Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה

Published: January 27, 2015 doi: 10.3791/52239
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology, Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven, 2Biomedical MRI Unit/ MoSAIC, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven

Abstract

פיתוח biofilm קנדידה אלביקנס על משטחי יוטיים ו / או א-ביוטי מהווה איום ספציפי לחולים מאושפזים. עד כה, ג biofilms אלביקנס נחקרו בעיקר במבחנה, אך יש צורך חיוני להבנה טובה יותר של התהליך הדינמי הזה, לפי תנאי in vivo. פיתחנו מודל עכברים תת עורי in vivo ללמוד C. היווצרות biofilm אלביקנס. במודל שלנו, מרובה (עד 9) מכשירי -infected קנדידה מושתלים לחלק האחורי של בעלי החיים. זה נותן לנו יתרון גדול על פני מערכת מודל צנתר הוורידים המרכזית כפי שהוא מאפשר לנו ללמוד כמה biofilms העצמאי בבעל חיים אחד. לאחרונה, אנו מותאמים מודל זה ללמוד C. פיתוח biofilm אלביקנס בעכברים / ג BALB. במודל זה, להתבגר ג biofilms אלביקנס לפתח בתוך 48 שעות ולהדגים את ארכיטקטורת biofilm תלת-ממדית הטיפוסית. כימות של פטריית biofilmהוא שלאחר המוות ניתח באופן מסורתי ודורש הקרבה מארח. כי זה דורש שימוש בבעלי חיים רבים לבצע מחקרים הקינטית, אנחנו מוחלים הדמיה פליטת אור לא פולשנית (BLI) לlongitudinally מעקב in vivo בוגר ג אלביקנס biofilms פיתוח במודל תת-עורי שלנו. ג תאי אלביקנס הונדסו לבטא את גן Gaussia לוציפראז פרינקפס (gLuc) הצמוד לקיר התא. אות פליטת אור מופקת על ידי לוציפראז שממיר את coelenterazine המצע הוסיף לאור שניתן למדוד. אות BLI דומה ספירת תאים המתקבלת מצנתרי explanted. הדמיה לא פולשנית לכימות בהיווצרות biofilm vivo מספקת יישומים מיידיים להקרנה והאימות של תרופות נגד פטריות בתנאי in vivo, כמו גם למחקרים המבוססים על אינטראקציות מארח הפתוגן, תורם בזאת להבין טוב יותרing של הפתוגנזה של הזיהומים הקשורים קטטר.

Introduction

קנדידה אלביקנס הוא אורגניזם commensal, אשר ניתן למצוא באתרים של אנשים בריאים שונים, למשל בעור או כחלק ממערכת העיכול והצומח בנרתיק. עם זאת, בבית חולים, ובעיקר immunocompromised חולים, הוא עלול לגרום למגוון רחב של זיהומי 1. אצל אנשים כאלה, המערכת החיסונית המוחלשת מאפשרת לתאי קנדידה להפיץ למחזור הדם ולפלוש לרקמות עמוקות יותר גורמים לזיהומים מסכני חיים. בנוסף, הנוכחות של מצעי א-ביוטי, כמו קטטרים ורידים ושתן מרכזיים, מסתמי לב מלאכותיים ומפרקים עשויות לספק נישה לקנדידה קובץ מצורף 2. הדבקה על מצעים כזה היא תנאי הכרחי לפיתוח biofilm נוסף, המייצג את שכבה של תאי שמרים וhyphal המוטבעים בחומר פולימרים תאי, בעיקר בהיקף של סוכרים 2. ג זיהומי קטטר -associated אלביקנסמשויכים שיעור תמותה גבוה. מאפיין כללי של biofilms הוא הרגישות ירדה אנטי פטרייתי ידועה, כגון azoles 3,4. שיעורים רק חדשים יותר של תרופות נגד פטריות, כגון echinocandins וניסוח liposomal של amphotericin B הוכיחו להיות פעיל נגד הזיהומים הקשורים קטטר 5-7. בגלל עמידות biofilm לאנטי פטרייתי, גישות טיפוליות מוגבלות מאוד, לעתים קרובות מובילות להסרת הקטטר והחלפתה לאחר מכן כפתרון יחיד.

רוב ההבנה הנוכחית שלנו של ג פיתוח biofilm אלביקנס מקורו בניסויים במבחנה על מצעי אביוטי כגון פוליסטירן, או פלסטיק המשמשים לייצור של מכשירים הנ"ל, כלומר, סיליקון, פוליאוריטן 2. מודלים אלה הם די מתקדמים ולנסות לחקות את המצב בvivo ככל האפשר. עם זאת, מערכות אלה אינן כרוכים בזרימת הדם רציפה וtהוא מערכת חיסונית של המארח. זה הביא לפיתוח של מערכות מודל in vivo, כגון מודל צנתר ורידים המרכזי (CVC) 8-10, מודל stomatitis התותבת של פטרת הפה 11 ומודל עכברי לcandiduria הקשורים קטטר 12. בנוסף, ג פיתוח biofilm אלביקנס נחקר in vivo על המשטחים הריריים, כמו אלה מחלל נרתיק 13 ​​ושבעל-פה 14. המעבדה שלנו תרמה להקמתה של ג תת עורית מודל אלביקנס biofilm, המבוסס על השתל של חתיכות קטטר נגועות בחלק האחורי של חולדות ספראג Dawley 15. מודל זה שימש בהצלחה במעבדה שלנו כדי לבדוק את רגישות biofilm לfluconazole וechinocandin תרופות 5,16, כדי לחקור את ההשפעה של טיפול קומבינטורית של diclofenac וקספופונגין 17. לאחרונה, אנו מותאמים מערכת זו לשימוש בעכברים / ג BALB 18,19. בהשוואה עם אחרים במודלי vivo, היתרון העיקרי של מודל זה הוא תת-עורי את האפשרות ללמוד biofilms מרובה לכל בעלי חיים שפותחו בתוך לומן של חתיכות צנתר מושתלות.

