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Biology

MRNA के क्षय दरों की माप में Published: December 13, 2014 doi: 10.3791/52240
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Baylor University

Summary

विशिष्ट mRNAs का स्थिर राज्य स्तर mRNA की संश्लेषण और क्षय की दर से निर्धारित होता है। जीनोम चौड़ा mRNA के क्षरण दर या विशिष्ट mRNAs का क्षय दरों mRNA के आधा जीवन के निर्धारण से मापा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल Saccharomyces cerevisiae में mRNA क्षय दरों की माप पर केंद्रित है।

Abstract

mRNA के स्थिर राज्य स्तर पर्यावरण की स्थिति पर निर्भर करता है। एक mRNA की स्थिर राज्य संचय के स्तर का विनियमन प्रोटीन की सही मात्रा में सेल के विशेष विकास की स्थिति के लिए संश्लेषित है कि यह सुनिश्चित करता है। MRNA के क्षय दर को मापने के लिए एक दृष्टिकोण प्रतिलेखन बाधा और बाद में पहले से ही मौजूद mRNA की लापता होने निगरानी कर रहा है। mRNA के क्षय की दर फिर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, और एक सटीक आधा जीवन कई तकनीकों का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। एस में cerevisiae, आधा जीवन विकसित किया गया है mRNA के उपाय और शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय, rpb1-1 के तापमान संवेदनशील एलील बंदरगाह कि उपभेदों का उपयोग कर mRNA की प्रतिलेखन बाधा शामिल है कि प्रोटोकॉल। एक regulatable प्रमोटर के नियंत्रण के तहत कर रहे हैं कि mRNAs का उपयोग करके आधा जीवन में इस तरह के वैकल्पिक रूप से thiolutin या 1,10-phenanthroline, या के रूप में ट्रांसक्रिप्शनल inhibitors के साथ प्रतिलेखन बाधा शामिल हैं mRNA के मापने के लिए अन्य तकनीकों,ऐसे गैलेक्टोस inducible प्रमोटर और TET बंद प्रणाली के रूप में। यहाँ, हम एस के माप का वर्णन शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील एलील का उपयोग कर cerevisiae mRNA के क्षय दरों। इस तकनीक को व्यक्तिगत mRNAs या जीनोम चौड़ा की mRNA के क्षय दर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

प्रतिलेखन और विशिष्ट mRNA की क्षय जीन अभिव्यक्ति की महत्वपूर्ण निर्धारक हैं। संश्लेषण और विशिष्ट mRNAs का क्षय की दर है कि विशेष रूप mRNA की स्थिर राज्य स्तर निर्धारित करता है। mRNAs का स्थिर राज्य स्तर mRNAs का बहुतायत सरकार और प्रोटीन संश्लेषण के लिए उपलब्ध है कितना प्रत्येक mRNA की निर्धारित करते हैं। MRNA के आधा जीवन की माप mRNAs का क्षय की दर निर्धारित करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल कर रहे हैं। MRNA, mRNA और पर्यावरण की स्थिति द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के समारोह की सुविधाओं से संबंधित हैं जो अलग-अलग दरों पर विशिष्ट mRNAs क्षय। MRNA के क्षय दरों का निर्धारण करने के लिए उपयोग की तकनीक पर निर्भर करता है, क्षय की दर माप या तो विश्व स्तर पर या व्यक्ति से टेप के लिए निर्धारित किया जा सकता है। खमीर एस में cerevisiae, सबसे अधिक वैश्विक mRNA के क्षय दर को मापने के लिए उपयोग किया जाता है तकनीक है कि शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय और रासायनिक transc के तापमान संवेदनशील एलील को शरण देने के एक खमीर तनाव के उपयोग में शामिलऐसे thiolutin और 1,10-phenanthroline 1-5 के रूप में riptional अवरोधकों। इन तरीकों में भी अलग-अलग mRNA के क्षय दरों चार को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है। अन्य तरीकों में भी mRNA के क्षय दर को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इन विधियों स्थिर राज्य लेबलिंग या केवल चुनिंदा परिस्थितियों में व्यक्त किया जाता है कि एक विनियमित प्रमोटर से व्यक्त कर रहे हैं कि mRNA के अणुओं का उपयोग करने के लिए दृष्टिकोण शामिल हैं। इन तकनीकों में से प्रत्येक कुछ फायदे और सीमाएं हैं। यहाँ वर्णित तकनीक शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील एलील का इस्तेमाल करता। इस विधि एस का उपयोग करता है cerevisiae मॉडल के रूप में, विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल निषेध तकनीकों 6 का उपयोग अन्य प्रणालियों में संशोधित और उपयोग किया गया सकते हैं, लेकिन।

शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील एलील का उपयोग कर mRNA के आधा जीवन माप बड़े पैमाने पर mRNA के क्षय 4-5 के दोनों जीनोम चौड़ा और व्यक्तिगत मापन के लिए उपयोग किया जाता है। इस तकनीक में एक विशिष्ट के उपयोग की आवश्यकताशाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय, rpb1-1 एक के तापमान संवेदनशील एलील बंदरगाहों कि आईसी खमीर तनाव। इस तकनीक के लिए तर्क nonpermissive तापमान तापमान संवेदनशील खमीर तनाव के जोखिम mRNA के संश्लेषण को रोकता है। प्रतिलेखन हिचकते किया गया है के बाद बाद में, preexisting mRNA की क्षय अलग समय बिंदुओं पर नजर रखी है। preexisting mRNA की लापता होने प्रतिलेखन बंद कर दिया गया है के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर खमीर कोशिकाओं से शाही सेना निकालने के द्वारा नजर रखी है। खमीर कोशिकाओं काटा जाता है, जिस पर समय बिंदुओं एक पायलट प्रयोग द्वारा पूर्व निर्धारित है, और टेप और सिस्टम की जांच की जा रही है पर निर्भर कर रहे हैं। अब समय बिंदुओं अब रहते थे टेप के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि तेज समय अंक, अल्पकालिक टेप के लिए उपयोग किया जाता है। बाद में, mRNA की क्षय या तो उत्तरी धब्बा विश्लेषण, मात्रात्मक पीसीआर या RNAseq द्वारा नजर रखी है।

एक ते का उपयोग कर mRNA के आधा जीवन का मापनशाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के mperature संवेदनशील एलील अपने फायदे हैं। सबसे पहले, इस तकनीक को सीधे आगे आसान और है। दूसरा, खमीर तनाव mRNA के आधा जीवन माप अलग विकास की स्थिति में निर्धारित किया जा सकता प्रयोगशाला में हासिल कर ली है या उत्पन्न होता है एक बार; mRNA के क्षय पर पर्यावरणीय प्रभाव का निर्धारण को सक्षम। तीसरा, mRNA के क्षय दरों जीनोम चौड़ा नजर रखी जा सकती है। अन्य प्रतिलेखन निषेध तकनीकों का उपयोग भी फायदे और सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, एक inducible प्रमोटर के उपयोग विनियमित प्रमोटर के नियंत्रण में है कि एक mRNA उत्पन्न करने के लिए subcloning की आवश्यकता है। Thiolutin आसानी से उपलब्ध नहीं है और जब महंगी उपलब्ध है। इसके अलावा, कार्रवाई की thiolutin के मोड पूरी तरह से समझ नहीं है और यह mRNA के क्षय सात बाधा सहित अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए सूचित कर दिया गया है। वैकल्पिक रूप से, 1,10-phenanthroline, अधिक आसानी से उपलब्ध है। इसके अलावा, तकनीक के सभी गुस्ताख़ सकते प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए इस्तेमाल कियासेलुलर समारोह URB और अलग तरीकों से अलग mRNAs को प्रभावित कर सकते हैं। एक अन्वेषक सबसे विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए अपने प्रयोगात्मक परिस्थितियों में उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त तरीका निर्धारित करने की जरूरत है। उनके आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त है जो विधि का निर्धारण करने के लिए, एक शोधकर्ता जांच की जा रही टेप द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के टेप और समारोह की पहचान करने की जरूरत है। सबसे विश्वसनीय mRNA के क्षय की दर माप कई तकनीकों का उपयोग करते हुए और एक ही क्षय की दर दिखाने निर्धारित कर रहे हैं कि उन लोगों के हैं। कोई भी तकनीक हमेशा सबसे अच्छा है, और सबसे उपयुक्त तकनीक विशिष्ट स्थिति पर निर्भर करता है।

