Abstract
생물 및 / 또는 비 생물 적 표면에 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)에 생물막 개발은 입원 환자에 대한 특정 위협을 나타냅니다. 지금까지, C. 알비 칸스 생물막은 시험관 내에서 주로 연구되어 있지만 생체 내 조건에서 이러한 역동적 인 과정의 더 나은 이해를위한 중요한 필요성이있다. 우리는 C.을 연구 생체 내 쥐 피하 모델을 개발 알비 칸스의 biofilm 형성. 우리의 모델에서, (9 개) 칸디다 -infected 여러 장치 동물의 후방 부에 주입된다. 그것은 우리가 하나의 동물에서 여러 독립적 인 생물막 (biofilm)을 연구 할 수 있도록 이것은 중심 정맥 카테터 모델 시스템을 통해 우리에게 중요한 이점을 제공합니다. 최근에, 우리는 C.을 연구하는이 모델을 적용 BALB / c 마우스에서 알비 칸스의 바이오 필름 개발. 이 모델에서 성숙 C. 알비 칸스의 바이오 필름은 48 시간 내에 개발하고 전형적인 세 가지 차원 생물막 구조를 보여줍니다. 곰팡이 바이오 필름의 정량화전통적으로 분석 사후이며 호스트 희생이 필요합니다. 이 연구는 운동을 수행하기 위해 많은 동물의 사용을 필요로하기 때문에, 우리는 길이 방향으로 성숙 생체 후속 C. 비 침습적 생물 발광 영상 (BLI)을인가 알비 칸스 (Candida albicans)는 우리의 피하 모델 개발 생물막. C.를 알비 칸스 세포는 세포벽에 부착 Gaussia 프린셉 루시페라아제 유전자 (gLuc)을 발현하도록 유전자 조작 하였다. 생물 발광 신호를 측정 할 수있는 광으로 첨가 기질 코 엘렌 테라 진 변환 루시퍼 라제에 의해 생성된다. BLI 신호는 외식 카테터에서 얻은 세포 수를 닮았다. 생체 biofilm 형성에 정량화를위한 비 침습적 영상은 더 잘 이해로, 이에 기여뿐만 아니라 호스트 병원체 상호 작용을 기반으로 연구를위한 생체 조건에서 검사 및 항진균 약물의 유효성 검사를위한 즉각적인 응용 프로그램을 제공합니다카테터 관련 감염의 병인으로 보내고.
Introduction
칸디다 알비 칸이나 피부 및 위장관 질 식물의 일부로서, 예를 들어, 정상인의 다른 부위에서 발견 될 수 공생 유기체이다. 그러나, 입원, 특히 면역 저하 환자, 그 감염 한 다양한 발생할 수있다. 이러한 개인으로, 면역 체계 약화은 칸디다 세포가 혈류로 배포하고 생명을 위협하는 감염을 일으키는 깊은 조직을 침범 할 수 있습니다. 게다가, 중심 정맥 카테터 ㆍ 뇨와 같은 비 생물학적 기재의 존재는, 인공 심장 판막과 관절 칸디다 첨부 2 틈새를 제공 할 수있다. 이러한 기판 밀착성이 주로 다당류로 이루어진 세포 외 폴리머 물질에 매립 효모 및 균사 세포 층을 나타내고 상기 생물막 개발을위한 필수 조건이다. C. 알비 칸스 (Candida albicans) 카테터 -associated 감염높은 사망률과 연관되어 있습니다. 생물막의 일반적인 특성은 공지 된 3,4- 아졸 항진균제, 그들의 감수성 감소이다. 이러한 echinocandins 및 암포 테리 신 B의 리포좀 제형으로 항진균제 만 새로운 클래스는, 카테터 관련 감염 5-7에 대한 활성 것으로 판명. 때문에 항진균제에 생물막 탄력성의 치료 방법은 매우 자주 카테터 제거 및 단독 솔루션으로 그 이후의 교체로 이어지는 제한됩니다.