כדי לצמצם את מספרם של בעלי החיים במעבדה, יש לנו להתאים את המודל הזה כדי ללמוד את הפיתוח של ג אלביקנס biofilms הלא פולשני באמצעות הדמיה פליטת אור (BLI) 18,19. שיטה זו הוכיחה את עצמו טכניקה רבת עוצמה, אשר ניתן להשתמש בי לכמת biofilms ידי מדידת האות הספציפית BLI באזור של עניין (במקרה שלנו על השטח של צנתרים מושתלים), הימנעות הקרבת בעלי חיים. בהשוואה לחיידקים, שיכול לבטא את שני הגנים ואת המצע הדרוש לתגובת פליטת אור עקב כניסתה של אופרון לוקס ספציפי 20, רוב האורגניזמים אוקריוטים, כולל C. אלביקנס, תלוי בביטוי Heterologous של גן בלוציפראז בשילוב עםממשל חיצוני של מצע ספציפי, כגון D-luciferin או coelenterazine 21. כנראה בשל נוכחותם של דופן התא פטרייתי וג המורפוגנזה אלביקנס, המשלוח תאיים של המצע לאנזים בלוציפראז היה אתגר עיקרי 21. על מנת לפתור בעיה זו, Enjalbert et al. 22 מהונדס מתח שבו ג סינטטי הגרסה מותאמת לקודון אלביקנס של הגן ללוציפראז פרינקפס Gaussia מופרש באופן טבעי (gLuc) הייתה התמזג לג גן אלביקנס PGA59, GPI- מעוגן דופן תא חלבון. בגלל הנוכחות של לוציפראז בקיר התא, ניתן למנוע בעיות הנוגעות לזמינות תאית של המצע. מערכת מסוימת זו שימשה ללמוד זיהומים שטחיים שנגרמו על ידי ג 22 אלביקנס. ממש לאחרונה, BLI היה בשימוש גם כדי לעקוב אחר ההתקדמות של פטרת לוע התחתון וpossiblטיפול בדואר 23. ממצאים אלה תומכים בשימוש בBLI כטכניקה מבטיחה ללמוד זיהומים הנגרמים על ידי תאי חיים נטולי אלא גם זיהומים הקשורים מכשיר.

במחקר זה, אנו מתארים את C. פיתוח biofilm אלביקנס על פיסות קטטר פוליאוריטן בעכברי BALB / c והכימות שלה באמצעות BLI. אנו מספקים פרוטוקול מפורט של קולוניזציה במבחנה של צנתרים פוליאוריטן בתקופת ההידבקות אחרי השתלה בעכברים ובפיתוח biofilm שלאחר מכן בבעלי חיים. מלבד מדידת אות BLI הנפלטת על ידי ג תאי אלביקנס, אנחנו גם לקבוע את המושבה להרכיב יחידות להשוואה עם הטכניקה סטנדרטית לכימות עומס פטרייתי biofilm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של KU Leuven (פרויקט מספר 090/2013). לשמור על חיות בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי החיים KU Leuven.

1. ג אלביקנס צמיחה

  1. עשרים וארבע שעות לפני תחילתו של הניסוי בבעלי החיים, להכין צלחות YPD על ידי הוספת 10 גרם של מגורען תמצית שמרים, 20 גרם של peptone קטריולוגית, ו -15 גרם של אגר מגורען. מרכיבים את הנפח ל -900 מיליליטר מים מילי- Q וחיטוי.
  2. הוסף 50 מיליליטר של גלוקוז 40% סטרילי. מערבבים היטב ויוצקים לתוך צלחות פטרי. השאר צלחות אגר להתקרר ולחזק.
    הערה: במחקר זה, להשתמש בשני זנים, כלומר ג סוג בר אלביקנס SC5314 - זן gLuc שלילי (המכונה WT) וג אלביקנס SKCA23 מתח, שהוא ג סוג בר אלביקנס SC5314 הפך עם פלסמיד Clp10 :: Act1p-gLUC59 22 .In זן זה (בשם SKCA23-CTgLuc) gLuc התמזג לגן PGA59 אנדוגני תחת השליטה של אמרגן ACT1 (אקטין) (האמרגן הזה הוא פעיל בשמרים, כמו גם שלב hyphal של פטריית צמיחה). זן זה ניתן לבקש מהמעבדה של פרופ 'פטריק ואן Dijck, KU Leuven, לובן, בלגיה. פלסמיד פלסמיד Clp10 :: Act1p-gLUC59 22 נתרם באדיבותו של פרופ 'ג d'Enfert, מכון פסטר, פריז, צרפת.
  3. לשמור על שני הזנים במלאי גליצרול ולאחסן ב -80 ° C.
  4. לפני כל זני פס ניסוי על צלחת YPD. דגירה צלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

