Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Candida Albicans биопленки развития на медицинской актуальных инородных тел в мышиной подкожной модели с последующим биолюминесценции изображений

Published: January 27, 2015 doi: 10.3791/52239
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology, Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven, 2Biomedical MRI Unit/ MoSAIC, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven

Abstract

Candida развитие Albicans биопленки на биотических и / или абиотических поверхностях представляет определенную угрозу для госпитализированных пациентов. До сих пор, C. альбиканс биопленки были изучены преимущественно в пробирке, но есть острая потребность для лучшего понимания этого динамичного процесса в условиях естественных. Мы разработали подкожный крысиной модели в естественных условиях для изучения С формирование Albicans биопленки. В нашей модели множественного (до 9) Candida -infected устройства имплантируют в задней части животного. Это дает нам большое преимущество над центральным венозным катетером модельной системы, так как позволяет нам изучать несколько независимых биопленки в одном животного. В последнее время мы адаптировали эту модель для изучения С развитие биопленки Albicans в BALB / C мышей. В этой модели, зрелые С альбиканс биопленки развиваются в течение 48 ч и демонстрируют типичное трехмерное архитектуры биопленки. Количественное грибковой биопленкитрадиционно анализируются после смерти и требует хоста жертвы. Поскольку это требует использования многих животных для выполнения кинетических исследований, мы использовали неинвазивный биолюминесценции изображений (BLI), чтобы следовать в продольном направлении в естественных условиях зрелых С Albicans биопленки развития в нашей подкожной модели. С альбиканс клетки, сконструированные для экспрессии гена принцепс люциферазы Gaussia (Gluc), прикрепленный к клеточной стенке. Сигнал биолюминесценции получают путем люциферазы, который преобразует дополнительное подложки коэлентеразина в свет, который может быть измерен. Сигнал BLI напоминал количества клеток, полученных из эксплантированных катетеров. Неинвазивная визуализация для количественной оценки в формировании естественных биопленки обеспечивает немедленную приложения для скрининга и подтверждения противогрибковых препаратов в условиях естественных условиях, а также для исследований, основанных на хозяин-патоген взаимодействий, настоящим способствует лучше понятьчисле патогенеза катетер ассоциированных инфекций.

Introduction

Candida Albicans является синантропных организма, которые могут быть найдены в различных местах здоровых лиц, например на кожу или в виде части желудочно-кишечного тракта и вагинальной флоры. Тем не менее, в больницу, и особенно у пациентов с иммунодефицитом, это может привести к широкий спектр инфекций 1. В таких лиц, ослабленная иммунная система позволяет Candida клеток для распространения в кровоток и вторгнуться глубокие ткани, вызывая угрожающих жизни инфекций. Кроме того, присутствие абиотических субстратов, таких как центрального венозного и мочевых катетеров, искусственных клапанов сердца и суставов могут служить ниши для крепления Candida 2. Адгезия к таким субстратов является необходимым условием для дальнейшего развития биопленки, которая представляет собой слой дрожжей и гиф клеток, встроенных в внеклеточной полимерного материала, в основном состоящий из полисахаридов 2. C. альбиканс катетер -associated инфекциисвязаны с высокой смертностью. Общая характеристика биопленки является их снижения чувствительности к известным противогрибковые препараты, такие как азолов 3,4. Только новые классы противогрибковых препаратов, таких как эхинокандинов и липосомальной композиции амфотерицина оказался активным против катетер-ассоциированной инфекции 5-7. Из-за биопленки устойчивости к противогрибковые препараты, лечебные подходы являются весьма ограниченными, что часто приводит к удалению катетера и его последующей заменой в качестве единственного решения.

