Abstract
Candida albicans Biofilm Entwicklung auf biotischen und / oder abiotischen Oberflächen stellt eine besondere Bedrohung für Krankenhaus-Patienten. Bisher C. albicans Biofilme überwiegend in vitro untersucht worden, aber es ist eine dringende Notwendigkeit für ein besseres Verständnis dieser Dynamik unter in vivo-Bedingungen. Wir entwickelten eine in vivo subkutanen Rattenmodell zu studieren C. albicans Biofilm-Bildung. In unserem Modell mehrere (bis zu 9) Candida infizierten Vorrichtungen zum Hinterteil des Tieres implantiert. Das gibt uns einen großen Vorteil gegenüber der zentralen Venenkatheter Modellsystem, da es erlaubt uns, mehrere unabhängige Biofilmen in ein Tier zu studieren. Vor kurzem hat dieses Modell, um C zu studieren wir angepasst albicans Biofilmentwicklung in BALB / c Mäusen. In diesem Modell reifen C. albicans Biofilme entwickeln innerhalb von 48 Stunden und zeigen die typische dreidimensionale Biofilmarchitektur. Die Quantifizierung von Pilz BiofilmTraditionell untersucht post mortem und erfordert Host Opfer. Da dies erfordert die Verwendung von vielen Tieren, um kinetische Untersuchungen durchzuführen, wandten wir nicht-invasiv Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) in Längsrichtung folgen in vivo reifen C. albicans Biofilme entwickeln in unserem Unterhautmodell. C. albicans-Zellen wurden entwickelt, um die Gaussia princeps Luciferasegen (Gluc) an die Zellwand gebunden auszudrücken. Die Biolumineszenz-Signal wird von der Luciferase, die das zugegebene Substrat Coelenterazin in Licht, das gemessen werden kann, wandelt hergestellt. Die BLI-Signal glich Zellzahlen aus explantierten Katheter erhalten. Nicht-invasive Bildgebung zur Quantifizierung von in vivo die Bildung von Biofilmen bietet sofortigen Anwendungen für das Screening und Validierung von Antimykotika unter in vivo Bedingungen, als auch für Studien, die auf Wirt-Pathogen-Interaktionen, hiermit einen Beitrag zu einem besseren Verständnising der Pathogenese der Katheter-assoziierten Infektionen.
Introduction
Candida albicans ist ein kommensalen Organismus, der an verschiedenen Stellen von gesunden Personen auf der Haut oder als ein Teil des Magen-Darm- und Vaginalflora gefunden werden kann, zum Beispiel. Jedoch bei stationär und insbesondere immungeschwächten Patienten kann es zu einer Vielzahl von Infektionen 1. In solchen Individuen, ermöglicht die Schwächung des Immunsystems Candida-Zellen in die Blutbahn zu verbreiten und die tieferen Gewebe eindringen verursacht lebensbedrohliche Infektionen. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von abiotischen Substrate wie zentralvenöse und Blasenkathetern kann künstliche Herzklappen und Gelenke eine Nische für Candida Anlage 2. Die Haftung an solchen Substraten ist eine Voraussetzung für die weitere Entwicklung von Biofilmen, die eine Schicht aus Hefe und Hyphenzellen in extrazellulären polymeren Material eingebettet darstellt, die hauptsächlich aus Polysacchariden. 2 C. albicans Katheter-assoziierte Infektionensind mit hohen Sterblichkeit verbunden. Ein allgemeines Merkmal von Biofilmen ist ihre verminderte Empfindlichkeit gegenüber bekannten Antimykotika, wie Azole 3,4. Nur neuere Klassen von Antimykotika, wie Echinocandine und liposomale Formulierung von Amphotericin B bewiesen gegen Katheter-assoziierten Infektionen 5-7 aktiv zu sein. Aufgrund der Biofilm Widerstandsfähigkeit gegenüber Antimykotika, therapeutische Ansätze sehr begrenzt, oft Katheterentfernung und die anschließende Austausch als alleinige Lösung führt.
Die meisten unserer aktuellen Verständnis C. albicans Biofilmentwicklung aus in vitro-Untersuchungen über abiotischen Substrate wie Polystyrol oder Kunststoffen zur Herstellung von oben genannten Geräte, das heißt, Silikon, Polyurethan 2 verwendet. Diese Modelle sind schon recht weit fortgeschritten und versuchen, die Situation in vivo so eng wie möglich zu imitieren. Allerdings sind diese Systeme nicht den kontinuierlichen Blutfluss und t bedeutener das Immunsystem des Wirts. Dies führte zur Entwicklung von in-vivo-Modellsysteme, wie beispielsweise die Zentralvenenkatheter (CVC) Modell 8-10, der Prothesenstomatitis Modell orale Candidiasis 11 und einem Mausmodell für katheterassoziierten Candidurie 12. Zusätzlich C. albicans Biofilmentwicklung wurde in vivo an den Schleimhautoberflächen, wie sie aus der Scheide 13 und der Mundhöhle 14 untersucht. Unser Labor trug mit der Einrichtung einer subkutanen C. albicans Biofilm Modell, das auf dem Implantat von infizierten Katheters Stücke auf der Rückseite des Sprague-Dawley-Ratten 15 basiert. Dieses Modell wurde erfolgreich im Labor verwendet, um Biofilmanfälligkeit Fluconazol testen und Echinocandin Arzneimittel 5,16, um die Wirkung der kombinatorischen Behandlung von Diclofenac und Caspofungin 17 zu studieren. In jüngerer Zeit hat dieses System, angepasst zur Verwendung in BALB / c-Mäusen, 18,19. InVergleich mit anderen in-vivo-Modellen ist der Hauptvorteil dieser subkutanen Modell die Möglichkeit, mehrere Biofilmen pro Tier innerhalb des Lumens des Katheters implantiert Stücke entwickelt studieren.