एस में कई अध्ययनों cerevisiae विभिन्न स्थितियों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि में mRNA क्षय दरों मापा है। mRNA के क्षय दरों में मापा जाता है कि शर्तों के विशिष्ट प्रयोग की जांच की जा रही है पर निर्भर करते हैं। शर्तों जा रहा है कि क्या अलग सेलुलर वातावरण में mRNA क्षय दर को मापने निर्धारित करता हैअधिमान्यतया विशिष्ट mRNAs का क्षय दरों को प्रभावित की जांच की। mRNAs का क्षय दरों में भी इस्तेमाल किया जा रहा खमीर तनाव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, mRNA के क्षय दरों में एक nonfunctional बकवास की मध्यस्थता mRNA के क्षरण (एनएमडी) मार्ग के साथ जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं और खमीर कोशिकाओं में निर्धारित किया जा सकता है। इस mRNA गिरावट मार्ग अब तक की जांच की गई है कि सभी यूकेरियोटिक जीवों में पाया जाता है और यह समय से पहले ही अनुवाद 8 समाप्त कि mRNAs का क्षरण हो सके। एनएमडी शुरू में समयपूर्व समाप्ति codons या बकवास codons साथ mRNAs degrades कि एक मार्ग के रूप में पहचान की थी, लेकिन अब भी प्राकृतिक mRNAs युक्त गैर बकवास की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है कि एक मार्ग के रूप में मान्यता प्राप्त है। मार्ग का लक्ष्य कर रहे हैं कि mRNAs तेजी से एक कार्यात्मक एनएमडी मार्ग के साथ खमीर कोशिकाओं में अपमानित और एक nonfunctional एनएमडी मार्ग के साथ खमीर कोशिकाओं में स्थिर हो जाता है। इस प्रकार, इस मार्ग का सीधा लक्ष्य कर रहे हैं कि mRNAs का आधा जीवन जंगली प्रकार खमीर सेल में कम कर रहे हैंएक nonfunctional एनएमडी मार्ग के साथ खमीर कोशिकाओं की तुलना में रास।

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Protocol

खमीर कोशिकाओं के 1. ग्रोथ

  1. MRNA के क्षय की दर मापन के लिए उपयोग किया जा करने के लिए उपयुक्त खमीर उपभेदों का चयन करें। शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील एलील का उपयोग कर प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए, rpb1-1 उत्परिवर्तन एक को शरण देने खमीर उपभेदों का उपयोग करें। पहले ही कोई है कि एक प्रयोगशाला से इस खमीर तनाव प्राप्त, या एक विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि 9 की आवश्यकता है यदि मानक तकनीक का उपयोग कर प्रयोगशाला में इसे उत्पन्न करते हैं।
  2. मानक प्रक्रियाओं 10 का उपयोग खमीर मीडिया को तैयार, बाँझ तकनीक का उपयोग करना। कोई चयन की आवश्यकता है, इस तरह के YPD के रूप में अमीर मीडिया तैयार करते हैं। प्लास्मिड और चयन के साथ बदल रहे हैं खमीर कोशिकाओं की आवश्यकता है अगर वैकल्पिक, चयनात्मक मीडिया तैयार करते हैं। मीडिया आटोक्लेव।
  3. इस खमीर तनाव के लिए अनुमोदक तापमान है, जो 28 डिग्री सेल्सियस, पर खमीर कोशिकाओं को विकसित। दो चरणों में यह कार्य करें:
    1. पहली ओ के लिए / एन, संतृप्ति विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर में खमीर कोशिकाओं को विकसित।
    2. दूसरे दिन के अंत में दूसरी ओ / एन सेट करें। दूसरी ओ / एन के लिए, पहली ओ से / एन 100 μl से 1 मिलीलीटर, 2 मिलीलीटर या उससे अधिक को लेकर विकास मीडिया (के 100 से 150 मिलीलीटर में खमीर कोशिकाओं के विभिन्न मात्रा टीका लगाना, पर निर्भर करता है खमीर कोशिकाओं होने की जरूरत है जब ) अगले दिन काटा। संस्कृतियों में से एक सही 600 आयुध डिपो के अगले दिन पर है कि यह सुनिश्चित करने के लिए इस कदम है।