Большинство нашего нынешнего понимания С. развитие Albicans биопленки происходит от в пробирке исследования на абиотических субстратов, таких как полистирол или пластмасс, используемых для изготовления вышеуказанных устройств, т.е., силикона, полиуретана 2. Эти модели являются весьма прогрессивным и попытаться имитировать ситуацию в естественных условиях, насколько это возможно. Тем не менее, эти системы не связаны с непрерывным потоком крови и тон иммунная система хозяина. Это привело к разработке систем в естественных условиях модели, такие как центральный венозный катетер (CVC) модели 8-10 протеза стоматита модели кандидоза полости рта 11 и мышиной модели для катетер-ассоциированной кандидурия 12. Кроме того, С. Развитие Albicans биопленки изучали на крысах на поверхности слизистых оболочек, таких как те, из влагалища 13 и полости рта 14. Наша лаборатория вклад с созданием подкожного С Albicans биопленки модель, которая основана на имплантат зараженных катетер частей на задней Sprague Dawley крыс 15. Эта модель была успешно использована в нашей лаборатории, чтобы проверить биопленки восприимчивость к флуконазолу и эхинокандин наркотики 5,16, для изучения влияния комбинаторной терапии диклофенака и каспофунгином 17. Совсем недавно мы адаптированы этой системы для использования в линии BALB / C мышей 18,19. Впо сравнению с другими в моделях естественных условиях, главным преимуществом этого подкожной модели возможность учиться несколько биопленки на одно животное, разработанной внутри просвета имплантированных катетер штук.

Чтобы уменьшить количество лабораторных животных, мы адаптировали эту модель для изучения развития C. Albicans биопленки неинвазивным путем использования биолюминесценции томография (BLI) 18,19. Этот метод оказался мощный метод, который может быть использован для количественного биопленки путем измерения определенный сигнал BLI в интересующей области (в нашем случае площадь имплантированных катетеров), избегая жертву животных. По сравнению с бактериями, которое можно выразить как ген и подложки, необходимое для проведения реакции биолюминесценции в связи с введением определенного лк оперона 20 большинство из эукариотических организмов, в том числе С Albicans, зависит от гетерологичной экспрессии гена люциферазы в сочетании сВнешний введение специфического субстрата, такого как D-люциферин или коэлентеразина 21. Возможно из-за присутствия грибковых клеточной стенки и С. Albicans морфогенез, внутриклеточной доставки субстрата для фермента люциферазы был основной проблемой 21. Для того чтобы решить эту проблему, Enjalbert др. 22 инженерии штамм, где синтетический С. Albicans кодон-оптимизированная версия гена естественно, выделяемой Gaussia принцепса люциферазы (Gluc) был присоединен к к С. Ген Albicans PGA59, GPI- якорь белок клеточной стенки. Из-за присутствия люциферазы в клеточных стенок, проблемы, связанные с внутриклеточной доступности субстрата можно было бы избежать. Это особая система была использована для изучения поверхностных инфекций, вызванных C. Albicans 22. Совсем недавно, BLI был также использован, чтобы следовать прогрессирование орофарингеального кандидоза и его possiblе лечение 23. Такие выводы поддерживают использование BLI как перспективный метод для изучения инфекций, вызванных свободно живущих клеток, но также устройств, ассоциированных инфекций.

В этом исследовании мы описываем С развитие биопленки Albicans на полиуретановой катетер штук в линии BALB / C мышей и ее количественного описания с использованием BLI. Мы предлагаем подробный протокол колонизации в пробирке полиуретановых катетеров в период адгезии с последующим имплантации у мышей и последующего развития биопленки в живых животных. Помимо измерения сигнала BLI излучаемого С альбиканс клетки мы также определить колониеобразующих единиц для сравнения со стандартным техники для нагрузки количественной биопленки грибковой,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты на животных были одобрены этическим комитетом КУ Левен (код проекта 090/2013). Поддержание животных в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными KU Leuven.

1. C. Albicans роста

  1. Через двадцать четыре часа до начала эксперимента животных, готовят YPD пластины путем добавления 10 г дрожжевого экстракта гранулируют, 20 г бактериологического пептона и 15 г гранулированного агара. Макияж объем до 900 мл с Milli-Q воды и автоклава.
  2. Добавить 50 мл стерильного 40% раствора глюкозы. Тщательно перемешать и разлить в чашки Петри. Оставьте агаром для охлаждения и отверждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, использовать два штамма, а именно дикого типа C. Albicans SC5314 - Gluc отрицательной деформации (упоминается как WT) и C. Albicans SKCA23 штамм, который является дикого типа C. Albicans SC5314 трансформировали Clp10 :: Act1p-gLUC59 плазмиды 22 .В этом деформации (по имени SKCA23-CTgLuc) Gluc был слит с эндогенным геном PGA59 под управлением СИГН.1 (актина) промотора (этот промотор активен в дрожжах, а также этап гиф рост грибков). Этот штамм может быть запрошена из лаборатории профессора Патрика Ван Dijck, KU Leuven, Лёвен, Бельгия. Плазмиды Clp10 :: Act1p-gLUC59 плазмиды 22 был любезно пожертвовал проф С. d'Enfert, Институт Пастера, Париж, Франция.
  3. Поддержание обоих штаммов в глицерине складе и хранить при температуре -80 ° C.
  4. До всех штаммов эксперимент стрик на качестве YPD пластины. Инкубируют планшет при 37 ° С в течение ночи.