C. 우리의 현재 이해의 대부분 알비 칸스 생물막 개발은 전술 한 장치, 즉, 실리콘, 폴리 우레탄 (2)의 제조에 사용되는 비 생물 성 폴리스티렌과 같은 기판, 또는 플라스틱에 대한 시험 관내 연구에서 유래. 이러한 모델은 상당히 진보와 가능한 한 근접 생체 내 상황을 모방하려고. 그러나, 이러한 시스템들은 연속 혈류 및 t를 포함하지 않는다그는 호스트의 면역 시스템. 이것은 중심 정맥 카테터 (CVC) 모델 8-10, 구강 칸디다증 (11)의 의치 구내염 모델과 카테터 관련 칸디다 12 생쥐 모델로 생체 내 모델 시스템의 개발 결과. 또한, C. 알비 칸스의 바이오 필름 개발은 질 (13)과 구강 (14)의 것과 점막 표면에 생체 내에서 연구되었다. 우리 연구실은 피하 C.의 설립에 기여 스프 라그 돌리 래트 (15)의 뒷면에 감염된 카테터 조각 임플란트에 기초 칸스 생물막 모델. 이 모델은 성공적으로 디클로페낙과 caspofungin (17)의 조합 치료의 효과를 연구하기 위해, 약 5,16를 플루코나졸에 바이오 필름 감수성을 테스트하고 echinocandin 우리 실험실에서 사용되었다. 더 최근에는 BALB / c 마우스 (18, 19)에 사용하기 위해 본 시스템 장치. 에생체 내에서 다른 모델과의 비교는,이 피하 모델의 주요 이점은 카테터 주입 편 루멘 내부 개발 동물 당 여러 생물막을 연구 할 수있는 가능성이다.
실험 동물의 수를 줄이기 위해, 우리는 C.의 개발을 연구하는이 모델을 적응 알비 칸 생물 발광 영상 (BLI) 18, 19을 이용하여 비 침습적으로 생물막. 이 방법은 동물의 희생을 피 (우리의 경우 카테터의 주입 영역) 관심 영역에서 특정 BLI 신호를 측정함으로써 바이오 필름을 정량화하는데 사용될 수있는 강력한 방법 인 것으로 판명되었다. C. 포함 인해 특정 LUX 오페론 (20)의 도입 유전자 및 생물 발광 반응에 필요한 양 기판을 표현할 수 박테리아 비교에서, 대부분의 진핵 생물 알비 칸, 결합 루시퍼 라제 유전자의 이종 발현에 의존이러한 D-루시페린 또는 코 엘렌 테라 진 (21)과 같은 특정 기판의 외부 투여. 아마도 진균 세포벽 및 C.의 존재 알비 칸스 형태 형성, 루시퍼 라제 효소 기질의 세포 내 전달이 주된 과제 21이었다. 이 문제를 해결하기 위해, Enjalbert 등. 22 균주를 설계 여기서 합성 C. 자연적으로 분비 Gaussia의 프린셉 루시 페라 제 유전자 (gLuc)의 알비 칸스 코돈 최적화 된 버전은 C.에 융합되었다 알비 칸스 PGA59 유전자는 GPI-는 세포벽 단백질을 고정. 때문에 칸막이 벽에서 루시퍼 라제의 존재, 기재의 세포 여부에 관한 문제를 회피 할 수있다. 이 특별한 시스템은 C.에 의한 표재성 감염을 연구하는 데 사용되었다 알비 칸스 (22). 최근에, 또한 BLI 구인두 칸디다증 및 possibl의 진행을 수행하기 위해 사용되었다전자 처리 (23). 이러한 연구 결과는 자유 살아있는 세포뿐만 아니라 장치 관련 감염에 의한 감염을 연구하는 유망 기술로 BLI의 사용을 지원합니다.
이 연구에서 우리는 C.을 설명 BLI를 사용하여 폴리 우레탄 카테터 BALB / c 마우스의 조각과 정량에 알비 칸스의 바이오 필름 개발. 우리는 살아있는 동물의 생쥐에 주입 및 후속 생물막 개발 뒤에 부착 기간 동안 폴리 우레탄 카테터의 시험 관내 콜로니의 상세한 프로토콜을 제공한다. 그렇다 C. 의해 방출 BLI 신호를 측정으로부터 알비 칸스 세포, 우리는 또한 생물막 곰팡이로드 정량 표준 기술과의 비교를 위해 단위를 형성 식민지를 결정합니다.
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Protocol
참고 : 모든 동물 실험은 KU 루벤 (프로젝트 번호 090/2013)의 윤리위원회에 의해 승인되었다. KU 루벤 동물 관리 지침에 따라 동물을 유지한다.
1. C. 알비 칸스 성장
- 24 시간 동물 실험의 개시 이전에, 효모 추출물 10 g을 과립, 세균 펩톤 20g, 및 과립 화 한천 15g을 첨가하여 YPD 플레이트를 준비한다. 밀리 Q 물과 오토 클레이브 900 ml의 부피를 확인합니다.
- 살균 40 % 포도당의 50 ML을 추가합니다. 철저하게 혼합하고 페트리 접시에 붓는다. 냉각 및 응고 한천 플레이트를 남겨주세요.