2. फसल खमीर कोशिकाओं

  1. खमीर कोशिकाओं फसल के लिए तैयार करें। इस कदम के लिए समय महत्वपूर्ण है; सभी आवश्यक ट्यूबों लेबल और एक ही स्थान में सभी आवश्यक उपकरण और सामग्री इकट्ठा होते हैं। 39 डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी के स्नान पहले से गरम और सी 28 डिग्री सेल्सियस और 60 डिग्री पर विकास मीडिया के दो 15 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब पहले से गरम।
    नोट: 15 मिलीलीटर विकास मीडिया मात्रा कोशिकाओं काटा जा रहे हैं समय बिंदुओं की संख्या के आधार पर अलग किया जा सकता है।
  2. वे 0.7 करने के लिए एक आयुध डिपो 0.4 से 600 तक पहुँच जब खमीर कोशिकाओं फसल। Transfएर से 4 कोशिकाओं - 50 6 बाँझ मिलीलीटर टोपी बोतलें पेंच। आरटी पर 5 मिनट के लिए एक उच्च गति अपकेंद्रित्र में 7500 XG पर अपकेंद्रित्र।
  3. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 28 डिग्री सेल्सियस पर equilibrating किया गया था कि 15 मिलीलीटर विकास मीडिया में छर्रों resuspend। एक बाँझ 250 मिलीलीटर फ्लास्क में खमीर कोशिकाओं पूल और 28 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि के तापमान पर ~ 5 मिनट के लिए उन्हें संतुलित करना।
  4. खमीर कोशिकाओं के विकास के तापमान पर equilibrated है, के बाद तुरंत 39 डिग्री सेल्सियस (nonpermissive तापमान) के तापमान को बढ़ाने के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर equilibrated विकास मीडिया के 15 मिलीलीटर जोड़ने और तुरंत 39 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कुप्पी जगह । संस्कृति के माध्यम कि प्रतिलेखन बंद कर दिया है सुनिश्चित करने के लिए शेष सेल कटाई कदम भर में 39 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रहता है कि सुनिश्चित करें।
  5. 39 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कुप्पी रखने के बाद अलग अलग समय पर कोशिकाओं फसल। पहली बार बिंदु के लिए, 39 & # पर कुप्पी रखने के बाद तुरंत कोशिकाओं फसल176, सी। 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब एक 3 मिलीलीटर विभाज्य फसल और दो में 3 मिलीलीटर वितरित। एक मिनी अपकेंद्रित्र में 10 सेकंड के लिए गोली कोशिकाओं या तेजी से मंदी के साथ picofuge और सतह पर तैरनेवाला उंडेल।
  6. इसके तत्काल बाद एक सूखी बर्फ / इथेनॉल स्नान में या तरल नाइट्रोजन में गोली फ्रीज। कोशिकाओं शून्य समय बिंदु के रूप में काटा जाता है पहली बार बिंदु निर्दिष्ट।
  7. प्रयोगात्मक ब्याज की mRNAs पर निर्भर करता है, एक पायलट प्रयोग द्वारा कोशिकाओं उसके बाद में काटा जाता है समय अंक निर्धारित करते हैं। आम तौर पर, निम्न समय बिंदुओं पर फसल खमीर कोशिकाओं: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 और 35 मिनट (चित्रा 2B)। MRNA के आधा जीवन से ऊपर उल्लेख किया है समय बिंदुओं का उपयोग करते हुए निर्धारित नहीं किया जा सकता है, तो इन समय बिंदुओं को समायोजित। उदाहरण के लिए, प्रत्याशित कम आधा जीवन के साथ mRNAs के लिए, कम समय अंक का उपयोग, (यानी, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 और 18 मिनट) और प्रत्याशित लंबे समय से आधा जीवन के साथ mRNAs के लिए, विस्तार समय अंक।
  8. कोशिकाओं के बाद हा रहे हैंशाही सेना निकासी बाहर किया जाता है जब तक rvested, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में उन्हें दुकान।