2. Катетер шт Приготовление

  1. Перед экспериментом определить, сколько необходимо катетеры. Это можно имплантировать до 6 штук в катетер мыши (3 катетеров слева и 3 катетер на правой стороне животных (фиг.2А).
  2. Двадцать четыре часа до операции животных, открыть упаковкувозраст, содержащий тройной люмен катетер под бокс биологической безопасности. Удалить все ненужные части с стерильных пинцетов и сократить часть, прикрепленную к катетеру стерильным скальпелем. Поместите линейку под пластиковой упаковке и сократить полиуретан катетер куски ровно 1 см по шкале на линейке (рис 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что этот тип катетера кусок не фосфоресцирующие и поэтому подходит для BLI 18,19.
  3. Поместите максимум 15 вырезать катетер штук (шагом. 2,2) в 2 мл микропробирок. Всегда готовьте 3 штук дополнительных, которые используются для перечисления количество присоединенных клеток Candida на устройстве после периода адгезии.
  4. Дополнение катетеров с приблизительно 1,8 мл 100% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  5. Энергично вихрь и добавить дополнительные 100-200 мкл 100% FBS. Полностью охватить все катетер части с сывороткой.
  6. Инкубируют при 37 ° С в течение ночи.

    3. Животные и подавление иммунной системы

    1. Держите женский BALB / C мышей (примерно 8-недельного возраста) в отдельности вентилируемых фильтров верхних клетках с бесплатным доступом к стандартной пищи и воды вволю.
    2. Инициирование подавление иммунной системы 24 часа до хирургического вмешательства животных путем добавления дексаметазона (0,4 мг / л) в питьевой воде животных. Для того, чтобы избежать какого-либо бактериального заражения хозяина, в дополнение к питьевой воде с антибиотиком, например, порошок ампициллина натрия (0,5 г / л).
    3. Держите иммуносупрессии животных в течение всего эксперимента (до 6 дней).

    4. Экс естественных C. Albicans Сцепление на FBS-полиуретановым покрытием Поверхности

    1. Передача каждого сыворотки покрытием катетера часть в свежем 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
    2. Очистите от некоторых C. альбиканс клетки, выращенные на YPD пластин (шаг 1) и приостановить их в 1 мл PBS.
    3. Развести МожетDida клетки (1: 100) в отдельном микроцентрифужных трубки. Возьмите 10 мкл разведенного образца и применить его на счетной ячейки камеры. Граф по меньшей мере 16 маленьких квадратов.
    4. Подготовка Candida клетки каждого штамма (отдельно) в RPMI 1640 среде до конечной концентрации 5 х 10 4 клеток / мл.
    5. Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждую сыворотки покрытием катетера части.
    6. Энергично вихрь и убедитесь, что катетеры погружены в среду, и не плавающие на поверхности.
    7. Выдержите катетеров при 37 ° С в течение 90 мин (период адгезии).
    8. Удалить катетеров стерильных пинцетов и промойте их в два раза с 1 мл PBS. На этом этапе убедитесь, что промывочная жидкость проходит через просвет, сохраняя катетер в вертикальном положении, а очень аккуратно промывки катетеров. Главное, не использовать сильный поток, который может привести к удалению прикрепленных клеток.
    9. Передача каждого промывают катетер на чистую пробирку микроцентрифужных (одна часть по ТУбыть).
    10. Поместите на льду и держать там, пока хирургии.