참고 :이 연구에서는 두 균주, 즉 야생형 C.를 사용 알비 칸스 (Candida albicans) SC5314 - gLuc 음 (WT라고 함) 균주와 C. 야생형 C.이다 알비 칸스 SKCA23 변형, SKCA23-라는 이름의 변형 (과 방진 Clp10 :: Act1p-gLUC59 플라스미드 (22) 형질 전환 알비 칸스 SC5314CTgLuc) gLuc (이 프로모터는 곰팡이의 균사뿐만 아니라 스테이지, 효모에서 활성) ACT1 (액틴) 프로모터의 제어하에 PGA59 내인성 유전자에 융합시켰다. 이 균주 교수 패트릭 반 DIJCK, KU 루벤, 루벤, 벨기에의 실험실에서 요청할 수 있습니다. 플라스미드 Clp10 :: Act1p-gLUC59 플라스미드 (22)는 친절 교수 C. 디부 Enfert, 파스퇴르 연구소, 파리, 프랑스에 의해 기증했다. - -80 ° C에서 글리세롤 주식 및 저장소에 모두 긴장을 유지한다.
- YPD 판에 어떤 실험을 연속 균주에 앞서. 하룻밤 37 ° C에서 접시를 품어.
2. 카테터 조각 준비
- 실험하기 전에 필요한 얼마나 많은 카테터를 결정합니다. 이는 마우스 당 6 개 카테터 (왼쪽 3 카테터 및 동물 (도 2a의 우측 카테터 3)까지 이식 할 수있다.
- 스물 네 시간은 동물 수술에 앞서, 팩 열생물 안전 캐비닛에서 트리플 루멘 카테터를 포함하는 나이. 멸균 메스 카테터에 부착 된 부분을 멸균 핀셋 불필요한 부분을 제거하고 잘라. 플라스틱 패키지에서 통치자를 놓고 눈금자 규모 (그림 1)에 따라 정확히 1cm의 폴리 우레탄 카테터 조각을 잘라.
참고 : 카테터 조각이 유형의 인광 및 BLI (18, 19)에 대한 때문에 적합하지 않은 것을 언급하는 것이 중요하다. - 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 15 컷 카테터 조각 (단계. 2.2)의 최대 놓습니다. 항상 밀착성 기간 후에 디바이스 칸디다 부착 세포의 양을 열거하는 데 사용되는 여분의 3 개를 준비한다.
- 약 1.8 ml를 100 % 소 태아 혈청 (FBS)으로의 카테터를 보완.
- 적극적으로 와동 100 % FBS의 추가로 100 ~ 200 μl를 추가합니다. 완전히 혈청 모든 카테터 조각을 커버합니다.
- 하룻밤 37 ° C에서 품어.
3. 동물과 면역 체계의 억제
- 표준 음식과 임의 량의 물을 무료로 이용할 개별적으로 환기 필터 상단 케이지에서 여성 BALB / C 마우스 (생후 약 8 주) 유지.
- 동물의 식수에 덱사메타손 (0.4 ㎎ / L)를 추가하여 동물의 수술 전 면역 체계 24 시간의 억제를 시작합니다. 호스트의 모든 세균 오염을 방지하기 위해, 항생제 마시는 물을 보충 예, 암피실린 나트륨 분말 (0.5 g / ℓ).
- (최대 6 일) 전체 실험 기간 동안 동물의 면역을 유지합니다.
4. 생체 내 C. albicans에 접착 FBS 코팅 폴리 우레탄 기판
- 신선한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 각각의 혈청 코팅 카테터 조각을 전송합니다.
- 일부 C.는 긁어 알비 칸스 세포 YPD 플레이트 (단계 1) 상에 성장 및 1 ml의 PBS에서 그들을 대기.
- 희석은 수별도의 microcentrifuge 관에서 : 디다 세포 (100 1). 희석 된 샘플의 10 μl를 타고 셀 카운팅 챔버에 적용합니다. 적어도 16 작은 사각형을 계산합니다.
- 5 × 104 세포 / ml의 최종 농도로 RPMI 1640 배지에 칸디다 세포 (별도로 각 균주)를 준비한다.
- 각각의 혈청 코팅 카테터 조각에 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다.
- 적극적으로 와동과 카테터가 매체에 잠긴 위에 떠되지 않도록.
- 90 분 동안 37 ° C (접착의 기간)에 카테터를 품어.
- 멸균 핀셋으로 카테터를 제거하고 1 ㎖의 PBS로 두 번 씻어. 이 단계에서는 세탁 액이 매우 부드럽게 카테터를 세척하는 동안에는 수직 위치에 카테터를 유지하여 루멘을 통과해야합니다. 중요한 것은, 첨부 된 세포의 제거로 이어질 수있는 강한 흐름을 사용하지 마십시오.
- TU 당 깨끗한 microcentrifuge 관 (한 조각 각 세척 카테터로 이동)합니다.
- 얼음에 놓고 수술까지 거기 유지.