खमीर कोशिकाओं से 3. निकालें आरएनए

  1. प्रोटोकॉल की शाही सेना निकासी हिस्से के लिए, RNases द्वारा शाही सेना की गिरावट को रोकने के लिए RNase मुक्त तकनीक का उपयोग करें। RNase मुक्त समाधान, कांच के बने पदार्थ और प्लास्टिक के बर्तन शाही सेना की निकासी में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार।
  2. मानक प्रोटोकॉल के अनुसार खमीर कोशिकाओं से शाही सेना निकालें। आमतौर पर, गर्म फिनोल विधि 12 का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, खमीर कोशिकाओं से शाही सेना को निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि किट का उपयोग करें।
  3. सामान्य रूप से एक 260 पर absorbance और एक Nanodrop का उपयोग करते हुए शाही सेना के एक 280 दो के μl को मापने के द्वारा, शाही सेना की मात्रा और शुद्धता निर्धारित करते हैं। एकाग्रता के आधार पर 260 से शाही सेना की एकाग्रता का निर्धारण, एक माइक्रोग्राम प्रति शाही सेना को कमजोर / DEPC इलाज पानी का उपयोग कर μl।
    ध्यान दें: एक 260 का अनुपात / टी के बारे में जानकारी प्रदान करता है एक 280शाही सेना की वह पवित्रता। एक 260 / ए 280 का अनुपात 2.0 ± 0.1 है अगर एक शाही सेना नमूना शुद्ध है।

4. उत्तरी धब्बा विश्लेषण

नोट: mRNA स्तर यों और टेप के आकार के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए उत्तरी दाग ​​का प्रयोग करें। इसके अलावा, एक ही mRNA की कई isoforms कि उत्पादन mRNAs पता लगाने के लिए उत्तरी दाग ​​का उपयोग करें।

  1. एक 1.0% agarose-formaldehyde के जेल तैयार करें। मानक प्रोटोकॉल 12 के अनुसार वैद्युतकणसंचलन द्वारा agarose formaldehyde के जेल पर नमूना शाही सेना के बराबर मात्रा में चलाएँ। शाही सेना के नमूने के बगल में एक शाही सेना सीढ़ी चलाने के लिए और उत्तरी धब्बा पर पता चला रहे हैं कि शाही सेना के आकार का निर्धारण करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं। एक झिल्ली को agarose formaldehyde के जेल पर अलग शाही सेना के हस्तांतरण से पहले, जेल से शाही सेना सीढ़ी के साथ लेन में कटौती और ethidium ब्रोमाइड का उपयोग करते हुए कल्पना।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, पूरे जेल शाही सेना के हस्तांतरण से पहले ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग जा सकता है।
  2. एकfter शाही सेना के नमूने जेल पर एक उचित दूरी के लिए चले गए, RNase मुक्त तकनीक का उपयोग कर एक झिल्ली को शाही सेना के हस्तांतरण। झिल्ली 12-13 के लिए शाही सेना को हस्तांतरण करने के लिए उपलब्ध कई प्रोटोकॉल में से एक का उपयोग करें। एक झिल्ली को शाही सेना को हस्तांतरण करने के लिए, जेल के रूप में लगभग एक ही आकार के लिए झिल्ली में कटौती। मानक प्रोटोकॉल 12 के अनुसार शाही सेना स्थानांतरण।
  3. यूवी निर्माता के निर्देशों का पालन एक यूवी crosslinker का उपयोग कर झिल्ली को शाही सेना के पार से लिंक। वैकल्पिक रूप से, 1 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक ओवन में झिल्ली सेंकना। यह विशिष्ट जांच के लिए संकरित होने तक अनिश्चित काल के लिए एक प्लास्टिक की थैली में -20 डिग्री सेल्सियस पर झिल्ली स्टोर।
    नोट: सूखी झिल्ली भी फिल्टर कागजात के बीच आरटी पर संग्रहित किया जा सकता है।

5. संकरण जांच झिल्ली के लिए ब्याज की शाही सेना के लिए पूरक

नोट: झिल्ली पर mRNA के पता लगाने के लिए एक तरह से 32 पी लेबल डीएनए जांच संकरण करने के लिए है। चेतावनी: Resea32 पी के साथ काम कर rchers प्रदूषण को रोकने के लिए सुरक्षात्मक प्रक्रियाओं का उपयोग करने की जरूरत है। रेडियोधर्मी सामग्री के उपयोग पर संस्थागत दिशा निर्देशों का पालन करें।