    5. Анестезия

    1. Подготовка анестезии путем смешивания 75 мкл кетамина (100 мг / мл) при 100 мкл медетомидина (1 мг / мл) и 825 мкл стерильного физиологического раствора. Администрирование внутрибрюшинно (IP) 60-80 мкл анестетика коктейль на 10 г веса тела, в результате чего в дозе 45-60 мг / кг кетамина и 0,6-0,8 мг / кг медетомидина.
    2. Для разворота анестезии, разбавленной 50 мкл Атипамезол (5 мг / мл) в 4,95 мл физиологического раствора, вводить внутрибрюшинно 100 мкл на 10 г веса тела, как антидот, в результате чего в дозе 0,5 мг / кг.
    3. После введения наркоза, поместите животное в отдельной клетке и подождите, пока он полностью не спят.
    4. Подтвердите надлежащего обезболивания животного светом кожной складки и ног крайнем случае, которые не причиняют никакого вреда для кожи. Любое наблюдаемое движение указывает, что животное не в достаточной степени анестезии, чтобы выполнить операцию. Если это произойдет, подождите корPLE минут дольше, пока животное не показывает никаких признаков движения на кожу, или ноги крайнем случае.

    6. Животное Хирургия

    1. Передача под наркозом животное из клетки на чистой ткани, размещенной на грелку, предварительно нагревают до 37 ° C (фиг.2А, (1)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: дешевая альтернатива заключается в использовании электроподогревом одеяла. Кроме того, можно использовать изотермические колодки, которые должны быть нагреты в микроволновой печи до операции животных.
    2. Применение глазной мази на глазах.
    3. Бритье нижней части спины животного с электрической бритвой. Удалить все волоски животных и передать животное на чистой ткани. Лечить кожу (например, 1% йода изопропанол или 0,5% раствором хлоргексидина в 70% -ном спирте), и оставить вылеченный область высохнуть в течение примерно 1 мин (рис 2А, (2)).
    4. Сделать небольшой разрез в коже (один слева и один с правой стороны животного) (примерно 0,5 &# 8211; 1 см) (фиг.2А, (3)).
    5. Проанализируйте подкожном слое с ножницами, чтобы создать два подкожные тоннели. Каждый туннель должен быть примерно 1,5 см в длину и 1 см в ширину.
    6. Вставьте три катетера штук, ранее инфицированных Candida, в каждом туннеле. Убедитесь, что катетеры расположены рядом друг с другом в горизонтальном расположении и что они не перекрывают друг друга, чтобы дать возможность имплантации шести фрагментов катетера в общем (фиг.2А, (4)).
    7. Закрыть разрезы со швами. Кроме того, использование DERMABOND, чтобы закрыть рану.
    8. Лечить раны очень мягко с 0,5% хлоргексидина в 70% -ном спирте или йода изопропанола (1%).
    9. Применение местной анестезии (Xylocaine гель, 2%), непосредственно на рану.
    10. Администрирование вспять анестезии (протокол 5, шаг 2): внутрибрюшинно 100 мкл на 10 г веса тела.
    11. Передача животных в чистую клетку ранее размещенных на нагревательной пластине. Держите животноеотдельный и теплый, пока животное не полностью проснулся. Между тем, по-прежнему в эксплуатации и имплантата следующего животного. После того, как все оперированных животных полностью проснулся. Трансфер в одной клетке. Монитор животных регулярно.

    7. Биолюминесценция изображения: Подготовка коэлентеразина (ЧТЗ), основания для G. принцепс люциферазы

    1. Подготовка свежий коэлентеразин (ЧТЗ) маточного раствора путем растворения 5 мг / мл ЧТЗ в подкисленной этанола или в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Подготовьте 1,2 рабочего раствора мМ разбавлением исходного раствора соотношении 1:10 стерильным PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите 100 мкл ЧТЗ рабочих растворов подкожно в районе, прилегающем к катетеров. Используйте инсулиновые шприцы для подкожного введения ЧТЗ.
    3. Всегда держите ЧТЗ в темном (например, покрытие микроцентрифужных пробирки, содержащие ЧТЗ с алюминиевой фольгой), Хранить исходный раствор при -80 ° С в течение всего срока эксперимента.
      4. 8. Биолюминесценция изображений