5. 마취
- medetomidine 100 ㎕ (1 ㎎ / ㎖) 및 멸균 생리 식염수 825 ㎕를 가진 75 μL 케타민 (100 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 마취를 준비한다. 45-60 ㎎ / kg의 케타민과 0.6-0.8 ㎎ / kg의 투여 량 medetomidine 결과, 10 g의 체중 당 마취제 칵테일의 복강 (IP) 60-80 μL를 관리.
- 마취 환입, 0.5 ㎎ / kg의 투여 량의 결과로서 IP 관리 해독제, 4.95 ml의 식염수에 10 g의 체중 당 100 μl를 50 μL의 atipamezole (5 ㎎ / ㎖)로 희석.
- 마취 주사 후, 별도의 케이지에 동물을 배치하고 완전히 잠이 될 때까지 기다립니다.
- 가벼운 피부 핀치 및 피부에 손상을 일으키지 않는 발가락 핀치에 의해 동물의 적절한 마취를 확인합니다. 모든 관찰 운동은 동물이 충분히 수술을 마취되지 않았 음을 나타냅니다. 이 경우를 기 기다려더 이상 동물까지 분 PLE는 피부 나 발가락 핀치에 따라 운동의 흔적을 표시하지 않습니다.
6. 동물 수술
- 전송이 가열 패드에 배치 깨끗한 조직의 케이지에서 동물을 마취, 37 ° C로 미리 예열 (그림 2A, (1)).
주 : 싼 대안은 전기적으로 가열 담요를 사용하는 것입니다. 그것은 동물의 수술에 앞서 마이크로파에서 예열 등온 패드를 사용하는 것도 가능하다. - 눈에 안과 연고를 적용합니다.
- 전기 면도기와 동물의 허리 면도. 모든 동물의 털을 제거하고 깨끗한 조직에 동물을 전송합니다. (1 % 요오드 이소프로판올 또는 70 % 알코올에 0.5 % 클로르헥시딘으로, 예를 들어) 피부를 소독하고 약 1 분 동안 건조 소독 지역을 떠나 (그림 2A (2)).
- (피부를 약 0.5 (동물의 오른쪽 왼쪽에, 하나)의 작은 절개를 &# 8211; 1cm) (도 2A, (3)).
- 두 피하 터널을 만들 수있는 가위와 피하 조직을 해부하다. 각 터널은 약 1.5 cm 길이 1cm 폭해야한다.
- 각각의 터널에서, 이전에 칸디다 균에 감염된 세 카테터 조각을 삽입합니다. 카테터는 수평 배열에서 서로 옆에 놓여 있는지 확인하고 그들이 총 여섯 카테터 조각의 주입 수 있도록 서로를 커버하지 않는 것이 (그림 2A을 (4)).
- 봉합과 절개를 닫습니다. 다른 방법으로, 상처를 닫습니다 Dermabond를 사용합니다.
- 70 % 알코올에 요오드 또는 이소프로판올 (1 %)로 아주 부드럽게 0.5 % 클로르헥시딘으로 상처를 소독.
- 직접 상처 부위에 국소 마취제 (xylocaine 젤, 2 %)을 적용합니다.
- 마취의 반전 (프로토콜 5, 2 단계)를 관리합니다 : 복강 100 μL 당 10 g의 체중을.
- 깨끗한 케이지로 전송 동물은 이전에 가열 플레이트에 배치합니다. 동물을 유지별도의 따뜻한 동물이 완전히 깨어 때까지. 한편, 다음 동물의 운영 및 임플란트를 계속합니다. 일단 모든 운영하는 동물은 완전히 깨어. 한 케이지에 전송합니다. 정기적으로 동물을 모니터링합니다.
7. 생물 발광 이미징 : 코 엘렌 테라 진 (CTZ)의 제조 G. 들어 기판 프린셉 루시퍼
- 산성 에탄올 5 ㎎ / ㎖ CTZ을 용해 또는 제조업체의 지침에 따라에 의해 신선한 엘렌 테라 (CTZ) 주식 솔루션을 준비합니다.
- 멸균 PBS에서 원액 1:10 희석하여 1.2 mM의 작업 솔루션을 준비합니다.
참고 : 카테터 주변 지역에 100 μL CTZ 작업 솔루션 피하 주사. CTZ의 피하 주사에 대한 인슐린 주사기를 사용합니다. - 항상 어둠 속에서 CTZ을 유지 (예를 들면, 알루미늄 호일로 CTZ를 포함하는 마이크로 원심 튜브를 포함). 실험 기간 동안 -80 ° C에서 스톡 용액을 저장한다. 8. 생물 발광 영상
- BLI 카메라를 초기화합니다.
- 유도 상자를 사용하여 동물을 마취. 2~3%에서 산소 N 2 O / O (2), 이소 플루 란, 공기의 혼합 가스를 사용한다.
- 유도 후, 유도 상자 및 1.5-2 %에서 촬상 챔버 마취를 유지한다.