  1. 25 लेबलिंग द्वारा डीएनए जांच को तैयार है - डीएनए के 50 एनजी मानक प्रोटोकॉल 12 के अनुसार झिल्ली को संकरित किया जाना है। पीसीआर या प्लाज्मिड पाचन द्वारा डीएनए टुकड़ा उत्पन्न करता है। अनिगमित न्यूक्लियोटाइड 12 को हटा रहे हैं के बाद radiolabelled डीएनए जांच के 1 μl गिनती द्वारा डीएनए जांच के विशिष्ट गतिविधि का निर्धारण।
  2. 42 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गरम prehybridization / संकरण बफर। झिल्ली 12 की 100 2 सेमी प्रति prehybridization / संकरण बफर के ~ 10 एमएल का प्रयोग करें।
  3. 1 संकरण - झिल्ली हे संकरण बफर के मिलीलीटर प्रति radiolabeled डीएनए जांच के 5 एक्स 10 6 सीपीएम / एक संकरण ओवन में एन ब्याज 12 की mRNA पता लगाने के लिए। संकरण के दौरान संकरण ओवन रोटेशन एक दिशा में है कि सुनिश्चित करें किपूरे झिल्ली उचित संकरण सुनिश्चित करने के लिए, संकरण समाधान के संपर्क में होने का कारण बनता।
  4. 2x SSPE के 50 मिलीग्राम और 15 मिनट के लिए 12 2x SSPE / 2% एसडीएस के 50 मिलीलीटर के साथ 65 डिग्री सेल्सियस से कम एक समय के साथ 15 मिनट के लिए आरटी पर झिल्ली दो बार धोएं। यह बाहर सूखी या फॉस्फर स्क्रीन को दूषित नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए प्लास्टिक की चादर में झिल्ली लपेटें।
  5. एक Geiger काउंटर का उपयोग करना, झिल्ली पर रेडियोधर्मिता की तीव्रता का अनुमान है।
    नोट: यह अनुमान झिल्ली समय की उचित राशि के लिए फॉस्फर स्क्रीन से अवगत कराया है कि यह सुनिश्चित करता है। रेडियोधर्मिता की कम मात्रा के साथ झिल्ली के लिए लंबे समय तक जोखिम बार प्रयोग करें।
  6. उत्तरी दाग ​​के लिए, शाही सेना के बराबर मात्रा में प्रत्येक स्थान पर लोड कर रहे हैं, इसकी पुष्टि के लिए एक लोडिंग नियंत्रण का उपयोग करें। ऐसा करने के लिए, झिल्ली पट्टी और प्रक्रिया की जांच की जा रही है से प्रभावित नहीं है कि एक शाही सेना के साथ यह reprobe। XS समाधान अलग करना (0.1% एसडीएस / 0.01 उबलते के 200 मिलीग्राम से युक्त एक गिलास ट्रे में रखकर झिल्ली पट्टी2 मिनट के लिए अनुसूचित जाति)। अलग करना समाधान बाहर डालो और प्रक्रिया पांच बार 12 दोहराएँ।
    नोट:। एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल एक शाही सेना का एक उदाहरण SCR1 है SCR1 स्थिर और प्रचुर मात्रा में है कि एक शाही सेना पोलीमरेज़ तृतीय प्रतिलेख है SCR1 शाही सेना बहुतायत शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय निषेध का संक्षिप्त अवधि के दौरान काफी बदल नहीं किया जाना चाहिए।।

6. झिल्ली के लिए बाध्य किया जाता है कि शाही सेना यों

नोट: झिल्ली पर रेडियोधर्मिता की राशि यों भास्वर एक स्क्रीन करने के लिए झिल्ली को बेनकाब करने के लिए। उचित जोखिम समय के बाद, एक phosphorimager का उपयोग कर फॉस्फर स्क्रीन स्कैन।

  1. Phosphorimager के निर्माता द्वारा दिए गए निर्देशों का उपयोग कर फॉस्फर स्क्रीन स्कैन करें।
  2. हर समय बिंदु पर mRNA के यों। ImageQuant सॉफ्टवेयर या संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर mRNA स्तर यों। लोड हो रहा है नियंत्रण करने के लिए हर समय बिंदु पर mRNA के मानक के अनुसार। SCR1 लोड हो रहा है के रूप में इस्तेमाल किया गया थानियंत्रण, SCR1 को आधा जीवन northerns मानक के अनुसार।
  3. mRNA की आधा जीवन समय बिंदु शून्य पर mRNA के वर्तमान की राशि से हर समय बिंदु पर शेष mRNA की राशि (प्रारंभिक समय बिंदु) विभाजित करके गणना की है। एक semilogarithmic साजिश (चित्रा -2) पर समय बनाम शेष प्रतिशत mRNA के ग्राफ। निम्न समीकरण द्वारा mRNA के आधा जीवन की गणना:
    टी 1/2 = -0.693 / कश्मीर (नकारात्मक 0.693)
  4. कश्मीर सबसे अच्छा फिट लाइन की ढलान है और टी 02/01 mRNA के आधा जीवन है।