Um die Anzahl der Versuchstiere zu reduzieren, haben wir dieses Modell, um die Entwicklung von C studieren angepasst albicans Biofilme nicht-invasiv mit Hilfe Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) 18,19. Dieses Verfahren erwies sich als ein leistungsfähiges Verfahren, das verwendet werden kann, um Biofilme durch Messung der spezifischen BLI Signal an dem interessierenden Bereich (in diesem Fall der Bereich des implantierten Katheter) zu quantifizieren, die Vermeidung Tier zu opfern. Im Vergleich zu Bakterien, die sowohl das Gen als auch das für die Biolumineszenz-Reaktion erforderlich Substrat aufgrund der Einführung eines spezifischen lux-Operon 20 exprimieren kann, werden die meisten eukaryotischen Organismen, einschließlich C. albicans, sind abhängig von der heterologen Expression eines Luciferase-Gens in Verbindung mit derexterne Verabreichung eines spezifischen Substrats, wie D-Luciferin oder Coelenterazin 21. Wahrscheinlich aufgrund der Gegenwart der pilzlichen Zellwand und C. albicans Morphogenese, die intrazelluläre Abgabe des Substrats für die Luciferase-Enzym war eine Hauptaufgabe 21. Um dieses Problem zu lösen, Enjalbert et al. 22 entwickelt eine Spannung, wo ein synthetisches C. albicans codon-optimierte Version des Gens für das natürlich sezerniert Gaussia princeps Luciferase (Gluc) wurde zu der C verschmolzen albicans PGA59 Gen, verankert ein GPI-Zellwandprotein. Wegen der Anwesenheit von Luciferase in der Zellwand, könnte Probleme hinsichtlich der intrazellulären Verfügbarkeit des Substrats vermieden werden. Dieses spezielle System wurde verwendet, um oberflächliche Infektionen durch C. verursacht studieren albicans 22. Vor kurzem BLI wurde auch verwendet, um das Fortschreiten von oropharyngealen Candidosen und seine possibl folgene-Behandlung 23. Diese Ergebnisse unterstützen die Verwendung von BLI als vielversprechende Technik, um Infektionen, die durch frei lebende Zellen, sondern auch geräteassoziierte Infektionen verursacht studieren.
In dieser Studie beschreiben wir die C. albicans Biofilmentwicklung auf Polyurethankatheterstücke in BALB / c-Mäuse und ihre Quantifizierung mittels BLI. Wir stellen ein ausführliches Protokoll der in vitro Besiedlung von Polyurethankathetern während der Dauer der Anhaftung, gefolgt von der Implantation in Mäuse und anschließende Entwicklung von Biofilmen in lebenden Tieren. Neben der Messung der BLI-Signal von der C emittiert albicans-Zellen, ermitteln wir die Kolonie bildenden Einheiten für den Vergleich mit der Standardtechnik zur Biofilmpilzbelastung Quantifizierung.
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Protocol
HINWEIS: Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der KU Leuven (Projektnummer 090/2013) genehmigt. Pflegen Tiere im Einklang mit den KU Leuven Tierpflege-Richtlinien.
1. C. albicans Wachstum
- Vierundzwanzig Stunden vor der Einleitung der Tierexperiment vorbereitet YPD-Platten durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt granuliert, 20 g bakteriologischer Pepton und 15 g granuliertes Agar. Make-up Volumen auf 900 ml mit Milli-Q-Wasser und Autoklaven.
- 50 ml sterile 40% Glucose. Gründlich mischen und in Petrischalen gießen. Verlassen Agarplatten abzukühlen und zu verfestigen.