- 촬상 세션을 시작하기 전에, 10cm의 FOV에 대응하는 위치에서 촬상 판을 놓는다. 확인 상자에 잠자는 동물을 배치하여 마취 콘센트와 동물의 오른쪽에 위치하는.
- 동물이 바로 카메라를 아래의 FOV에, 원하는 영상 위치가 될 때까지 약간의 사진을 가져 가라.
- 두 인슐린 주사기 CTZ 작업 솔루션의 각 포함 100 μl를 준비합니다.
- 벤치에 한 마리를 놓고 가스 마취를 제공하는 코 콘에 의해 잠을 유지.
- 카테터는 피하 주변 장소에 주사기의 바늘을 가져오고 주입CTZ 동시에 카테터의 상단에.
- 주사 직후, 카메라 상자 따뜻한 접시에 놓고, 동물 생물 발광 화상 취득을 시작한다.
- (20)로부터 최대 신호 강도에 도달 할 때까지 60 초 (신호 강도에 따라)에 이르기까지 획득 시간으로 연속 스캔을 획득. 다음 프레임의 취득 중에이 ROI 통해 광자 플럭스 각 카테터 트리오 ROI 위에 위치시키고 측정함으로써 이전에 취득한 프레임 BLI 신호 강도를 측정한다.
- 다음 동물 (들)에 대한 7 단계에서 반복합니다.
- 촬영 후, 자신의 케이지에 동물을 반환합니다. 바이오 필름 형성의 길이, 비 침습적 후속위한 실험 과정을 반복 BLI.
- 생활 이미지 소프트웨어를 사용 BLI 데이터를 분석. 각 카테터 트리오를 통해 고정 된 크기의 직사각형 ROI를 놓고 각각의 투자 수익 (ROI)을 통해 광자 플럭스 (생기)를 측정한다. 모든 동물에 대해이 작업을 반복합니다.
- 보고서초당 광자 플럭스 각 카테터 트리오의 BLI 신호 강도. 평균과 각 그룹에 대한 초당 광자 플럭스 SD 플롯하여 대수 눈금에 BLI 데이터를 나타낸다. 로그 (10) 변환 된 데이터에 대한 통계 분석을 수행합니다.
- 각 카테터 장치에 대한 PBS, 한 1 ㎖를 포함하는 마이크로 원심 튜브를 준비하고 얼음에 보관하십시오.
- 경부 탈구에 의해 동물들을 안락사 (도 2b를 참조하면, (1)).
- 70 % 알코올에 요오드 또는 이소프로판올 (1 %)과 0.5 % 클로르헥시딘과 뒷면의 피부를 소독.
- 카테터 위의 절개 (약 3cm)를 확인합니다.
- 피하 조직을 잘라 멸균 핀셋을 사용하여 피하 조직 아래에서 하나를 사용하여 카테터의 파편을 제거합니다 (그림 2B를, (2)).
- 수직으로 부드럽게 카테터를 처리하고 멸균 PBS 1 ml로 두 번 씻는다. 각 카테터를 배치마이크로 원심 분리 튜브에 피스 (단계 1에서 제조).
- 카테터는 이전 초음파 처리 수조 초음파 처리기에서 40,000 Hz에서 10 분 동안 PBS 1 ㎖에 넣고, 얼음에 배치.
- 초음파 처리 한 후, 적극적으로 얼음에 다시 30 초와 장소를 소용돌이.
- PBS의 900 μl를 포함하는 두 개의 추가 마이크로 원심 튜브를 준비합니다.
- 원래 샘플 (카테터를 포함하는 하나)에서 100 희석과 얼음의 모든 마이크로 원심 튜브를 유지 : 1:10 1을 확인합니다.
- 플레이트 원래 샘플 100 ㎕ 1:10, 1 : 중복에 YPD 한천 플레이트에 100 희석.
- 37 ℃에서 2 일 동안 번호판을 품어 CFUs을 계산합니다.
- YPD 한천 플레이트에 성장 된 콜로니 (식민지의 셀 수있는 양, 최대 300 식민지 / 판)을 카운트하고 적절한 거치도록 희석되지 않았어요 곱해기 인자 (1X-원, 10 배 또는 100 배 희석). 또한, 카테터를 포함하는 1 ml의 튜브 콜로니 최종 금액에 대응하여 각 카테터 10 배 편을 곱한다. 10 세포 / 표준 편차 (SD)와 카테터 조각을 기록 식민지의 최종 금액을 가져와. SD ± 평균과 같은 데이터를 표현한다.