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Representative Results

शाही सेना और उत्तरी सोख्ता निकालते समय सही रूप में mRNA के क्षय दर को मापने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता RNase मुक्त तकनीकों का प्रतिलेखन के निषेध, उचित समय बिंदुओं पर खमीर कोशिकाओं की कटाई, और उपयोग पर निर्भर करता है। क्रमशः, अस्थिर और स्थिर होने के लिए जाना जाता है दो नियंत्रण mRNAs के लिए जांच प्रयोग काम किया है कि आत्मविश्वास प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, यह और mRNA के पूर्व CYH2 दोनों का पता लगाता है कि एक जांच के साथ जांच कर रही द्वारा पूरा किया जा सकता mRNA के। चित्रा 2B प्रतिलेखन निषेध के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर जंगली प्रकार और एनएमडी उत्परिवर्ती खमीर उपभेदों में CYH2 पूर्व mRNA की लापता होने से पता चलता है । CYH2 पूर्व mRNA के एक nonfunctional एनएमडी मार्ग (upf1) के साथ खमीर कोशिकाओं के लिए एक कार्यात्मक एनएमडी मार्ग (UPF1) रिश्तेदार के साथ तेजी से खमीर कोशिकाओं में अपमानित किया जाता है।

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1. विधि फ़्लोचार्ट चित्रा। MRNA के क्षय की दर फ़्लोचार्ट के मापन

चित्रा 2
चित्रा 2. mRNA के CYH2 का आधा जीवन -pre mRNA के और mRNA। (ए) CYH2 पूर्व mRNA और CYH2 mRNA के। CYH2 पूर्व mRNA की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व निकम्मेपन से spliced ​​और यह एनएमडी द्वारा अपमानित किया जाता है, जहां कोशिका द्रव्य के लिए ले जाया जाता है मार्ग। यह समय से पहले समाप्ति कोडोन (पीटीसी) युक्त Intron का अभाव है क्योंकि CYH2 mRNA के एनएमडी मार्ग द्वारा अपमानित नहीं है। (बी) जंगली प्रकार (UPF1) और एनएमडी उत्परिवर्ती उपभेदों (upf1) से निकाले शाही सेना के आधे जीवन उत्तरी दाग। टीआरए के बाद समय बिंदुओंnscription निषेध उत्तरी दाग ​​ऊपर सूचीबद्ध हैं। दाग के साथ जांच कर रहे थे radiolabelled CYH2 डीएनए। (सी)% CYH2 पूर्व mRNA के जंगली प्रकार (UPF1) और एनएमडी उत्परिवर्ती उपभेदों (upf1) में समय बनाम शेष का ग्राफ। यह ग्राफ CYH2 पूर्व mRNA के एनएमडी उत्परिवर्ती खमीर उपभेदों (upf1) की तुलना में जंगली प्रकार (UPF1) में एक तेज दर से अपमानित किया जाता है कि पता चलता है।

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Discussion

MRNA के संश्लेषण और नई संश्लेषण के अभाव में mRNA कारोबार की निगरानी के निषेध अक्सर mRNA के क्षय दर को मापने के लिए किया जाता है कि एक विधि है। एस में cerevisiae, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील एलील का उपयोग कर प्रतिलेखन बाधा mRNA के क्षय दरों की माप के सबसे अक्सर इस्तेमाल किया तरीकों में से एक है। इस विधि को विशेष रूप से शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय रोकता। इस तकनीक का उपयोग mRNA के क्षय दरों के निर्धारण के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) खमीर कोशिकाओं कटाई करने से पहले, कि प्रतिलेखन 39 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को बनाए रखने के द्वारा बंद कर दिया गया है सुनिश्चित करना; 2) प्रोटोकॉल की शाही सेना निकासी और आरएनए जेल वैद्युतकणसंचलन चरणों के दौरान RNase मुक्त तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित; सामान्य बनाने प्रयोगात्मक उपचार की उम्मीद के रूप में काम कर रहे हैं कि भरी हुई थी आरएनए की है कि बराबर मात्रा सुनिश्चित करने के लिए और 3) एक नियंत्रण शाही सेना का उपयोग करें; 4) reproducibility के एक सुनिश्चित करने के लिए कम से कम तीन बार mRNA के क्षय की दर माप दोहरानेआधा जीवन माप के डी सटीकता।

rpb1-1 खमीर उपभेदों सामान्य रूप से प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। हालांकि, हम प्रतिलेखन के 37 डिग्री सेल्सियस निषेध पर तापमान पारी के बाद ~ 3 मिनट होता है कि मिल गया है। 39 डिग्री सेल्सियस प्रतिलेखन निषेध तत्काल है पर 4, 11। हालांकि, mRNA के क्षय दरों का निर्धारण करने के लिए इस तकनीक का उपयोग कुछ सीमाएँ हैं। प्राथमिक सीमा एक विशेष खमीर तनाव आवश्यक है। जैसा कि पहले कहा, यह खमीर तनाव या तो अन्य प्रयोगशालाओं से प्राप्त किया जा सकता है या एक विशिष्ट खमीर आनुवंशिक पृष्ठभूमि आवश्यक है, तो प्रयोगशाला में उत्पन्न। खमीर तनाव प्राप्त हो जाने के बाद इस तकनीक को सीधे आगे सरल और है। एक दूसरा सीमा विधि प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए सदमे गर्मी के लिए खमीर कोशिकाओं को प्रकाश में लाने पर जोर देता है। गर्मी तनाव विशेष mRNAs का क्षय दर सहित सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं। , उन mRNAs का क्षय दर था उदाहरण के लिएतनाव की प्रतिक्रिया में शामिल कर रहे हैं कि प्रोटीन के लिए टी सांकेतिक शब्दों में बदलना प्रभावित हो सकता है। अन्त में, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय में एक परिवर्तन के साथ एक खमीर तनाव के उपयोग के सामान्य टेप से अलग ढंग से व्यवहार कि वैकल्पिक टेप के उत्पादन में परिणाम कर सकते हैं।

शुरूआत में चर्चा की, अन्य तकनीकों एस में mRNA क्षय दर को मापने के लिए उपयोग किया जाता है cerevisiae। यह एक ऐसी thiolutin और 1-10-phenanthroline रूप में रसायनों का उपयोग ट्रांसक्रिप्शन का निषेध भी शामिल है। वे किसी भी खमीर तनाव का उपयोग किया जा सकता है और mRNA के क्षय की दर भी जीनोम चौड़ा या व्यक्तिगत अंतर्जात टेप के लिए निर्धारित किया जा सकता है कि इन तकनीकों में फायदेमंद हैं। इसके अलावा, mRNA के क्षय की दर माप विभिन्न शारीरिक स्थितियों में किया जा सकता है। इन दवाओं की उपयोगिता वे भी सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित और विभिन्न mRNA की क्षय दरों को प्रभावित कर सकते हैं कि इस तथ्य से सीमित है। इसके अतिरिक्त, thiolutin आसानी से उपलब्ध है और जब उपलब्ध नहीं हैमहंगा है।

इस तकनीक के माहिर के बाद एक व्यक्ति mRNAs या जीनोम चौड़ा की mRNA के क्षय दरों का निर्धारण करने में सक्षम हो जाएगा। इसके अलावा, mRNA के क्षय की दरें अलग स्थितियों के विभिन्न mRNA के क्षय दरों को प्रभावित है कि क्या जांच करने के लिए विभिन्न शारीरिक स्थितियों में मापा जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
High Speed Centrifuge Eppendorf 22628169
Mini Centrifuge Fisher Scientific 05-090-100
Genescreen Plus membrane PerkinElmer 50-905-0169
Hybridization Oven Fisher Scientific 95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer Thermo Scientific ND-8000
Phosphor screen GE Healthcare Life Sciences 28-9564-78
Typhoon phosphorimager GE Healthcare Life Sciences 29004080
UV cross-linker GE Healthcare Life Sciences 80-6222-31 Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer  Life Technologies AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 94, MRNA के क्षय mRNA स्थिरता बकवास की मध्यस्थता mRNA के क्षय mRNA के आधा जीवन प्रतिलेखन निषेध
MRNA के क्षय दरों की माप में<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; का प्रयोग<em&gt; Rpb1-1</em&gt; खींच
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Peccarelli, M., Kebaara, B. W.… More

Peccarelli, M., Kebaara, B. W. Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains. J. Vis. Exp. (94), e52240, doi:10.3791/52240 (2014).

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