      1. Инициализировать камеру BLI.
      2. Обезболить животных с использованием индукционной окно. Использовать газовую смесь, содержащую изофлуран в кислороде, N 2 O / O 2 или воздуха при 2-3%.
      3. После индукции, поддержания анестезии в индукционной поле и в камере формирования изображения на 1,5-2%.
      4. Перед началом сеанса формирования изображения, поместить изображения пластину в положение А, что соответствует в поле зрения 10 см. Убедитесь, что в правой позиции анестезии точек и животного путем размещения спящего животного в коробке.
      5. Возьмем несколько фотографий, пока животное не в нужном положении формирования изображения, в поле зрения прямо под камерой.
      6. Приготовьте два инсулиновые шприцы каждый содержащий 100 мкл рабочего раствора ЧТЗ.
      7. Поместите одно животное на скамейке и держать его спящим с помощью носового конуса, обеспечивающих газа анестезии.
      8. Принесите иглы шприцев в месте вокруг катетеры подкожно и придатьCTZ одновременно на верхней части катетера.
      9. Сразу же после инъекции, поместите животное на теплой плите в поле камеры и запустить сканирование биолюминесценции изображения.
      10. Приобретение последовательных сканирований с Время сбора данных в пределах от 20 до 60 сек (в зависимости от интенсивности сигнала) до тех пор, максимальная интенсивность сигнала не будет достигнута. При приобретении следующего кадра, измерять интенсивность BLI сигнала ранее приобретенных кадров путем размещения ROI по каждому катетеров трио и измерения потока фотонов через эту ROI.
      11. Повтор со стадии 7 в следующем животного (ов).
      12. После обработки изображений, вернуться животных в клетку. Повторите BLI в ходе эксперимента по продольной неинвазивного наблюдения образования биопленки.
      13. Анализ данных BLI использования живых ПО Image. Поместите прямоугольную ROI фиксированного размера за каждый катетера трио и измерить поток фотонов (сияние) через каждый ROI. Повторите эту процедуру для каждого животного.
      14. ОтчетИнтенсивность сигнала BLI каждого катетера Трио потока фотонов в секунду. Представлять данные BLI по логарифмической шкале, откладывая среднюю и SD потока фотонов в секунду для каждой группы. Выполните статистический анализ преобразованных данных журнала 10.

      9. Катетер эксплантата

      1. Подготовка микроцентрифужных пробирки, содержащие 1 мл PBS, по одной для каждого катетера устройства и сохранять их на льду.
      2. Эвтаназии животных путем смещени шейных позвонков (фиг.2В, (1)).
      3. Лечить кожу спины с 0,5% хлоргексидина в 70% -ном спирте или йодом изопропанола (1%).
      4. Сделайте надрез (примерно 3 см) над катетеров.
      5. Сокращение подкожной ткани и удалить фрагментов катетера по одному из-под подкожной ткани с помощью пинцета стерильные (фиг.2В, (2)),
      6. Ручка катетер осторожно в вертикальном положении и промойте его в два раза с 1 мл стерильной PBS. Место каждого катетерачасть в отдельном микроцентрифужных трубки (полученного на стадии 1).

      10. Количественная оценка биопленки, связанные ячейки путем колониеобразующих единиц графа (КОЕ) и статистического анализа результатов

      1. Соникатные катетеры, ранее помещенных в 1 мл PBS в течение 10 мин при 40000 Гц на водяной бане ультразвуком и поместите их на лед.
      2. После обработки ультразвуком, энергично вихрь в течение 30 сек и место снова на льду.
      3. Приготовьте два дополнительных микроцентрифужных пробирки, содержащие 900 мкл PBS.
      4. Сделать 1:10 и 1: 100 разведения от вашего исходного образца (тот, который содержит катетер) и соблюдать все микроцентрифужных пробирок на льду.
      5. Пластина 100 мкл исходных образцов, 1:10 и один: 100 разбавлени на YPD агаровые пластины в дубликате.
      6. Планшеты инкубируют в течение 2 дней при 37 ° С и рассчитывать КОЕ.
      7. Граф колоний, выросших на YPD чашки с агаром (счетное количество колоний, максимальная 300 колоний / пластин) и умножьте их на должном diluКоэффициент ния (1x-оригинал, 10x или разбавление 100x). Кроме того умножить каждый кусок катетера по 10x, что соответствует конечного количества колоний в 1 мл пробирку, содержащую катетер. Принесите окончательную сумму колоний войти 10 клеток / катетера кусок со стандартным отклонением (SD). Экспресс данные в виде среднего ± SD.
      8. Поместите все значения для каждого катетера и конкретной группы в таблицу и / или статистической программы, для выполнения указанных выше расчетов и статистического анализа. Укажите конкретные группы для сравнения, т.е. WT против мутанта или 2 дней против. 6 дней образования биопленки и выполнять непарный т-тест и дисперсионный анализ с Тьюки после испытания на данных log10-преобразованы.
        1. Экспресс уровень значимости по значению р. В этом исследовании показывают значение, если значение р <0,05, представлены следующим образом: * р <0,05, ** р <0,005, *** р <0,0005.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом исследовании, мы показываем хирургическую процедуру катетера имплантата и эксплантата во время в естественных условиях C. Разработка Albicans биопленки у мыши. Кроме того, мы показываем количественную зрелых биопленок не только по классической КОЕ перечисления, но и BLI.