- 상술 한 계산 및 통계 분석을 수행하기 위해, 스프레드 시트 및 / 또는 통계 프로그램으로 카테터 각 특정 그룹에 대한 모든 값을 놓는다. 비교하기 위해 특정 그룹을 나타냅니다, 즉 WT 대 돌연변이 또는 이일 대. 육일 biofilm 형성 및 LOG10 변환 된 데이터에 Tukey의 사후 테스트와 짝 t 검정과 분산 분석을 수행합니다.
- p 값으로 유의 수준을 표현한다. 로 표현 p 값 <0.05, 다음 경우 본 연구에서 의미를 나타냅니다 * P <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005.
9. 카테터 절편
콜로니 형성 단위 수 (CFUs) 및 결과의 통계 분석에 의한 (10)의 정량 바이오 필름 관련 세포
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Representative Results
이 연구에서는 마우스의 생체 C. albicans에 생물막 개발하는 동안 카테터 임플란트 및 이식편의 수술 과정을 보여줍니다. 또한, 우리는 고전 CFUs 열거에 의해뿐만 아니라 BLI에 의해뿐만 아니라 성숙한 생물막 (biofilm)의 정량을 표시합니다.
도 1a에 도시 된 바와 같이, 비 인광 우레탄 카테터 조각 1cm 장치로 절단하고이어서 혈청으로 코팅 하였다. 이 칸디다 세포 혈청 비 코팅 임플란트 (15)와 비교하여보다 신속하게 기판에 부착 할 수 있기 때문에 공정이 매우 중요하다. 그것은 어떤 C.에 그 이전을 언급하는 것이 중요하다 알비 칸스 실험은 먼저 우리의 장치 (18)의 배경 발광을 문서화. 디바이스의 높은 인광 gLuc-에서 특정 생물 발광 신호 강도 및 신호의 동력학 평가를 방해 할 것이기 때문에이 단계는 어떤 BLI을 수행하기 전에 중요발현 세포. 다음으로, C. 알비 칸스 세포를 혈청 - 코팅 카테터 조각 인큐베이션. 카테터 단편을 절개 한 후, 피하 (도 2A) 후 동물의 후방 부에 주입된다. 이러한면에서 설정 생체 내에서 두 개의 절개가 각 절개 내부 피하 터널을 형성 한 다음 (오른쪽 마우스의 뒷면의 왼쪽에 또 다른 하나를) 수행 (그림 2A (3)). 이어서, 이전에 칸디다 감염 세포 세 장치는, 각 사업장 안에 주입 (도 2A (3, 4))한다. 이 설정 우리가 동물 최대 6 생물막까지 공부를 할 수 있습니다. 두 개의 사업장이 같은 동물, 예를 야생형 및 돌연변이를 위해, 서로 다른 두 관심 균주에 의해 biofilm 형성을 연구하는 가능성을 제공하는 것이 주목된다.도 2b는 장치 이식편 및 후속 세척 단계 전에 카테터를 함유하는 상처를 표시.동물의 후방 부 내부에 개발 된 생물막 생물 발광 측정 신호를 평가 하였다. 관심 영역 (ROI 영역)을 특성화 직사각형 함께 생물 발광 신호를 표시 대표적인 동물 중 하나는도 3에 도시된다. 마지막 BLI 시점 후, 카테터는 외식 초음파 처리하고,이어서 텍싱 및 상기 생물막 형성 셀들에 대해 평가된다 CFUs에 의해 정량화. 생물막 개발 및 적출은도 4a에 도시 된 후 카테터 데이터는 각 조각에서 얻어진 로그 10 CFUs을 보여주는 분석한다. 그 옆에, CFUs는 BLI 신호 강도와 비교하고, 이들 데이터는도 4b에 도시되어있다. 아흔 분은 주입 후 맑은 BLI 신호는 야생형에, 거의 모든 빛이 생성되지 않는 반면 ACTgLuc이 생물막 (biofilm)을 발현에 의해 생성된다; ACTgLuc의 발현으로부터 검출 된 광의 강도생물막 동일한 마우스 (도 4C) 다음 여기서, 형성되는 생물막으로 크게 증가하고있다. 빛의 증가는 생물막 (그림 4A) 당 CFUs의 증가와 같은 추세를 따른다. 실험에서는도 (되지 루시페라아제를 발현하도록 유전자 조작 된) 통상의 야생형 균주는 또한 기판의 첨가시 빛의 생산을 초래한다는 관찰했다. 그러나, 광자 플럭스는 조작 된 균주에 의한 것 이상 유의하게 낮았다.
함께 찍은, 우리의 데이터는 BLI는 C.을 모니터링하고 정량화 생체 내 성숙 할 수있는 강력한 기술이다 것을 보여 피하 마우스 모델에서 칸디다 알비 칸스 biofilm 형성.