HINWEIS: In dieser Studie verwenden zwei Stämme, nämlich Wildtyp C. albicans SC5314 - Gluc negativen Stamm (als WT bezeichnet) und C albicans SKCA23-Stamm, der ein Wildtyp C ist albicans SC5314 mit Clp10 :: Act1p-gLUC59 Plasmid 22 .In diesem Stamm (benannt SKCA23- Eine transformierteCTgLuc) Gluc wurde unter die Kontrolle des ACT1 (Aktin) Promotor des endogenen PGA59 Gens fusioniert (dieser Promotor aktiv in der Hefe sowie hyphalen Stufe des Pilzwachstums). Dieser Stamm kann aus dem Labor von Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgien beantragt werden. Plasmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 Plasmid 22 wurde freundlicherweise von Prof. C. d'Enfert, Institut Pasteur, Paris, Frankreich gespendet. - Halten Sie beide Stämme in Glycerin Lager und bei -80 ° C.
- Vor jeder Versuch Streifen Stämme auf eine YPD-Platte. Inkubieren Platte bei 37 ° C über Nacht.
2. Katheter Stück Vorbereitung
- Vor dem Versuch, zu bestimmen, wie viele Katheter benötigt werden. Es ist möglich, den Katheter 6 Stück pro Maus (3-Katheter an der linken und 3 Katheters auf der rechten Seite des Tieres (2A) bis zu implantieren.
- Vierundzwanzig Stunden vor der Tierchirurgie, öffnen Sie die PackungAlter, die Triple-Lumen-Katheter unter der biologischen Sicherheitsschrank. Alle nicht benötigten Teile mit einer sterilen Pinzette entfernen und schneiden Sie die mit einem sterilen Skalpell an den Katheter angebracht Teil. Zeigen Herrscher unter dem Kunststoffgehäuse und schneiden Polyurethan Katheter Stücke aus genau 1 cm nach der Skala auf dem Lineal (Abbildung 1).
Hinweis: Es ist wichtig zu erwähnen, dass diese Art von Katheter Stück nicht phosphoreszierenden und daher für BLI 18,19. - Legen Sie ein Maximum von 15 Schnitt Katheterstücke (Schritt. 2.2) in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Immer bereiten 3 Stück zusätzliche, die verwendet werden, um die Menge der beigefügten Candida-Zellen auf dem Gerät nach Ablauf der Haft aufzuzählen.
- Ergänzen Kathetern mit etwa 1,8 ml 100% igem fötalem Rinderserum (FBS).
- Kräftig vortexen und zusätzliche 100 bis 200 ul 100% FBS. Decken Sie alle Katheterstücke mit Serum.
- Bei 37 ° C über Nacht.
3. Tiere und Unterdrückung des Immunsystems
- Halten weiblichen BALB / c-Mäuse (ca. 8 Wochen alt) in einzeln belüfteten Filterober Käfigen mit freiem Zugang zu Standard-Futter und Wasser ad libitum.
- Initiieren Suppression des Immunsystems 24 h vor Tierchirurgie durch Zugabe von Dexamethason (0,4 mg / L), um dem Trinkwasser der Tiere. Um jede bakterielle Kontamination des Wirts zu vermeiden, ergänzen das Trinkwasser mit einer Antibiotika, beispielsweise Ampicillin Natriumpulver (0,5 g / L).
- Halten Immunsuppression von Tieren während des gesamten Experiments (bis 6 Tage).
4. Ex vivo C. albicans Haftung auf FBS beschichtet Polyurethan-Substrate
- Übertragen Sie jede Serum beschichteten Katheter Stück in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Kratzen Sie einige C albicans Zellen auf YPD-Platten (Schritt 1) angebaut und suspendieren diese in 1 ml PBS.
- Verwässern können,dida Zellen (1: 100) in einem separaten Reaktionsgefäß. Nehmen Sie 10 ul der verdünnten Probe und wenden es auf eine Zelle Zählkammer. Zählen Sie mindestens 16 kleine Quadrate.
- Bereiten Candida-Zellen (jeder Stamm separat) in RPMI 1640-Medium auf eine Endkonzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml.
- 1 ml der Zellsuspension in jede Serum beschichteten Katheterstück.
- Kräftig vortexen und sicherzustellen, dass die Katheter in das Medium eingetaucht und nicht oben schwimmen.
- Katheter bei 37 ° C für 90 min (Zeit der Adhäsion).
- Katheter mit einer sterilen Pinzette entfernen und zweimal waschen Sie sie mit 1 ml PBS. Während dieses Schrittes wird sicherstellen, dass die Waschflüssigkeit geht durch den Hohlraum, indem der Katheter in der vertikalen Position während sehr sanft Spülen der Katheter. Wichtig ist, nicht mit einem starken Strömung, die auf die Entfernung von anhaftenden Zellen führen kann.
- Übertragen Sie jede gewaschen Katheter in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen (ein Stück pro tusein).
- Zeigen auf Eis und dort zu halten, bis der Operation.
5. Anästhesie
- Bereiten Anästhesie durch Mischen von 75 ul von Ketamin (100 mg / ml) mit 100 ul Medetomidin (1 mg / ml) und 825 & mgr; l steriler Kochsalzlösung. Verabreichen intraperitoneal (ip) 60-80 ul Narkosecocktail pro 10 g Körpergewicht, was einer Dosis von 45-60 mg / kg Ketamin und 0,6-0,8 mg / kg Medetomidin.