2. צנתר חתיכות הכנה

  1. לפני הניסוי, לקבוע כמה צנתרי צורך. ניתן להשתיל עד 6 חתיכות קטטר לכל עכבר (3 צנתרים בצד השמאל וקטטר 3 בצד ימין של בעל החיים (איור 2 א).
  2. עשרים וארבע שעות לפני ניתוח בעלי החיים, לפתוח את חבילהגיל המכיל קטטר משולש לומן תחת ארון הבטיחות הביולוגי. הסר את כל החלקים המיותרים עם פינצטה סטרילי ולחתוך את החלק מחובר לקטטר עם אזמל סטרילי. הנח שליט תחת חבילת הפלסטיק ולחתוך לחתיכות קטטר פוליאוריטן בדיוק 1 סנטימטר על פי קנה המידה על השליט (איור 1).
    הערה: חשוב לציין כי סוג זה של חתיכת צנתר הוא לא זרחני ולכן הוא מתאים לBLI 18,19.
  3. הנח למקסימום של 15 חתיכות קטטר החתך (שלב. 2.2) לתוך 2 מיליליטר צינורות microcentrifuge. תמיד להכין 3 חתיכות נוספות, אשר משמשות כדי למנות את כמות תאי קנדידה המצורפת במכשיר לאחר תקופה של הידבקות.
  4. להשלים עם צנתרים כ 1.8 מיליליטר של 100% בסרום שור עוברי (FBS).
  5. במרץ מערבולת ולהוסיף 100-200 μl נוסף של 100% FBS. לגמרי לכסות את כל חתיכות קטטר עם סרום.
  6. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה.

    3. בעלי חיים ודיכוי של המערכת החיסונית

    1. שמור נקבת BALB / c עכברים (כ 8 שבועות של גיל) בכלובים העליונים מסנן מאוורר בנפרד עם גישה חופשית למזון רגיל וכרצונך מים.
    2. ליזום דיכוי המערכת החיסונית שעות 24 לפני ניתוח בעלי חיים על ידי הוספת dexamethasone (0.4 מ"ג / ל ') למי השתייה של בעלי חיים. על מנת להימנע מכל זיהום חיידקים של המארח, להשלים את מי שתייה עם אנטיביוטיקה, למשל, אבקת נתרן אמפיצילין (L / 0.5 g).
    3. שמור דיכוי חיסוני של בעלי חיים במהלך הניסוי כולו (עד 6 ימים).

    4. מצעי פוליאוריתן Ex vivo ג אלביקנס הידבקות בFBS מצופה

    1. העבר כל פיסת צנתר מצופה סרום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר טרי.
    2. לגרד את חלק ג תאי אלביקנס גדלו על צלחות YPD (שלב 1) ולהשעות אותם ב 1 מיליליטר של PBS.
    3. לדלל יכולתאים דידה (1: 100) בצינור microcentrifuge נפרד. קח 10 μl של המדגם בדילול מלא ולהחיל אותו על תא ספירת תאים. לספור לפחות 16 ריבועים קטנים.
    4. הכן תאי קנדידה (כל זן בנפרד) במדיום RPMI 1640 לריכוז סופי של 5 x 10 4 תאים / מיליליטר.
    5. הוסף 1 מיליליטר של השעיה תא לכל פיסת צנתר מצופה בסרום.
    6. במרץ מערבולת ולהבטיח כי הצנתרים שקועים בטווח הבינוני ולא צף על גבי.
    7. דגירה צנתרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות (תקופה של הידבקות).
    8. הסר צנתרים עם פינצטה סטרילי ולשטוף אותם פעמיים עם 1 מיליליטר של PBS. במהלך שלב זה לוודא כי נוזל הכביסה עובר לומן על ידי שמירה על קטטר במצב אנכי בעת שטיפה בעדינות את הצנתרים. חשוב לציין, לא משתמש בזרימה חזקה שעלולות להוביל להסרת תאים מצורפים.
    9. העבר כל קטטר שטף לצינור microcentrifuge נקי (חתיכה לtu אחדלהיות).
    10. מניחים על קרח ולשמור שם עד ניתוח.