Как показано на фиг.1А, не фосфоресцирующие полиуретана катетер частей разрезали на 1 см, а затем устройств покрывают сывороткой. Этот шаг очень важен, поскольку он позволяет Candida клеткам прикрепляться к субстрату быстрее, по сравнению с покрытием имплантатов без сыворотки 15. Важно отметить, что до какой-либо С Albicans эксперимент мы впервые зафиксировали фонового свечения наших устройств 18. Этот шаг является решающим перед выполнением любой BLI, потому что высокая фосфоресценции устройства будет вмешиваться в оценки конкретных интенсивности биолюминесценции сигнала и сигнала кинетики от gLuc-экспрессирующих клеток. Далее, C. Albicans клетки инкубировали с сывороткой покрытием катетер части. Катетер фрагменты затем имплантируют на задней части животного после подкожного надреза (фиг.2А). В этом ин виво, созданной, две насечки выполняются (один справа и еще один на левой стороне задней части мыши) с последующим образованием подкожных туннелей внутри каждого разреза (2А (3)), Впоследствии три устройства, ранее инфицированных клеток Candida, имплантируют в каждом месте эксплуатации (фиг.2А (3 и 4)). Этот комплекс мер позволяет изучать до шести биопленок на животное. Следует отметить, что два операционных сайты предоставляют возможность изучать образования биопленки на двух различных штаммов интерес, например, дикого типа и мутанта в то же животного. 2В показывает рану, содержащий катетеров до эксплантов устройства и последующих стадий промывки.Биопленки, разработанные внутри задней части животного оценивали для измерения биолюминесценции сигнала. Один из представительных животных, отображающих сигнал биолюминесценции вместе с прямоугольниками, характеризующих области интереса (трансформирования) показана на фиг.3. После последнего BLI момент времени, катетеры эксплантировали, обрабатывали ультразвуком и затем перемешивали и далее оценивали для формирования биопленки клеток количественного определения КОЕ. Анализ данных, свидетельствующих Войти 10 КОЕ, полученные от каждого катетера на участке после развития биопленки и эксплантация показаны на рис 4А. Наряду с этим, КОЕ были по сравнению с интенсивностью сигнала BLI и эти данные показаны на фиг.4В. Девяносто минут после имплантации четкий сигнал BLI производится ACTgLuc экспрессирующие биопленки тогда как у дикого типа, свет практически не производится; Интенсивность света, обнаруживается из экспрессирующие ACTgLucбиопленки значительно возрастает как биопленка образуется, здесь в том же мыши (рис 4в), Это увеличение в свете следует той же тенденции, как увеличение КОЕ в биопленки (рис 4а). В наших экспериментах мы наблюдали, что нормальное штамма дикого типа (не сконструированные для экспрессии люциферазы) также приводит к получению света при добавлении субстрата. Тем не менее, поток фотонов был значительно ниже, чем полученный в инженерии штамма.

Взятые вместе, наши данные показывают, что BLI является мощным средством для контроля и количественной оценки в естественных условиях зрелой С. формирование биопленки Albicans в подкожной модели мыши.

Рисунок 1
Рисунок 1: Получение полиуретана устройств полиуретан часть катетера нарезать 1 см кусочки.. Пластиковые PoCКетский содержащий катетер открыт под стерильных условиях и все части, за исключением того, катетер удален из пакета. Во-вторых, место правителя под пластиковой кармане и сократить ровно 1 см полиуретановые штук. Такие устройства затем распределяется микропробирок (макс 15 частей / трубка) и погружают в 100% фетальной бычьей сыворотки с последующим инкубированием в течение ночи при 37 ° С.

Фиг.2
Рисунок 2: Основные шаги в процессе операции на животных. () Процедура катетера имплантата. (1) Место под наркозом животное в теплый площадку, содержащей бумажную салфетку и нанесите глазной мази на глазах. (2) Бритье нижнюю часть спины и дезинфекции. (3) Создать два небольших (прибл. 0,5 см) разрезы через кожу на левой и на правой стороне задней части. Создать подкожного туннеля внутри каждого разреза и место 3 катетеры внутри. (4) Закройте горе унд со швами и место животного на теплой подушки для восстановления. (B) Процедура удаления катетера. (1) Место в жертву животное на площадку и дезинфекции управляемые боковые содержащий катетеров. Вырезать рану прямо над катетеров. (2) Выньте каждый катетер мягко и дважды промывали 1 мл PBS. Место для отдельной трубки микроцентрифужных.

Рисунок 3
Рисунок 3:. Измерение биолюминесценции сигнала В естественных условиях BLI изображения с одного репрезентативного мыши отображены после 6 дней развития биопленки. Количественная оценка интенсивности сигнала осуществляется путем размещения области интереса (ROI) (прямоугольник) вокруг катетеров с последующим измерением потока фотонов в секунду через каждый ROI.

fig4highres.jpg "/>
Рисунок 4: Количественная зрелых Candida Albicans биопленки колониеобразующих единиц (КОЕ) и BLI. () В естественных условиях зрелой С. Albicans SKCA23- ACTgLuc и SC5314 (WT) биопленки количественное от Log10 КОЕ после 90 мин, 2 дней и 6 дней развития биопленки. (В) Биолюминесценция сигнал интенсивности количественное от биопленок в естественных условиях, образованных SKCA23- ACTgLuc и С Albicans WT. Сигнал был определен после 90 мин (период адгезии), 2 дня и 6 дней развития биопленки. В качестве контроля использовали мышей, которые были имплантированы с не-колонизировали катетеров и подкожную инъекцию CTZ. Поток фотонов, полученные в этих мышей приводит в нашем фонового сигнала (BG). Данные выражали в виде среднего ± стандартное отклонение (SD). Статистическая значимость указывается следующим образом: * р <0,05, ** р <0,005, *** р <0,0005. В естественных условиях биолюминесценции изображения из одной репрезентативной мыши, которые были имплантированы с катетером фрагментов, содержащих дикого типа C. альбиканс клетки с левой стороны и ACTgLuc экспрессирующие клетки с правой стороны. Мышь была отображена в трех различных периодов времени, т.е. 90 мин, 2 дней и 6 дней после имплантации фрагментов катетера.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование моделей животных, и особенно грызунов моделей, для исследования, посвященные микробных биопленок очень важно, так как иммунная система хозяина является существенным фактором в формировании биопленки, что модели в пробирке не может объяснить. В этом исследовании мы описываем относительно простой подкожной С Albicans модель биопленки мышь, которая может быть легко принят в научно-исследовательской лаборатории и не требует серьезных технических навыков. Эта модель изначально была разработана для изучения формирования эпидермального стафилококка биопленки на крысах, 24.

В представленной модели, сыворотки покрытием из полиуретана катетеры заражали клетки Candida экс виво в период адгезии (90 мин, 37 ° С). Это первый шаг в пробирке можно рассматривать как ограничивающий фактор из-за отсутствия иммунной системы на самых первых этапах процесса биопленки инфекции. После адгезии и доКатетер имплантат, не устройств, связанные клетки удаляются промывкой. Как избежать стадии промывки после периода адгезии может создать неуправляемый количества клеток, связанных с устройством. По этой причине, мы предлагаем, чтобы вымыть катетеров до имплантата, и поэтому, чтобы начать свое развитие от прилипших клеток. После этого начального периода адгезии, катетеры содержат приблизительно 2,0-2,5 Войдите 10 КОЕ / устройство распространяться вместе с катетера 15. На этом этапе Candida образует зародышевые трубы, которые крепятся на основу.

Для того, чтобы походить на ситуацию в госпитализированных пациентов, которых иммунная система часто под угрозу, мы иммуносупрессии крыс в нашей подкожной модельной системе 15. Частичное нарушение функций иммунной системы крысы, до имплантата устройства и на протяжении всего периода развития биопленки, привело к увеличению воспроизводимости биопленки клеток, образующих, полученных изКатетеры имплантированные в том же хосте, а также от устройств, полученных из дополнительных животных. Из-за этих выводов мы предлагаем immunosuppress мышей до катетера имплантата, а также в период образования биопленки. Тем не менее, наши результаты показывают, что различия в иммунокомпетентных мышей значительно меньше по сравнению с наблюдаемым у крыс, что делает что мыши модельную систему также подходит для изучения роли иммунной системы хозяина на биопленок. В нашей исходной модели на крысах, а также в одной и той же модели в переводе с мышами, пожилые С Albicans биопленки развиваться в 48 ч продемонстрировано аналогичным количеством КОЕ биопленки и архитектуры между 2 и 6 дней 15,18,19.

Подкожной модель биопленки была успешно использована следить за развитием биопленки нескольких мутантов 15. Было показано, ранее Нобиле др. 25, что С. Albicans bcr1 Δ / bcr1 Δ не удалосьобразованию биопленок в центральный венозный катетер (CVC) модели. Этот штамм отображается элементарные функции биопленки в нашем подкожной модели, указывающей на то, что фенотипические изменения, обнаруженные в модели CVC может быть воспроизведен в подкожной модели 15.

По сравнению с другими существующими моделями, т.е.., CVC модели или протез стоматит модель 8,9,11, подкожное модель позволяет следить за развитием биопленки в несколько частей катетера, полученных от одного животного, тем самым снижая количество животных, необходимых для биопленки исследований. Несмотря на эти преимущества, недостаток может быть отсутствие кровотока, что может привести к определенным лишением питательных веществ в биопленки. Таким образом, в перспективе питательных поставок и условий окружающей среды, подкожной модель больше связана с аппаратно-инфекций, связанных с разработанными на протезы суставов, голосовые протезы и кардиостимуляторами, чем те, сформированных на внутривенных катетеров. Что еще более важно,перевод крысы системы подкожной биопленки на мышей из этой модели на животных совместимы с BLI, что дополнительно снижает затраты и, самое главное, количество необходимых животных. Кроме того, перевод модели крысы мышам позволяет использовать трансгенных мышах для изучения факторов хостов, относящиеся к катетер-ассоциированной инфекции исследований.

Основное преимущество использования BLI количественно биопленки в живых животных заключается не только в неинвазивной характера этого метода, но и в его способности обеспечить динамическую информацию о развитии инфекции. В этом исследовании Gluc выражается в клеточной стенке С Albicans позволило лучше доступности и прямое взаимодействие с подложкой коэлентеразином, которые имеют решающее значение для выявления биолюминесцентной сигнала в естественных условиях. При исследовании Ванде Вельде и др. 18, мы были в состоянии следовать биолюминесцентного сигнала от С. Albicans биопленки разработан на foreiGN органы в пробирке. Интенсивность сигнала BLI сильно переписывался с данными, полученными из дополнительных методов биопленки количественного, т.е. КОЕ определения и XTT снижение анализа данных. Рядом с этими результатами мы показали, что биолюминесценции сигнал от естественных условиях биопленки в сходился с количеством биопленки, связанные клеток, выделенных из эксплантированных биопленок. Кроме того, Вандевельде др. 18 показали, что БЛИ могут быть использованы, чтобы следить за развитием биопленки от дикого типа, а также С Albicans bcr1Δ / bcr1Δ (биопленки-дефицитный штамм) в том же животном в то же время. Такие выводы решительно поддерживаем использование BLI в ходе исследования, посвященные оценке временной ход развития биопленки и инфекции в тех же животных.

При этом, мы описали экспериментальную процедуру в естественных условиях подкожного имплантата устройств Candida -infected с последующим мониторингом ОF в естественных условиях развитие биопленки BLI. Взятые вместе, BLI показали, что надежная техника, которая позволила нам следовать инфекции с течением времени избежать жертвоприношения животных в каждый момент времени из анализа данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) - this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
  2. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
  3. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  4. Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
  5. Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
  6. Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
  7. Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
  8. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  9. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  10. Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
  11. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  12. Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
  13. Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
  14. Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
  15. Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
  16. Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
  17. Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
  18. Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
  19. Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
  20. Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
  21. Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
  22. Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
  23. Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
  24. Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
  25. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).

Tags

Медицина выпуск 95, подкожной модель КОЕ Balb / C мышь изображений биолюминесценции, коэлентеразин
<em>Candida Albicans</em> биопленки развития на медицинской актуальных инородных тел в мышиной подкожной модели с последующим биолюминесценции изображений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kucharíková, S., Vande… More

Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter