物膜不仅通过经典的CFUs枚举而且通过BLI的量化。
如图1A所示 ，非磷光聚氨酯导管片切成1厘米的设备，并随后涂覆有血清。这个步骤是非常重要的，因为它允许念珠菌细胞更迅速地附着在基板与非血清涂覆的植入物15的比较。它一提的是之前的任何C.是非常重要的白色念珠菌实验中，我们第一次有记载我们的设备18的背景发光。这个步骤是在执行任何BLI之前至关重要的，因为该装置的高磷光将与特定生物发光信号的强度和信号的动力学从gLuc-评价干涉表达细胞。接下来，C.白念珠菌细胞与血清涂覆导管件。导管片段然后植入动物的皮下切口（ 图2A）后背部的部分。在本体内设置，两个切口被执行（一个在右侧，另一个在小鼠背部的左侧），然后通过形成皮下隧道的每个切口内（ 图2A（3））。随后，三个设备，先前感染念珠菌的细胞，被注入每个操作部位内（ 图2A（3和4））。这个设置可以让我们学习高达每动物6生物膜。值得注意的是，两种操作站点提供以研究生物膜形成由感兴趣两个不同的菌株，例如野生型和突变在相同的动物的可能性。 图2B显示一个包含前向设备外植体和随后的洗涤步骤导管伤口。该动物的背部部分内部开发的生物膜被评定为生物发光信号的测量。一个代表动物矩形表征感兴趣的区域（ROI的）一起显示该生物发光信号的示于图3。上次BLI时间点之后，导管被取出的，超声处理，随后涡旋并进一步评估生物膜形成细胞通过定量的CFU。数据分析表明，从每个导管片获得的Log 10 CFU的后生物膜发展和外植示于图4A中 。旁边，分别的CFU与BLI信号强度进行比较和这些数据示于图4B。九十分钟后植入一个明确的BLI信号由ACTgLuc -expressing生物膜而存在在野生型菌株，几乎没有任何产生光产生;的光的从所述ACTgLuc -expressing检测的强度作为生物膜形成，在这里按照相同的小鼠（ 图4C）的生物膜是显著增加。这增加了光按照相同的趋势为每生物膜（ 图4A）的增加的CFUs。在我们的实验中，我们还观察到，一个正常的野生型菌株（未改造以表达萤光素酶）也导致在加入底物生产的光。然而，光子通量比为改造的菌株获得显著低。
总之，我们的数据说明，BLI是一个功能强大的技术，以监测和量化在体内成熟C.白念珠菌生物膜的形成在皮下小鼠模型。
图1：聚氨酯器件的制备切成1厘米的片导管的聚氨酯部分。塑料POCKET包含导管的无菌条件，各地根据公开，除非导管从包装中取出。其次，把尺子塑料口袋下切到底1厘米聚氨酯片。这种装置随后被分配到微量离心管（最大15个/管）并浸没在100％胎牛血清接着过夜温育在37℃。
图2：动物在手术过程中的主要步骤。 （A）导管植入的程序。 （1）将麻醉动物含纸巾温暖垫和应用眼药膏的眼睛。 （2）剃背部和消毒的下部。 （3）通过在左侧和右侧背部的皮肤创建两个小（约0.5厘米）的切口。创建皮下隧道各切口内，并放置3导管内。 （4）关闭WO UND用缝线和动物的地方在一个温暖的垫来恢复。拔除导管（B）程序。 （1）将牺牲动物的垫和消毒操作面含导管。切开的伤口正上方的导管。 （2）取出每个导管轻轻并用1ml的PBS洗涤两次。放置到单独的离心管中。
图3：生物发光信号测量 在体内 BLI的图像从一个代表鼠标后6天生物膜的发展成像。信号强度的定量化是通过将感兴趣区域（ROI）内的导管随后通过每一个ROI的每秒光子通量的测量的区域（矩形）的执行。
fig4highres.jpg“/>
图4：成熟白念珠菌生物膜通过菌落形成单位（CFU的），并通过BLI定量。 （A） 在体内成熟C.白色念珠菌 SKCA23- ACTgLuc和SC5314（WT）生物膜量化由LOG10的CFUs 90分钟，2天6天生物膜的发展之后。（B）中 ，从在体内通过SKCA23- ACTgLuc和由C.形成生物膜生物发光信号强度的定量白色念珠菌 WT。信号是90分钟（粘连期），2天6天生物膜的发展后确定。作为对照，我们使用了被植入非定植导管和皮下注射CTZ小鼠。在这些小鼠中所获得的光子通量导致我们的背景信号（BG）。数据表示为平均值±标准差（SD）。统计显着性被表示如下：* P <0.05，** P <0.005，*** P <0.0005。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
使用动物模型，尤其是啮齿动物模型的，用于研究致力于微生物生物膜是非常重要的，因为宿主的免疫系统是在生物膜形成， 在体外模型不能解释的一个重要因素。在这项研究中，我们描述了一个相对简单的皮下C.白色念珠菌生物膜的小鼠模型，可以很容易地通过了一个研究实验室，也不需要很强的技术技能。最初开发这种模式来研究大鼠24 表皮葡萄球菌生物膜的形成。
在所提出的模型，血清涂覆聚氨酯导管念珠菌细胞体外期间密合性的时期（90分钟，37℃）的挑战。由于在生物膜感染过程的最初阶段，缺乏免疫系统的该第一体外步骤可能被认为是一个限制因素。下面的附着力和前导管植入物，非设备有关的细胞被洗涤去除。避免粘附期之后的洗涤步骤可以创建与设备相关联的细胞的不可控量。因为这个原因，我们建议的导管之前，植入物，因此洗，从贴壁细胞开始它的发展。在此之后的初始粘合期间，导管包含约2.0-2.5日志10的CFUs /设备扩散沿着导管腔15。在这个阶段念珠菌形成芽管，它们分别连接到衬底上。
为了像在其中免疫系统被损害常常住院的患者的情况下，我们免疫抑制的大鼠中的皮下模型系统15。鼠的免疫系统的部分损伤之前，该装置植入和整个生物膜发展的时期，导致增加从检索到生物膜形成细胞的再现导管植入在相同的宿主并还从附加动物获得的设备。由于这些研究结果，我们建议之前导管植入，也时生物膜形成的时期免疫抑制小鼠。然而，我们的结果表明，在免疫活性小鼠中的变异性要少得多相比，在大鼠中观察到，这使得该小鼠模型系统也适用于研究宿主免疫系统对生物膜的作用。在我们最初的大鼠模型，并在翻译成鼠同型号，成熟C.白色念珠菌生物膜内的48小时2 6天15,18,19之间的相似数量的CFU的和生物膜结构表现出的发展。
皮下生物膜模型成功地应用于多种突变体15遵循生物膜发展。先前已经表明由诺比尔等人 25，该三白色念珠菌BCR1Δ/ΔBCR1失败形式生物膜在中央静脉导管（CVC）的模型。该菌株显示基本的生物膜特征中的皮下模型指示这一事实，即在CVC模型中发现的表型变化可在 皮下模型15被再现。
与其他现有的模式，比较; 即 ，CVC模型或义齿口腔炎模型8,9,11，皮下模型允许跟随在从一个动物获得多个导管件生物膜发展，从而减少所需的生物膜研究的动物数量。尽管有这些优点，一个缺点可能是缺乏血液流动的，可能会导致某些剥夺在生物膜的营养物质。因此，在营养供给和环境条件的术语，皮下模型更相关于关节假体，语音假肢和起搏器比形成在静脉内导管的那些开发的设备相关感染。甚至更重要的是，平移大鼠皮下生物膜系统，以取得与BLI，这进一步降低了成本，最重要的是，需要的动物的数量这种动物模型兼容小鼠。此外，翻译的大鼠模型小鼠允许使用转基因小鼠模型来研究有关的导管相关感染的研究宿主因素。
使用BLI量化生物膜活体动物的主要优点不仅在于该方法的非侵入性的性质，而且在它的以提供对感染的发展动态信息的能力。在这项研究中，GLUC表示在C的细胞壁白色念珠菌允许更好的可访问并与腔肠素底物，它是用于检测体内生物发光信号的至关重要的直接相互作用，在范德维尔德等人 18的研究中，我们能够遵循从C的生物发光信号白色念珠菌生物膜上forei开发GN体在体外 。所述BLI信号强度强烈对应了与从附加生物膜量化技术， 即，CFU的确定和XTT还原法获得的数据。旁边的这些结果，我们发现， 在体内从生物膜的生物发光信号是在与从取出的生物膜回收的生物膜相关的细胞的数量的协议。此外，范德维尔德等人 18表明，BLI可用于遵循生物膜发展由野生型和还由C.白色念珠菌 bcr1Δ/bcr1Δ（生物膜缺损株）在相同的动物在同一时间。这样的研究结果强烈支持使用BLI的过程中，致力于评估相同的动物生物膜发展和感染的时间过程的研究。
特此，我们描述了一个实验过程的念珠菌 -感染的设备在体内与随后的监测Ø皮下植入中 f 体内生物膜发展由BLI。两者合计，BLI，证实是一种可靠的技术，它使我们能够跟随一个感染随着时间的推移，避免动物牺牲在每个时间点的数据进行分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