    5. הרדמה

    1. הכן הרדמה על ידי ערבוב 75 μl של קטמין (100 מ"ג / מיליליטר) עם של medetomidine 100 μl (1 מ"ג / מיליליטר) וμl 825 של תמיסת מלח סטרילית. לנהל intraperitoneally (IP) 60-80 μl של קוקטייל הרדמה למשקל גוף 10 גרם, וכתוצאה מכך במינון של 45-60 מ"ג / קילוגרם קטמין ו.6-.8 מ"ג / קילוגרם medetomidine.
    2. להיפוך של הרדמה, לדלל 50 atipamezole μl (5 מ"ג / מיליליטר) ב4.95 מיליליטר מלוח, לנהל ip למשקל גוף 10 g 100 μl כתרופה, וכתוצאה מכך במינון של 0.5 מ"ג / קילוגרם.
    3. לאחר ההזרקה של הרדמה, למקם את החיה לכלוב נפרד ולחכות עד שהוא נרדם באופן מלא.
    4. לאשר הרדמה תקינה של בעלי החיים על ידי צביטת עור בהירה וקמצוץ הבוהן, שאינו גורם כל נזק לעור. כל תנועה שנצפתה מצביעה על כך שבעלי החיים לא הרדים מספיק כדי לבצע ניתוח. אם זה יקרה, לחכות couple של דקות ארוכות עד שהחיה לא מראה שום סימנים של תנועה על קמצוץ עור או הבוהן.

    6. ניתוח בעלי החיים

    1. העברת בעלי החיים הרדימו מהכלוב על רקמה נקייה מונחת על כרית החימום, טרום חימם עד 37 ° C (איור 2 א, (1)).
      הערה: חלופה זולה יותר היא להשתמש בשמיכות מחוממים בחשמל. כמו כן ניתן להשתמש ברפידות isothermic, אשר חייב להיות מחוממת במיקרוגל לפני הניתוח של בעלי החיים.
    2. החל משחה עיניים על העיניים.
    3. לגלח את הגב התחתון של בעלי החיים עם מכונת גילוח חשמלי. הסר את כל שערות בעלי החיים ולהעביר את בעלי החיים בממחטת נייר נקי. לחטא את העור (לדוגמא, עם 1% isopropanol יוד או 0.5% chlorhexidine באלכוהול 70%) ולעזוב את אזור החיטוי להתייבש במשך כ 1 דק '(איור 2 א, (2)).
    4. לעשות חתך קטן בעור (אחד בצד השמאל ואחד בצד ימין של בעלי החיים) (כ 0.5 ו# 8211; 1 סנטימטר) (איור 2 א, (3)).
    5. לנתח את subcutis עם מספריים כדי ליצור שתי מנהרות תת-עורי. כל מנהרה צריכה להיות כ -1.5 סנטימטרים וברוחב 1 סנטימטר.
    6. הכנס שלוש חתיכות קטטר, נגועים בעבר עם קנדידה, בכל מנהרה. ודא שהצנתרים לשכב אחד ליד שני בהסדר אופקי וכי הם אינם מכסים אחד את השני על מנת לאפשר ההשתלה של שישה שברי קטטר בסך הכל (איור 2 א, (4)).
    7. סגור את החתכים עם תפרים. לחלופין, להשתמש Dermabond כדי לסגור את הפצע.
    8. לחטא את הפצע בעדינות רבה עם chlorhexidine 0.5% בשנת 70% אלכוהול או עם isopropanol יוד (1%).
    9. החל הרדמה מקומית (ג'ל Xylocaine, 2%) ישירות על הפצע.
    10. לנהל היפוך של הרדמה (פרוטוקול 5, שלב 2): משקל גוף intraperitoneally 100 μl לכל 10 גרם.
    11. העברת בעלי חיים לכלוב נקי הונחו בעבר על צלחת חימום. לשמור על בעלי החייםנפרד וחם עד שהחיה היא ערה לחלוטין. בינתיים, תמשיך עם המבצע והשתל של החיה הבאה. ברגע שכל בעלי החיים המופעלים ער באופן מלא. העברה לכלוב אחד. צג בעלי חיים באופן קבוע.

    הדמיה 7. פליטת אור: הכנת coelenterazine (CTZ), המצע לג ' לוציפראז פרינקפס

    1. הכן coelenterazine הטרי פתרון מניות (CTZ) על ידי המסת 5 מ"ג / מיליליטר CTZ באתנול acidified או על פי הוראות יצרן.
    2. הכן 1.2 פתרון עובד מ"מ על ידי דילול מניות פתרון 1:10 ב PBS סטרילי.
      הערה: להזריק תת עורי 100 פתרונות עובדים CTZ μl באזור המקיף את הצנתרים. השתמש במזרקי אינסולין להזרקה תת עורית של CTZ.
    3. תמיד לשמור CTZ בחושך (למשל, לכסות צינורות microcentrifuge המכילים CTZ ברדיד אלומיניום). אחסן את פתרון המניות ב -80 ° C למשך הניסויים.
      4. 8. פליטת אור הדמיה