- Zum Umlegen der Anästhesie, verdünnter 50 ul Atipamezol (5 mg / ml) in 4,95 ml Kochsalzlösung, zu verabreichen ip 100 ul pro 10 g Körpergewicht als Antidot, was in einer Dosis von 0,5 mg / kg.
- Nach dem Einspritzen der Anästhesie, legen Sie das Tier in einen separaten Käfig und warten Sie, bis es vollständig eingeschlafen.
- Überprüfen Sie die Betäubung des Tieres durch helle Haut und Zehen Prise Prise, die Schäden an der Haut verursachen. Jeder beobachtete Bewegung zeigt an, dass das Tier nicht ausreichend betäubt eine Operation durchzuführen. Wenn dies geschieht, warten Sie eine couB. von Minuten länger, bis das Tier keine Anzeichen für eine Bewegung auf der Haut oder Zehen Prise zu zeigen.
6. Tierchirurgie
- Transfer narkotisiert Tieres aus dem Käfig auf einer sauberen Gewebes auf Heizkissen gelegt, auf 37 ° C vorgewärmt (2A, (1)).
ANMERKUNG: Eine billigere Alternative ist es, elektrisch beheizten Decken benutzen. Es ist auch möglich, isotherme Pads, die in der Mikrowelle vor dem Tierchirurgie erwärmt werden muss verwenden. - Bewerben Augensalbe auf die Augen.
- Rasieren Sie den unteren Rücken des Tieres mit einem elektrischen Rasierer. Entfernen Sie alle Tierhaare und übertragen Tier auf einem sauberen Tuch ab. Desinfizieren Sie die Haut (zB mit 1% Jod Isopropanol oder 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol) und lassen Sie das desinfizierte Bereich für etwa 1 min trocknen (2A, (2)).
- Einen kleinen Einschnitt in der Haut (eine auf der linken und auf der rechten Seite des Tieres) (ungefähr 0,5 &# 8211; 1 cm) (2A, (3)).
- Präparieren Sie die Unterhaut mit einer Schere auf zwei subkutanen Tunnel zu erstellen. Jeder Tunnel ist ca. 1,5 cm lang und 1 cm breit sein.
- Legen Sie drei Katheterstücke, die zuvor mit Candida infiziert ist, in jeden Tunnel. Sicherzustellen, dass die Katheter liegen nebeneinander in einer horizontalen Anordnung und dass sie sich nicht gegenseitig abdecken, um die Implantation von sechs Katheter Fragmente insgesamt ermöglichen (2A, (4)).
- Schließen Sie die Schnitte mit Nähten. Alternativ können Sie Dermabond, um die Wunde zu schließen.
- Desinfizieren Sie die Wunde sehr vorsichtig mit 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol oder mit Jod Isopropanol (1%).
- Bewerben Lokalanästhetikum (Xylocain-Gel, 2%) direkt auf die Wunde.
- Verabreichen Umkehr Anästhesie (Protokoll 5, Schritt 2): intraperitoneal 100 & mgr; l pro 10 g Körpergewicht.
- Übertragungs Tier in einen sauberen Käfig zuvor auf eine Heizplatte gelegt. Halten Sie das Tiergetrennte und warm, bis das Tier ganz wach. Inzwischen weiterhin mit dem Betrieb und Implantat der nächste Tier. Sobald alle operierten Tiere sind ganz wach. Transfer zu einem Käfig. Überwachen Tiere regelmäßig.
7. Biolumineszenz Imaging: Darstellung von Coelenterazin (CTZ), dem Substrat für G. princeps Luciferase
- Bereiten Sie frische Coelenterazin (CTZ) Stammlösung durch Auflösen von 5 mg / ml in CTZ angesäuert Ethanol oder nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bereiten 1,2 mM Arbeitslösung durch Verdünnen der Stammlösung 1:10 in steriler PBS.
HINWEIS: Injizieren Sie 100 ul CTZ Arbeitslösungen subkutan in der Umgebung der Katheter. Verwenden Insulinspritzen zur subkutanen Injektion von CTZ. - Halten Sie CTZ im Dunkeln (zB decken Mikrozentrifugenröhrchen, die CTZ mit Aluminiumfolie). Speicherung der Stammlösung bei -80 ° C für die Dauer der Experimente. 8. Biolumineszenz Imaging
- Initialisieren Sie die BLI-Kamera.
- Betäuben die Tiere unter Verwendung eines Induktionsfeld. Verwenden eines Gasgemisches von Isofluran in Sauerstoff, N 2 O / O 2 oder Luft bei 2-3%.
- Nach der Induktion, Aufrechterhaltung einer Narkose in der Induktionsfeld und in der Abbildungskammer bei 1,5-2%.
- Vor dem Start des Bildgebungssitzung, legen Sie die Speicherfolie in Position A, die zu einem Sichtfeld von 10 cm entspricht. Stellen Sie sicher, dass die richtige Position der Anästhesie Stellen und Tier, indem Sie einen Schlaf Tier in der Box.
- Nehmen einige Fotografien bis Tier in der gewünschten Abbildungsstellung, in der FOV direkt unter der Kamera.
- Bereiten Sie zwei Insulinspritzen mit je 100 ul der CTZ Arbeitslösung.
- Legen Sie ein Tier auf der Bank und halten Sie sie schläft mit Hilfe einer Nasenkegel Bereitstellung Gasnarkose.
- Bringen Sie die Nadel der Spritze in einem Ort umgebenden Katheter subkutan und spritzenCTZ gleichzeitig auf der Oberseite der Katheter.
- Unmittelbar nach der Injektion, legen Sie das Tier auf der Warmhalteplatte in der Kamera Box und starten Sie die Bild Biolumineszenz Erwerb.
- Erwerben aufeinanderfolgenden Scans mit Erfassungszeiten von 20 bis 60 s (abhängig von der Signalintensität), bis die maximale Signalintensität erreicht wird. Bei der Übernahme des nächsten Rahmens, messen Sie die BLI Signalintensität der zuvor erworbenen Rahmen, indem Sie einen ROI in jedem Katheter Trio und die Messung der Photonenfluss durch diese ROI.
- Wiederholen Sie ab Schritt 7 für das nächste Tier (e).
- Nach der Bilderzeugung zurück Tiere in ihren Käfig. Wiederholen BLI im Verlauf eines Experiments zur Längs, nicht-invasive Verfolgung von Biofilm-Bildung.
- Analysieren Sie die BLI Daten mit Wohnzimmer Bild-Software. Legen Sie eine rechteckige ROI fester Größe auf jedem Katheter Trio und Messung der Photonenfluss (Ausstrahlung) durch jede ROI. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tier.
- Berichtdie BLI-Signal Intensität jedes Katheters Trio als Photonenfluss pro Sekunde. Stellen die BLI-Daten auf einer logarithmischen Skala, indem die Mittelwerte und Standardabweichungen von der Photonenfluss pro Sekunde für jede Gruppe. Statistische Analyse an den log 10 transformierten Daten.
- Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS, eine für jede Kathetervorrichtung und halten sie auf Eis.
- Euthanize die Tiere durch Genickbruch (2B) (1).
- Desinfizieren Sie die Haut des Rückens mit 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol oder mit Jod Isopropanol (1%).
- Einen Einschnitt (ca. 3 cm) über den Katheter.
- Schneiden subkutane Gewebe und entfernen Sie den Katheter Fragmente eins nach dem anderen unter Verwendung einer sterilen Pinzette das subkutane Gewebe (2B, (2)).
- Griff Katheter vorsichtig in vertikaler Position und waschen Sie ihn zweimal mit 1 ml sterilem PBS. Setzen Sie jeden KatheterStück in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen (hergestellt in Schritt 1).
- Mit Ultraschall-Katheter zuvor in 1 ml PBS für 10 min bei 40.000 Hz in einem Wasserbad Beschallungsgerät platziert und sie auf Eis.
- Nach der Ultraschallbehandlung kräftig für 30 Sekunden und Platz vortexen wieder auf Eis.
- Bereiten Sie zwei weitere Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 ul PBS.
- Achten 1:10 und 1: 100 Verdünnungen von Ihrem ursprünglichen Probe (die, die den Katheter enthält) und alle Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis zu halten.
- Platte 100 ul der ursprünglichen Proben, 1:10 und 1: 100 Verdünnungen auf YPD-Agar-Platten in zweifacher Ausfertigung.
- Inkubation erfolgt für 2 Tage bei 37 ° C und zählen KBE.
- Zählen Sie die auf YPD-Agarplatten Kolonien (zählbare Menge von Kolonien, maximal 300 Kolonien / Platte) und multiplizieren Sie sie mit der richtigen DiluFaktors (1x-Original, 10x oder 100x Verdünnung). Ferner multiplizieren jedes Katheters Stück 10x, die der endgültigen Höhe der Kolonien in 1 ml Röhrchen mit dem Katheter entspricht. Bringen Sie die endgültige Höhe der Kolonien bis 10 Zellen / Katheterstück mit Standardabweichung (SD) anmelden. Express-Daten als Mittelwert ± SD.
- Legen Sie alle Werte für jeden Katheters und spezifische Gruppe in eine Tabellenkalkulation und / oder statistischen Programms, um die oben erwähnten Berechnungen und statistischen Analysen durchzuführen. Geben Sie an, bestimmte Gruppen zu vergleichen, dh WT vs. Mutante oder 2 Tage vs. 6 Tage die Biofilmbildung und führen ungepaarter t-Test und ANOVA mit Tukey post-Test auf den log10-transformierten Daten.
- Express das Signifikanzniveau von einem p-Wert. In dieser Studie zeigen, Bedeutung, wenn p-Wert <0,05, wie folgt vertreten: * p <0,05, ** p <0.005, *** p <0,0005.
9. Katheter Explantation
10. Die Quantifizierung der Biofilm-assoziierte Zellen durch Koloniebildende Einheiten Count (KBE) und statistische Analysen der Ergebnisse
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Representative Results
In dieser Studie zeigen wir, das chirurgische Verfahren der Katheter-Implantat und Explantat während der in vivo C. albicans Biofilmentwicklung in einer Maus. Darüber hinaus zeigen wir die Quantifizierung der reife Biofilme nicht nur durch klassische KBE Aufzählung, sondern auch von BLI.
Wie in 1A gezeigt, wurden nicht-phosphoreszierend Polyurethankatheter in Stücke von 1 cm geschnitten Vorrichtungen und anschließend mit Serum beschichtet. Dieser Schritt ist sehr wichtig, weil es Candida-Zellen auf das Substrat schneller im Vergleich mit nicht-Serum-beschichteten Implantate 15 befestigen. Es ist wichtig, dass vor jeder C zu erwähnen, albicans experimentieren wir erste dokumentierte die Hintergrundlumineszenz unserer Geräte 18. Dieser Schritt ist entscheidend, vor allen BLI weil hohe Phosphoreszenz der Vorrichtung wird mit der Auswertung der spezifischen biolumineszenten Signalintensität und das Signal-Kinetik von gLuc- interferierenexprimierenden Zellen. Als nächstes C. albicans-Zellen werden mit den Serum beschichteten Katheterstücke inkubiert. Katheter Fragmente werden dann auf dem hinteren Teil des Tieres nach der subkutanen Einschnitt (2A) implantiert. In dieser in vivo einzurichten, zwei Einschnitte durchgeführt werden (auf der rechten Seite und eine weitere auf der linken Seite von der Rückseite einer Maus) gefolgt von der Bildung von subkutanen Tunnel in jedem Einschnitt (2A (3)). Anschließend drei Vorrichtungen, die vorher mit Candida infizierten Zellen werden in jedem Operationsstelle implantiert (Figur 2A (3 und 4)). Dieser Aufbau ermöglicht es uns, zu sechs Biofilmen pro Tier zu studieren up. Es ist bemerkenswert, dass zwei Betriebsstätten bieten eine Möglichkeit, die Biofilmbildung durch zwei verschiedene Stämme von Interesse zum Beispiel Wildtyp und Mutante in dem gleichen Tier studieren. 2B zeigt die Wunde, die Katheter vor dem Gerät Explantation und anschließende Waschschritte.Biofilme in dem hinteren Teil des Tieres entwickelt wurden für die Biolumineszenz Signalmessungen bewertet. Eines der repräsentativen Tieren Anzeigen des Biolumineszenz-Signal zusammen mit Rechtecken Charakterisieren der interessierenden Bereiche (ROIs) in Abbildung 3 dargestellt. Nach der letzten BLI Zeitpunkt, Katheter werden explantiert, beschallt und anschließend verwirbelt und weitere für die Biofilm-bildenden Zellen zu beurteilen Quantifizierung von KBE. Datenanalysen zeigen, die Log 10 KBE aus jedem Katheterstück erhalten nach dem Biofilmentwicklung und Explantation sind in 4A gezeigt. Daneben wurden CFUs mit dem BLI Signalintensität verglichen und diese Daten werden in 4B gezeigt. Neunzig Minuten nach der Implantation eine klare BLI-Signal wird durch die ACTgLuc exprimierenden Biofilmen der Erwägung, dass in der Wildtyp-Stamm, kaum Licht erzeugt wird hergestellt; Die Intensität des Lichts von der ACTgLuc -exprimierendem detektiertenBiofilme signifikant zunimmt, wenn der Biofilm gebildet wird, hier nach dem gleichen Maus (4C). Diese Zunahme der Licht folgt den gleichen Trend wie der Anstieg der CFUs pro Biofilm (4A). In unseren Experimenten haben wir beobachtet, dass ein normales Wildtyp-Stamm (nicht entworfen um Luciferase exprimieren) führt auch zur Erzeugung von Licht bei der Zugabe des Substrats. Jedoch war der Photonenfluss wesentlich niedriger als die für das Werk Stamm erhalten.
Zusammengenommen unsere Daten zeigen, dass BLI ist eine leistungsstarke Technik verfolgt und gemessen in vivo reifen C. albicans Biofilm-Bildung in einer subkutanen Mausmodell.
Abbildung 1: Herstellung von Polyurethan Polyurethan Vorrichtungen Teil des Katheters in 1 cm große Stücke geschnitten.. Plastic pocket enthaltenden Katheter unter sterilen Bedingungen und allen Teilen geöffnet, außer der Katheter aus der Verpackung entfernt. Zweitens stellen Herrscher unter der Plastiktasche und schneiden Sie genau 1 cm Polyurethanstücke. Derartige Vorrichtungen werden nachfolgend in Mikroröhrchen (max 15 Stücke / Röhrchen) verteilt und in 100% fötales Rinderserum, gefolgt von Inkubation über Nacht bei 37 ° C eingetaucht.
Abbildung 2: Die wichtigsten Schritte bei der Tierchirurgie. (A) Verfahren der Katheter-Implantat. (1) Platz betäubt Tier an einem warmen Unterlage enthalten, Papiertaschentuch und wenden Sie die Augensalbe auf die Augen. (2) Rasur unteren Teil des Rückens und desinfizieren. (3) Erstellen zwei kleine (ca. 0,5 cm) Einschnitte durch die Haut auf der linken und auf der rechten Seite des Rückens. Erstelle subkutanen Tunnel in jedem Schnitt und setzen Sie 3 Katheter im Inneren. (4) Schließen Sie die wo und mit Nähten und Platz Tier an einem warmen Pad zu erholen. (B) Verfahren der Entfernung des Katheters. (1) Platz Opfertieres auf einer Unterlage und Desinfektion der operierten Seite, die Katheter. Schneiden Sie die Wunde direkt über den Katheter. (2) Nehmen Sie jeden Katheter vorsichtig und waschen zweimal mit 1 ml PBS. Zeigen Sie in der separaten Reaktionsgefäß.
Abb. 3: Biolumineszenz Signalmessung in vivo BLI Bild von einem Vertreter der Maus nach 6 Tagen der Biofilmentwicklung abgebildet. Die Quantifizierung der Signalintensität wird durch Anordnen eines interessierenden Bereichs (ROI) (Rechteck), die um den Katheter, gefolgt von Messung der Photonenfluss pro Sekunde jede ROI durchgeführt.
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Abbildung 4: Quantifizierung der reifen Candida albicans Biofilmen von koloniebildenden Einheiten (KBE) und von BLI. (A) In-vivo-Reifung C. albicans SKCA23- ACTgLuc und SC5314 (WT) Biofilm Quantifizierung von Log 10 KBE nach 90 min, 2 Tage und 6 Tage Biofilmentwicklung. (B) Biolumineszenz Signalintensität Quantifizierung von in vivo Biofilmen durch SKCA23- ACTgLuc und C gebildet, albicans WT. Signal wurde nach 90 min (Zeit der Adhäsion), 2 Tage und 6 Tage Biofilmentwicklung ermittelt. Als Kontrolle verwendeten wir Mäuse, die mit nicht-kolonisierten Katheter implantiert wurden und wurden subkutan mit CTZ injiziert. Der Photonenfluss in diesen Mäusen erzielten Ergebnisse in unserem Hintergrundsignal (BG). Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wird wie folgt angegeben: * p <0,05, ** p <0.005, *** p <0,0005.
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Discussion
Die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere Nagermodellen, für Studien zur mikrobiellen Biofilmen gewidmet ist sehr wichtig, da die Host-Immunsystem ist ein wesentlicher Faktor für die Bildung von Biofilmen, die in vitro-Modelle nicht erklären kann. In dieser Studie wurde eine relativ einfache subkutane C. beschreiben wir albicans Biofilm Mausmodell, die leicht in einem Forschungslabor angenommen werden kann und keine starke technische Fähigkeiten. Dieses Modell wurde ursprünglich entwickelt, um Staphylococcus epidermidis Biofilmbildung in einem Ratten-24 zu untersuchen.
In dem vorgestellten Modell wurden Serum beschichteten Polyurethankathetern mit Candida-Zellen ex vivo während der Dauer der Haftung (90 min, 37 ° C) gestellt. Dieser erste Schritt kann in vitro als begrenzender Faktor, da das Fehlen des Immunsystems in den ersten Phasen des Biofilms Infektionsprozesses berücksichtigt werden. Nach Haftung und vorKatheter-Implantat, sind nicht-Gerät verknüpft Zellen durch Waschen entfernt. Die Vermeidung der Waschschritt nach dem Zeitraum der Haftung kann unkontrollierbare Menge an Zellen mit dem Gerät verbunden zu schaffen. Aus diesem Grund empfehlen wir, Katheter vor dem Implantat und damit zu waschen, um ihre Entwicklung von adhärierten Zellen initiieren. Nach dieser Anfangshaftung Periode enthalten Katheter etwa 2,0 bis 2,5 Log 10 KBE / Gerät neben dem Katheter zu verbreiten Lumen 15. Während dieser Stufe bildet Candida Keimschläuche, die auf dem Substrat angebracht sind.