그림 1 : 폴리 우레탄 장치의 제조 1cm의 조각으로 잘라 카테터의 폴리 우레탄 부분입니다.. 플라스틱 POC카테터가 패키지에서 제거를 제외하고 ket에 포함 된 카테터, 멸균 조건 및 모든 부분에서 열려 있습니다. 둘째, 플라스틱 주머니에서 통치자를 배치하고 정확하게 1cm 폴리 우레탄 조각을 잘라. 이러한 장치는 후속 적으로 마이크로 원심 튜브 (최대 15 개 / 튜브)에 분배하고, 37 ° C에서 밤새 인큐베이션 100 % 소 태아 혈청에 침수된다.
그림 2 : 동물 수술 중 주요 단계. (A) 카테터 임플란트의 절차. (1) 장소는 종이 조직을 포함하는 따뜻한 패드에 동물을 마취하고 눈에 안과 연고를 적용합니다. (2) 뒷면과 소독의 아래 부분을 면도. (3) 왼쪽과 뒤쪽의 오른쪽에있는 피부를 통해 두 개의 작은 (약. 0.5 cm) 절개를 만듭니다. 각 절개 내부 피하 터널을 만들고 내부에 3 카테터를 배치합니다. (4) 하시다을 닫습니다 따뜻한 패드의 봉합과 장소 동물과 놀이가. 복구 카테터 제거 (B) 절차에. (1) 장소는 패드에 동물을 희생하고 운영 측면 포함 카테터를 소독. 바로 카테터 위의 상처를 잘라. (2) 부드럽게 각 카테터를 타고 1 ㎖의 PBS로 두 번 세척한다. 별도의 microcentrifuge 관에 놓습니다.
그림 3 :. 생물 발광 신호 측정 생체 내 BLI의 이미지를 대표하는 하나의 마우스에서 생물막 개발 6 일 후에 군데. 신호 강도의 정량화를 통해 ROI 매 초당 광자 플럭스를 측정한다 카테터 주위 (직사각형) ROI (region of interest)를 배치함으로써 수행된다.
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그림 4 : 콜로니 형성 단위 (CFUs)에 의해 BLI에 의해 성숙 칸디다 알비 칸스의 바이오 필름의 정량화. (A)에서, 생체 내 성숙 C. 알비 칸스 (Candida albicans) SKCA23- ACTgLuc 및 SC5314 (WT) 90 분, 2 일 바이오 필름 개발 6 일 후에의 Log10 CFUs에 의한 바이오 필름 정량. (B) SKCA23- ACTgLuc에 의해 C.에 의해 형성 생체 바이오 필름에서 생물 발광 신호 강도 정량화 알비 칸스 WT. 신호는 90 분 (접착의 기간), 2 일 바이오 필름 개발 6 일 후에 측정 하였다. 제어, 우리는 비 식민지화 카테터를 이식하고 그 피하 CTZ 주사 하였다 마우스를 사용했다. 이들 마우스에서 수득 광자 플럭스가 우리의 배경 신호 (BG)을 초래한다. 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표현했다. 다음과 같이 통계적 유의성이 표시됩니다 : * P <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005.
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Discussion
숙주 면역 시스템은 시험 관내 모델을 설명 할 수 없다 생물막 형성에 필수 요소이기 때문에 미생물의 생물막 전용 연구 동물 모델, 특히 설치류 모델의 사용이 매우 중요하다. 본 연구에서는 비교적 간단한 설명을 피하 C. 쉽게 연구 실험실에서 채택 될 수 있으며, 강력한 기술적 인 능력을 필요로하지 않습니다 알비 칸스 생물막 마우스 모델. 이 모델은 원래 쥐의 표피 포도 구균 (24)에 생물막 형성을 연구하기 위해 개발되었다.
제시된 모델에서 혈청 코팅 폴리 우레탄 카테터 접착주기 (90 분, 37 ° C) 중에 칸디다 생체 세포로 감염시켰다. 첫 번째 단계는 생체 외 때문에 생물막 감염 과정의 첫 번째 단계에서 면역계의 부족으로 인해 제한 요인으로 고려 될 수있다. 접착력 전에 이어카테터 임플란트는 비 장치 관련 세포는 세척에 의해 제거된다. 밀착성의 기간 후에 세정 공정을 피하는 것은 디바이스와 관련된 세포의 양을 제어 할 수없는 생성 할 수있다. 때문에 이러한 이유로, 우리는 접착 된 세포에서 개발을 시작하기 전에 임플란트에 따라서 카테터를 세척하는 것이 좋습니다. 이 초기 접착 기간 후, 카테터는 15 루멘 카테터와 함께 확산 약 2.0 ~ 2.5 로그인 10 CFUs / 장치가 포함되어 있습니다. 이 단계는 칸디다 기판 상에 부착 된 세균 튜브를 형성한다.
면역 체계가 종종 손상 누구의 입원 환자의 상황과 유사하기 위해, 우리는 우리의 피하 모델 시스템 (15)에 쥐를 면역 억제. 쥐의 면역계의 일부 손상은 디바이스 임플란트 및 생물막의 개발 기간 동안 사전에서 검색 생물막 형성 세포의 증가 재현성 귀착동일한 호스트와 추가적인 동물에서 얻은 장치에서 이식 카테터. 때문에 이러한 결과로 우리는 카테터를 주입하기 전에 또한 biofilm 형성의 기간 동안 마우스를 immunosuppress하는 것이 좋습니다. 그러나, 우리의 결과는 면역 생쥐의 변동성도 생물막 (biofilm)의 호스트 면역 체계의 역할을 공부를하는데 그 쥐 모델 시스템을 만드는 쥐에서 관찰에 훨씬 덜 비교되는 것을 알 수있다. 우리의 원래의 쥐 모델에서 또한 마우스로 번역 같은 모델에서, C. 성숙 알비 칸스의 바이오 필름은 2 육일 15,18,19 사이의 유사한 CFUs의 양 및 생물막 구조에 의해 증명 48 시간 내에 개발할 수 있습니다.
피하 생물막 모델이 성공적으로 여러 돌연변이 생물막 (15)에 의해 발전을 수행하는 데 사용되었다. 이 노빌 등에 의해 이전에 보여 주었다. 25 그 C. 알비 칸스 BCR1 Δ / Δ가 실패 BCR1중심 정맥 카테터 (CVC) 모델의 형태 생물막. 이 균주는 CVC 모델에서 발견 된 표현형의 변화가 피하 모델 (15)에 재현 할 수 있다는 사실에 우리의 피하 모델 가리키는 초보 생물막 기능을 표시.
기존의 다른 모델과 비교 즉., CVC 모델이나 의치 구내염 모델 8,9,11은 피하 모델함으로써 생물막 연구에 필요한 동물의 수를 줄이고, 하나의 동물에서 얻은 여러 카테터 조각 바이오 필름 개발을 수행 할 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구하고, 단점은 생물막의 특정 영양소 부족을 초래할 수있다 혈류 부족 일 수있다. 따라서, 영양 공급 및 환경 조건의 기간에, 피하 모델은 정맥 카테터 상에 형성된 것보다 공동 보철, 음성 보철 및 맥박 조정기에 개발 된 장치 관련 감염에 더 관련이있다. 더욱 중요하게,가장 중요한 추가적인 비용을 절감하고 BLI, 필요한 동물의 수에이 동물 모델 양립 쥐 쥐 피하 생물막 변환 시스템. 또한, 쥐 모델 쥐를 번역하는 것은 카테터 관련된 감염 연구에 관련된 호스트 요인을 연구하는 트랜스 제닉 마우스 모델의 사용을 가능하게한다.
살아있는 동물에 생물막을 정량화 BLI을 사용하는 주요 장점은 단지 이러한 방법의 비 침습에 놓여 문자뿐만 아니라 감염의 발달에서의 동적 정보를 제공하는 기능이다. 본 연구는 C. gLuc의 세포벽 발현 알비 칸스 (Candida albicans)가. 생체 내에서 생물 발광 신호의 검출에 매우 중요한 기판 엘렌 테라, 더 나은 접근성과 직접 상호 작용을 허용 Vande 벨데 등. (18)의 연구에서, 우리는 C.에서 생물 발광 신호를 수행 할 수 있었다 알비 칸스 (Candida albicans)는 외국 ì에서 개발 생물막 (biofilm)체외에서 GN 몸. BLI 신호 강도가 강하게 즉 추가적인 생물막 정량화 기법, CFUs 판별 및 환원 XTT 분석에서 얻어진 데이터에 대응. 이러한 결과 옆에, 우리는 생체 내 바이오 필름의 생물 발광 신호가 외식 생물막에서 복구 바이오 필름 관련 세포의 크기와 일치였다. 또한 Vande 벨데 등. 18 BLI는 C. 의해서도 야생형 생물막에 의해 발전을 수행하고 사용할 수 있음을 입증 동시에 같은 동물 알비 bcr1Δ / bcr1Δ (생물막 결손 균주). 이러한 발견은 강하게 동일한 동물에 생물막 개발 및 감염 시간 경과를 평가 연구에 전념 BLI 동안의 사용을 지원한다.
이것과, 우리는 후속 모니터링 오와 칸디다 -infected 장치의 생체 내 피하 임플란트에 대한 실험 절차를 설명BLI에 의해 F 생체 바이오 필름 개발. 함께 찍은, BLI은 우리가 데이터 분석의 각 시점에서 동물의 희생을 피할 시간이 지남에 감염을 수행 할 수있는, 신뢰할 수있는 기술로 보여 주었다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
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