      1. לאתחל את המצלמה BLI.
      2. להרדים את בעלי החיים באמצעות תיבת אינדוקציה. השתמש בתערובת גזים של isoflurane בחמצן, N 2 O / O 2, או באוויר ב2-3%.
      3. אחרי הגיוס, לשמור על הרדמה בתיבת האינדוקציה ובחדר ההדמיה ב1.5-2%.
      4. לפני שאתחיל בפגישה ההדמיה, למקם את צלחת ההדמיה בעמדה, אשר תואמת את FOV של 10 סנטימטרים. ודא שהמיקום הנכון של שקעי ההרדמה ובעלי החיים על ידי הצבת בעלי חיים שינה בתיבה.
      5. קח כמה תמונות עד בעלי החיים הוא במצב ההדמיה הרצוי, בFOV ממש מתחת למצלמה.
      6. הכן שני מזרקים אינסולין של הפתרון עובד CTZ כל 100 μl מכיל.
      7. הנח חיה אחת על הספסל ולשמור אותו ישן באמצעות חרטום מתן הרדמה גז.
      8. להביא את המחטים של המזרקים במקום סביב צנתרים תת עורי ולהזריקבו זמנית CTZ על גבי הצנתרים.
      9. מייד לאחר הזרקה, למקם את החיה על הצלחת החמה בתיבת המצלמה ולהתחיל רכישת תמונת פליטת אור.
      10. לרכוש סריקות ברציפות עם זמני רכישה החל 20-60 שניות (תלוי בעוצמת האות) עד שתגיע לעוצמת האות המקסימלי. במהלך הרכישה של הפריים הבא, למדוד את עוצמת אות BLI של המסגרות שנרכשו בעבר על ידי הצבת את ההחזר על ההשקעה על כל שלישיית צנתרים ומדידת שטף הפוטונים דרך ROI זה.
      11. חזור משלב 7 לחיה הבאה (ים).
      12. לאחר הדמיה, לחזור בעלי חיים לכלוב שלהם. חזור BLI במהלך ניסוי למעקב אורך, לא פולשנית של היווצרות biofilm.
      13. לנתח את נתוני BLI באמצעות תוכנת תמונת חיים. מניחים את ההחזר על ההשקעה מלבנית בגודל קבוע על כל שלישיית קטטר ולמדוד את שטף הפוטון (זוהר) דרך כל החזר על השקעה. חזור על פעולה זו עבור כל בעל חיים.
      14. דו"חעוצמת אות BLI של כל שלישיית קטטר כשטף פוטונים לשנייה. מייצג את נתוני BLI על סולם לוגריתמים על ידי התוויית הממוצע וסטיית התקן של שטף הפוטונים לשנייה לכל קבוצה. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים ביומן 10 נתונים הפכו.

      9. הצנתר explant

      1. הכן צינורות microcentrifuge המכילים 1 מיליליטר של PBS, אחד לכל מכשיר קטטר ולשמור אותם על קרח.
      2. להרדים בעלי החיים על ידי נקע בצוואר הרחם (איור 2, (1)).
      3. לחטא את העור של הגב עם chlorhexidine 0.5% בשנת 70% אלכוהול או עם isopropanol יוד (1%).
      4. עושה חתך (3 סנטימטרים בערך) מעל הצנתרים.
      5. לחתוך רקמה התת עורית ולהסיר את שברי קטטר אחד אחד מתחת לרקמה התת עורית באמצעות פינצטה סטרילית (איור 2, (2)).
      6. ידית קטטר בעדינות במצב אנכי ולשטוף אותו פעמיים עם 1 מיליליטר של PBS סטרילי. מניחים כל קטטרחתיכה לתוך צינור microcentrifuge נפרד (מוכן בשלב 1).

      10. תאי כימות Biofilm קשורים-ידי רוזן יחידות מושבה להרכיב (CFUs) וניתוח סטטיסטי של תוצאות

      1. הצנתרים Sonicate הציבו בעבר ל1 מיליליטר של PBS במשך 10 דקות ב 40,000 הרץ בsonicator אמבט מים ומניחים אותם על קרח.
      2. לאחר sonication, במרץ מערבולת למשך 30 שניות ומקום שוב על קרח.
      3. הכן שני צינורות microcentrifuge נוספים המכילים 900 μl של PBS.
      4. הפוך 01:10 ו1: 100 דילולים מהמדגם המקורי שלך (אחד המכיל את הצנתר) ולשמור את כל צינורות microcentrifuge על קרח.
      5. צלחת של הדגימות המקוריות 100 μl, 01:10 ו1: על צלחות אגר YPD 100 דילולים בשני עותקים.
      6. דגירה צלחות במשך 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס ולספור CFUs.
      7. ספירת המושבות גדלו על צלחות אגר YPD (סכום ספיר של מושבות, 300 מושבות / צלחת המרבית) ולהכפיל אותם על ידי dilu הנכוןגורם tion (1x-מקורי, 10x או 100x דילול). נוסף להכפיל כל פיסת צנתר על ידי 10x, אשר תואמת את הסכום הסופי של מושבות בצינור מיליליטר 1 המכיל את הקטטר. להביא את הסכום הסופי של מושבות להיכנס 10 תאים / חתיכת קטטר עם סטיית תקן (SD). הגעה נתונים כממוצע ± SD.
      8. מניחים את כל הערכים עבור כל קטטר וקבוצה מסוימת ולתוכנת גיליונות אלקטרוניים או / סטטיסטית, כדי לבצע את החישובים הנ"ל וניתוחים סטטיסטיים. מצביע על קבוצות ספציפיות כדי להשוות, כלומר WT לעומת מוטציה או 2 ימים vs. 6 ימים היווצרות biofilm ולבצע מבחן t מזווג וANOVA עם שלאחר בדיקת Tukey על הנתונים הפך log10.
        1. הגעה רמת מובהקות על ידי ערך p. במחקר זה מצביע על משמעות אם ערך p <0.05, המיוצגים באופן הבא: * p <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במחקר זה, אנו מציגים את ההליך כירורגי של שתל קטטר וexplant במהלך in vivo פיתוח biofilm אלביקנס ג בעכבר. יתר על כן, אנו מציגים כימות של biofilms הבוגר לא רק על ידי ספירת CFUs קלסית אלא גם על ידי BLI.