Um die Situation bei hospitalisierten Patienten, von denen das Immunsystem oft beeinträchtigt ähneln, immunsupprimiert wir die Ratten im subkutane Modellsystem 15. Teilstörung des Immunsystems einer Ratte vor der Implantation des Geräts und den gesamten Zeitraum der Biofilmentwicklung, wurden erhöhte Reproduzierbarkeit der Biofilm-bildenden Zellen aus abgerufenKatheter im gleichen Wirt und auch von Geräten von weiteren Tieren erhalten implantiert. Aufgrund dieser Ergebnisse schlagen wir vor, um die Mäuse vor der Katheter-Implantat und auch in der Zeit der Biofilmbildung Immunsuppression. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch, dass die Variabilität in immunkompetenten Mäusen viel geringer im Vergleich zu derjenigen in Ratten beobachtet, die, dass Mäuse-Modellsystem für die Untersuchung der Rolle von dem Immunsystem des Wirts auf Biofilme macht auch. In unserer ursprünglichen Ratten-Modell und auch im selben Modell übersetzt, um Mäuse, reifen C. albicans Biofilme entwickeln innerhalb von 48 Stunden durch die ähnliche Menge an KBE und Biofilmarchitektur zwischen 2 und 6 Tage 15,18,19 gezeigt.
Die subkutane Biofilm-Modell wurde erfolgreich zur Biofilmbildung von mehreren Mutanten 15 folgen. Es wurde bereits früher von Nobile et al gezeigt. 25, die C albicans BCR1 Δ / Δ BCR1 gescheitertForm von Biofilmen in einen zentralen Venenkatheter (CVC) Modell. Dieser Stamm angezeigt rudimentäre Biofilm Merkmale im subkutanen Modell zeigt, daß die phänotypischen Veränderungen in der CVC Modell gefunden könnte im Unterhautmodell 15 reproduziert werden.
Im Vergleich zu anderen bestehenden Modelle, dh., CVC Modell oder Prothesenstomatitis Modell 8,9,11, ermöglicht die subkutane Modell zur Biofilmentwicklung in mehreren Katheterstücke von einem Tier stammen, zu folgen, wodurch die Anzahl der Tiere, für Biofilm Studien erforderlich reduzieren. Trotz dieser Vorteile kann ein Nachteil der mangelnden Blutflusses, die an bestimmte Entzug von Nährstoffen im Biofilm führen kann. Daher in der Bezeichnung der Nährstoffbedarf und Umgebungsbedingungen, ist die subkutane Modell mehr im Zusammenhang mit Geräte-assoziierten Infektionen bei Gelenkprothesen, Stimmprothesen und Herzschrittmacher als die bei intravenöser Katheter gebildet diejenigen entwickelt. Noch wichtiger ist,Übersetzen des subkutanen Rattenbiofilmsystem Mäusen hergestellt dieses Tiermodell kompatibel BLI, die Kosten weiter reduziert werden und am wichtigsten ist, die Anzahl der erforderlichen Tieren. Darüber hinaus die Übersetzung des Ratten-Modell bei Mäusen ermöglicht die Verwendung von transgenen Mausmodellen zu Host Faktoren, die für Katheter-assoziierten Infektionsstudien zu studieren.
Der Hauptvorteil der Verwendung BLI, Biofilme in lebenden Tieren zu quantifizieren liegt nicht nur in dem nicht-invasiven Charakter dieses Verfahren, sondern auch in seiner Fähigkeit, dynamisch Informationen über die Entstehung einer Infektion zu stellen. In dieser Studie, ausgedrückt Gluc an der Zellwand von C. albicans erlaubt eine bessere Zugänglichkeit und direkte Interaktion mit dem Substrat Coelenterazin, die entscheidend für eine Detektion von Biolumineszenz-Signal in vivo sind. In der Studie von Vande Velde et 18 al., waren wir in der Lage, um die Biolumineszenz-Signal von C folgen albicans Biofilme auf forei entwickeltgn Körpern in vitro. Die BLI Signalintensität stark korrespondierte mit den von zusätzlichen Biofilm Quantifizierungstechniken, dh, KBE Entschlossenheit und XTT-Reduktionstest gewonnenen Daten. Neben diesen Ergebnissen haben wir gezeigt, dass die biolumineszenten Signals von Biofilmen in vivo war in Übereinstimmung mit der Menge der Biofilm-assoziierten Zellen aus explantierten Biofilm gewonnen wird. Zusätzlich Vande Velde et al. 18 gezeigt, dass BLI kann zur Biofilmentwicklung von einem Wildtyp von C. zu folgen und auch albicans bcr1Δ / bcr1Δ (Biofilm-defizienter Stamm) im gleichen Tier gleichzeitig. Solche Ergebnisse die Verwendung von BLI unterstützen nachdrücklich in den Studien zur Beurteilung der zeitliche Verlauf der Biofilmbildung und Infektionen im gleichen Tier gewidmet.
Hiermit haben wir beschrieben, ein experimentelles Verfahren für die In-vivo-subkutanes Implantat von Candida infizierten Geräten mit anschließender Überwachung of in vivo Biofilmentwicklung von BLI. Zusammengenommen zeigten BLI um eine zuverlässige Technik zu sein, die uns auf eine Infektion im Laufe der Zeit folgen Vermeidung Tieropfer zu jedem Zeitpunkt der Datenanalysen erlaubt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