כפי שניתן לראות באיור 1 א, חתיכות קטטר פוליאוריטן אינו זרחניות נחתכו למכשירי 1 סנטימטר ולאחר מכן מצופים בסרום. שלב זה הוא חשוב מאוד משום שהוא מאפשר לתאי קנדידה לצרף מצע במהירות רב יותר בהשוואה לשתלים מצופים שאינו סרום 15. חשוב להזכיר כי לפני כל C. ניסוי אלביקנס תעדנו ראשון הארה הרקע של המכשירים שלנו 18. צעד זה הוא חיוני לפני ביצוע כל BLI כי גבוה זרחני של המכשיר יפריע להערכה של קינטיקה עוצמת אות ואות bioluminescent הספציפית מgLuc-לבטא בתאים. בשלב הבא, ג תאי אלביקנס מודגרת עם חתיכות צנתר מצופה בסרום. אז שברי צנתר מושתלים בחלק האחורי של החיה לאחר החתך תת עורי (איור 2 א). בזה in vivo להגדיר, שני חתכים מבוצעים (אחד בצד ימין ועוד אחד בצד השמאל של החלק האחורי של עכבר) ואחריו היווצרות של מנהרות תת-עורי בתוך כל חתך (איור 2 א (3)). כתוצאה מכך, שלושה מכשירים, נגועים בעבר עם תאי קנדידה, מושתלים בתוך כל אתר מבצע (איור 2 א (3 ו -4)). זה להגדיר מאפשר לנו ללמוד עד שישה biofilms לכל בעל חיים. ראוי לציין כי שני אתרי פעולה לספק אפשרות ללמוד היווצרות biofilm ידי שני זנים שונים של עניין, לדוגמא סוג פרוע ומוטציה באותו בעלי החיים. איור 2 מציג את הפצע מכיל צנתרים לפני explant המכשיר והשלבים כביסה שלאחר מכן.Biofilms פיתח בתוך החלק האחורי של החיה הוערך למדידת אותות פליטת אור. אחד מבעלי החיים נציגו מוצגות אות פליטת אור יחד עם מלבנים המאפיינים את האזורים של עניין (ROIs) מוצגת באיור 3. לאחר שנקודת הזמן BLI האחרונה, צנתרי explanted, sonicated וvortexed לאחר מכן ועוד העריכו לתאי יוצרי biofilm כימות על ידי CFUs. נתוני ניתוחים מפגינים יומן 10 CFUs המתקבל מכל חתיכת קטטר לאחר פיתוח biofilm וexplantation מוצגים באיור 4 א. בסמוך לכך, CFUs הושווה עם עוצמת אות BLI ונתונים אלה מוצגים באיור 4. תשעים דקות לאחר השתלת אות BLI ברורה מופקת על ידי ACTgLuc -expressing biofilms ואילו שם במתח הסוג בר, כמעט ולא אור מופק; עוצמת האור זוהתה מ-expressing ACTgLucbiofilms גדל באופן משמעותי כbiofilm נוצר, כאן בעקבות אותו העכבר (איור 4C). העלייה באור הזה עוקבת אחרי אותה המגמה כמו העלייה בCFUs לbiofilm (איור 4 א). בניסויים שלנו אנחנו גם ציינו כי מתח נורמלי סוג בר (לא הונדס לוציפראז) גם תוצאות בייצור של אור על תוספת של המצע. עם זאת, שטף הפוטון היה נמוך באופן משמעותי מזה שהושג עבור הזן המהונדס.

יחדיו, הנתונים שלנו להמחיש כי BLI הוא טכניקה רבת עוצמה כדי לפקח ולכמת in vivo בוגר ג היווצרות biofilm אלביקנס במודל של עכברים תת עורי.

איור 1
איור 1: הכנת התקני פוליאוריטן חלק פוליאוריתן של קטטר חתוך לחתיכות 1 סנטימטר.. POC פלסטיקצנתר מכיל קט פתוח תחת התנאים סטריליים וכל החלקים, מלבד קטטר יוסרו מהחבילה. שנית, תניח שליט תחת כיס הפלסטיק ולחתוך בדיוק 1 חלקי פוליאוריטן סנטימטר. מכשירים כאלה בהמשך מופצים לצינורות microcentrifuge (חתיכות 15 מקסימום / צינור) ושקוע ב100% בסרום שור עוברי ואחריו דגירה לילה בשעה 37 ° C.

איור 2
איור 2: שלבים עיקריים בניתוח של בעלי החיים. נוהל של שתל צנתר (). (1) המקום מורדם חיה על כרית חמה המכילה רקמת נייר ולהחיל המשחה עיניים על עיניים. (2) לגלח חלק תחתון של הגב ולחטא. (3) ליצור שני (כ. 0.5 סנטימטרים) חתכים קטנים דרך העור בצד השמאל ובצד ימין של הגב. צור מנהרה תת-עורי בתוך כל חתך ומקום 3 צנתרים בפנים. (4) סגור את וו und עם תפרים ובעלי חי מקום על משטח חם להתאושש. נוהל (ב) להסרת הקטטר. (1) המקום הקריב חיה על כרית ולחטא את הצנתרים צד המכיל פעלו. לחתוך את הפצע ממש מעל הצנתרים. (2) קח את כל קטטר בעדינות ולשטוף פעמיים עם 1 מיליליטר של PBS. הנח לצינור microcentrifuge הנפרד.

איור 3
איור 3:. מדידת אות פליטת אור בvivo תמונת BLI מעכבר נציג אחד צילמה לאחר 6 ימים של פיתוח biofilm. כימות של עוצמת אות מבוצעת על ידי הנחת אזור של העניין (ROI) (מלבני) סביב הצנתרים ואחרי מדידת שטף הפוטונים לשנייה דרך כל החזר על השקעה.

fig4highres.jpg "/>
איור 4: כימות biofilms קנדידה אלביקנס הבוגר על ידי יחידות מושבה להרכיב (CFUs) ועל ידי BLI. (א) בvivo בוגר ג אלביקנס SKCA23- ACTgLuc וSC5314 כימות biofilm על ידי Log10 CFUs לאחר 90 דקות, 2 ימים ו -6 ימים של פיתוח biofilm (WT). (ב) כימות עוצמת אות פליטת אור מbiofilms in vivo שהוקם על ידי SKCA23- ACTgLuc ועל ידי ג אלביקנס WT. האות נקבעה לאחר 90 דק '(תקופה של הידבקות), 2 ימים ו -6 ימים של פיתוח biofilm. כביקורת, אנחנו השתמשנו בעכברים שהושתלו עם צנתרים-קולוניזציה שאינם ושהוזרקו תת עורי עם CTZ. שטף הפוטון שהתקבל בעכברים אלו תוצאות בהאות רקע (BG). הנתונים באו לידי ביטוי כממוצע סטיית ± סטנדרטי (SD). משמעות סטטיסטי מצויינים כדלקמן: * p <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005. בvivo תמונות פליטת אור מעכבר נציג אחד שהיה מושתל עם שברי צנתר מכילים ג סוג בר תאי אלביקנס בצד השמאל ותאי -expressing ACTgLuc בצד ימין. העכבר היה צילם בשלוש תקופות זמן שונות, כלומר 90 דקות, 2 ימים ו -6 ימים לאחר ההשתלה של שברי קטטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש במודלים של בעלי חיים, ומודלים של מכרסמים במיוחד, ללימודים המוקדשים לbiofilms חיידקים הוא מאוד חשוב כמו המערכת החיסונית המארח הוא גורם חיוני בהיווצרות biofilm שמודלים במבחנה לא יכולים להסביר. במחקר זה, אנו מתארים ג תת-עורי פשוט יחסית מודל אלביקנס עכבר biofilm, שניתן לאמץ בקלות במעבדת מחקר ואינו דורש כישורים טכניים חזקים. מודל זה פותח במקור כדי ללמוד היווצרות biofilm סטפילוקוקוס אפידרמידיס בחולדה 24.

במודל שהוצג, צנתרים פוליאוריטן מצופה בסרום היו תיגר עם תאי קנדידה vivo לשעבר בתקופת ההידבקות (90 דקות, 37 ° C). זה צעד ראשון במבחנה עשוי להיחשב כגורם מגביל בגלל החוסר של המערכת החיסונית בשלבים הראשונים של תהליך זיהום biofilm. בעקבות הידבקות ולפנישתל קטטר, התאים הקשורים אינו מכשיר יוסרו על ידי שטיפה. הימנעות צעד הכביסה לאחר תקופה של הידבקות עלולה ליצור כמות בלתי נשלטת של תאים הקשורים למכשיר. בגלל סיבה זו, אנו ממליצים לשטוף צנתרים לפני השתל ולכן, כדי ליזום הפיתוח שלה מהתאים דבקים. לאחר תקופת הידבקות ראשונית זה, צנתרים מכילים כ 2.0-2.5 יומן 10 CFUs / מכשיר התפשט לצד קטטר לומן 15. בשלב זה קנדידה מהווה צינורות נבט, אשר מחוברים על גבי המצע.

כדי לדמות את המצב בחולים מאושפזים מהם את המערכת החיסונית היא לעתים קרובות בסכנה, אנחנו immunosuppressed החולדות במערכת המודל תת-עורי שלנו 15. ירידת הערך חלקית של המערכת החיסונית של עכברים, לפני שתל המכשיר ובמשך כל תקופת פיתוח biofilm, הביאה לשחזור מוגבר של תאי יוצרי biofilm נאספו מצנתרים מושתלים באותו המארח וגם מהתקנים המתקבלים מבעלי חיים נוספים. בגלל ממצאים אלה אנו מציעים לimmunosuppress עכברים לפני שתל קטטר וגם בתקופה של היווצרות biofilm. עם זאת, התוצאות שלנו מראות כי ההשתנות בעכברים עם מערכת חיסון היא הרבה פחות בהשוואה לזה שנצפה בחולדות, מה שהופך את זה מערכת מודל עכברים מתאים גם ללימוד תפקידה של מערכת החיסון של הפונדקאי, על biofilms. במודל העכברים המקורי שלנו וגם באותו המודל מתורגם לעכברים, להתבגר ג biofilms אלביקנס לפתח בתוך 48 שעות הודגמו על ידי הכמות דומה של CFUs ואדריכלות biofilm בין 2 ל 6 ימים 15,18,19.

מודל biofilm תת-עורי היה הצלחה נהג לעקוב פיתוח biofilm על ידי מספר מוטציות 15. זה הוכח בעבר על ידי Nobile et al. 25 שC. אלביקנס bcr1 Δ / bcr1 Δ נכשלbiofilms טופס במודל מרכזי צנתר ורידים (CVC). זן זה מוצג תכונות biofilm בסיסיות בהצבעת המודל תת-עורי שלנו לעובדה שפנוטיפי השינויים שנמצאו במודל הון סיכון יכולים להיות מועתקים במודל תת עורי 15.

בהשוואה לדגמים קיימים אחרים, כלומר., מודל stomatitis מודל או תותבת CVC 8,9,11, המודל תת עורית מאפשר לעקוב אחר התפתחות biofilm בחתיכות קטטר מרובות שהתקבלו מבעל חיים אחד, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקרי biofilm. למרות יתרונות אלה, חסרון יכול להיות חוסר זרימת דם שעלולה להוביל לקיפוח מסוים של חומרים מזינים בbiofilm. לכן, בטווח של אספקת חומרים מזינים ותנאים סביבתיים, המודל תת עורי הוא קשור יותר לזיהומים הקשורים מכשיר שפותחו על תותבות משותפות, תותבות קול וקוצבי לב מאלה שנוצרו על צנתרים תוך ורידי. אף יותר מכך,תרגום מערכת biofilm תת עורית חולדה לעכברים גרמו מודל חיה זה תואם עם BLI, אשר מפחית עוד יותר את העלויות והכי חשוב, את מספר בעלי החיים דרושים. יתר על כן, תרגום מודל העכברים לעכברים מאפשר השימוש במודלים של עכברים מהונדסים ללמוד גורמי מארח רלוונטיים למחקרי הזיהום הקשורים קטטר.

היתרון העיקרי של שימוש בBLI לכמת biofilms בבעלי חיים נמצא לא רק באופי לא פולשנית של שיטה זו, אלא גם ביכולתה לספק מידע דינמי על התפתחות זיהום. במחקר זה, gLuc הביע בקיר התא של ג אלביקנס אפשר נגישות טובה יותר ואינטראקציה ישירה עם coelenterazine המצע, אשר חיוניים לזיהוי של אות bioluminescent in vivo. במחקר של נד ולד et al. 18, שהיינו מסוגלים לבצע את אות bioluminescent מג אלביקנס biofilms פותח על foreiגופי GN במבחנה. עוצמת אות BLI מאוד התכתבה עם נתונים המתקבלים מטכניקות נוספות כימות biofilm, כלומר, נחישות CFUs וassay הפחתת XTT. בסמוך לתוצאות הללו, הראתה שאות bioluminescent מin vivo biofilms הייתה בהסכם עם כמות התאים הקשורים biofilm התאוששו מbiofilms explanted. בנוסף, נדתי ולד et al. 18 הוכיח כי BLI יכול לשמש כדי לעקוב אחר התפתחות biofilm על ידי סוג בר וגם על ידי ג אלביקנס bcr1Δ / bcr1Δ (זן biofilm הלקוי) באותה החיה באותו הזמן. ממצאים אלה תומכים בשימוש בBLI במהלך הלימודים מוקדשים להערכה במהלך התפתחות biofilm וזיהום הזמן באותה החיה.

בזה, שתארנו הליך ניסיוני לשתל תת עורי בגוף החי של מכשירי -infected קנדידה עם o הניטור הבאהf in vivo פיתוח biofilm על ידי BLI. יחדיו, BLI הראה להיות טכניקה אמינה, אשר אפשר לנו לעקוב אחר זיהום לאורך זמן הימנעות הקרבת קורבנות בכל נקודת זמן נתונים של מנתח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) - this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
  2. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
  3. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  4. Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
  5. Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
  6. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
  7. Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
  8. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  9. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  10. Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
  11. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  12. Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
  13. Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
  14. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
  15. Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
  16. Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
  17. Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
  18. Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
  19. Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
  20. Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
  21. Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
  22. Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
  23. Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
  24. Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
  25. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).

Tags

רפואה גיליון 95, Biofilm מודל תת-עורי CFUs BALB / C עכבר הדמיה פליטת אור, coelenterazine
<em>קנדידה אלביקנס</em> Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kucharíková, S., Vande… More

Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter